胃食管反流病和急性胰腺炎的因果关联：孟德尔随机化研究

Causal Association between Gastroesophageal Reflux Disease and Acute Pancreatitis: A Mendelian Randomization Study

摘要: 目的：本研究采用了两样本孟德尔随机化(MR)方法系统地探讨了GERD与AP之间的潜在因果关系。方法：采用逆方差加权(IVW)方法，我们得出了因果推断。为了提高结果的稳健性，我们使用了一系列方法，包括孟德尔随机化多效性残差和异常值(MR-PRESSO)、简单模式、加权模式、加权中位数估计器(WME)和MR-Egger回归。结果：我们的分析确定了80个遗传变异，这些变异能够强烈预测GERD的发病，满足严格的标准(p值 < 5 × 10⁻⁸)并显示出独立性(r² < 0.01)。从IVW模型得出的因果效应估计表明，GERD与增加的AP风险之间存在统计学上显著的关联(95% CI = 1.402~2.029, OR = 1.6870, p = 2.940 × 10⁻⁸)。结论：总之，我们的MR探索提供了强有力的证据，支持GERD与AP之间存在因果关系，以及GERD和AP的多学科个体化治疗。

Abstract: Objective: This study systematically delves into the potential causal correlation between GERD and AP, employing the two-sample Mendelian randomization (MR) methodology. Methods: Employing the Inverse Variance Weighted (IVW) approach, we derived causal inferences. A suite of methodologies, including Mendelian Randomization Pleiotropy Residual Sum and Outlier (MR-PRESSO), Simple Mode, Weighted Mode, Weighted Median Estimator (WME), and MR-Egger regression, was utilized to increase the robustness of the results. Results: Our analysis identified 80 genetic variants robustly anticipating GERD onset, meeting stringent criteria (p-value < 5 × 10⁻⁸) and demonstrating independence (r² < 0.01). Causal-effect estimates derived from the IVW model indicate a statistically significant association, demonstrating GERD’s marked link to an augmented AP risk (95% CI = 1.402~2.029, OR = 1.6870, p = 2.940 × 10⁻⁸). Conclusion: In summation, our MR exploration yields robust evidence supporting the presence of a causal relationship between GERD and AP, as well as for multidisciplinary individualized treatment of GERD and AP.

1. 引言

胃食管反流病(GERD)是一种复杂的疾病，包括由胃内容物反流到食管中引起的各种综合征，可以通过症状、内窥镜检查或生理检查来检测，证实与反流相关的病理[1] [2]。胃食管反流是世界上最常见的疾病之一，影响着估计有20%的欧洲和美国成年人[3]。GERD与多种疾病相关，典型症状包括烧心、食管胸痛和反流，其中胸痛和烧心可能由运动障碍(例如，胰腺失弛缓症)和肠–脑相互作用失调(DGBI)机制的疾病引起[4] [5]。此外，GERD常表现为食管外症状，如非心源性胸痛、牙齿萌出、鼻窦炎和睡眠呼吸暂停[6]-[8]。值得注意的是，GERD与巴雷特食管(BE)有很强的关联，BE是独特的食管腺癌前体，特别是在年轻患者中，表现为晚期发病、生存期有限的癌症[9]-[11]。GERD及其食管外表现的高发病率常常导致显著的身体损伤，强调了因果识别相关表现或疾病的重要性，以改善预后和治疗。

急性胰腺炎(AP)是最常见的需要紧急干预的胰腺疾病，全球年发病率为0.034%，且随时间呈现上升趋势。大约15%~20%的严重AP成人患者会因此丧生[12]-[14]。AP的发病机制涉及腺泡细胞的损害，这些细胞是外分泌胰腺的基本组成部分，导致胰蛋白酶原的不及时激活和释放，引发一系列涉及补体级联反应、激肽系统和各种消化酶的事件。最终，这一级联反应导致胰腺实质的自体消化[15]。AP的管理和随访主要依赖于其病因，需要多学科和个性化的处理方法。确定疾病的根源对于制定有效的治疗策略和预测预后具有关键意义[12] [16]。发达国家已知的AP原因包括酗酒、胆结石、高甘油三酯以及其他特发性病因。然而，许多胰腺炎患者，特别是在成人中，表现出同时存在的胰腺外疾病和症状，包括炎症性肠病和胃食管反流病[17] [18]。此外，几项观察性研究提供了证据表明，GERD可能增加AP的风险[19] [20]。尽管如此，鉴于随机对照试验(RCTs)仅仅暗示GERD可能是AP的一个潜在易感因素，确立GERD与AP之间因果关系的明确证据仍然难以捉摸。

尽管研究表明GERD患者中急性胰腺炎AP的发病率较高，但其致病因素尚不确定，提出了几种可能的解释：(1) 一种疾病对另一种疾病的直接影响，即GERD在AP中的作用；(2) GERD和AP之间共享的病因和混杂变量；(3) 药物副作用；或(4) 观察性研究中的偏差，包括研究遗漏[21]。在咨询过程中，临床医生可能会无意中忽视因果相互作用，导致AP的最佳治疗延迟，并忽视GERD的诊断和治疗，可能会加剧病情。孟德尔随机化(MR)作为一种研究方法，模拟随机对照试验(RCTs)进行因果推断，利用遗传变异作为工具变量(IVs) [22]。其优势在于克服了RCTs的一个基本限制：无法估计混杂因素[23]。通过一项两样本MR研究，我们的目标是建立反流症状与AP之间的牢固相关性，从而为临床决策提供有价值的见解。

2. 数据来源与研究设计

2.1. 数据来源

本研究中的结果数据(AP)和暴露数据(GERD)是从两个不同的全基因组关联研究(GWAS)中获取的。这两个数据集均源自IEU研究，可以通过IEU开放GWAS计划方便地在https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/上检索。具体来说，GERD数据来源于一个全面的GWAS，该GWAS具有全面的GERD定义，如Ong等人[24]所规定，包括一个庞大的样本量，共602,604个样本，包括473,524个对照和129,080个病例。AP数据是从Sakaue等的汇总统计数据中提取的[25]，样本量为479,902人，包括3798病例和476,104对照。鉴于公共数据库中数据的开放性，研究人员无需额外的伦理批准，确保了信息可以迅速且无障碍地用于科学研究。

2.2. 研究设计

使用孟德尔随机化(MR)方法评估了胃食管反流病(GERD)对急性胰腺炎(AP)的因果影响。为了确保遗传变异作为最可信的工具变量，MR明确了有效工具变量的三个基本假设(图1)：

(1) 工具变量必须与GERD有强相关性。

(2) 工具变量与混杂因素无关。

(3) 工具变量不得直接影响结果，仅通过GERD影响AP。

使用R包TwoSample MR进行的两样本孟德尔随机化分析被用来评估GERD和AP之间的因果相关性。最初，对于每个暴露特征，选取了达到全基因组显著性水平(p < 5 × 10⁻⁸)的单核苷酸多态性(SNPs)。然后进行聚合，以识别具有独立性(r² < 0.001，10,000 kb范围内)的有关遗传变异作为工具变量(IVs)。总共识别出与GERD显著相关的80个SNPs。使用R²和F统计量评估遗传工具的有效性。为每个SNP以及累积的SNPs计算了F统计量和R²。当F值低于10时，排除遗传变异以减轻效应估计中的偏差，表明它们在阐明暴露方面的有限能力[26]。用于确定F统计量和R²的方程式如下：

$R^2=2\times \left(1-\text{EAF}\right)\times \text{EAF}\times {\beta }^2$

$F=\left(\frac{R^2}{1-R^2}\right)\left(\frac{N-k-1}{k}\right)$

暴露的SNP与结果SNP进行了协调，以确保效应等位基因的一致性。此外，中等等位基因频率的SNP以及被识别为回文的SNP (rs2145318, rs2358016, rs9517313, rs957345)被排除在外，以保持方法学的严谨性。

Figure 1. Study design overview

图1. 研究设计概述

2.3. MR分析

评估GERD对AP发展的因果影响，采用了七种广泛认可的方法：逆方差加权(IVW)、孟德尔随机化多效性残差和异常值(MR-PRESSO)、加权模型、简单模型、加权中位数估计(WME)、MR-Egger回归和留一法分析。主要应用是使用IVW方法估计GERD和AP之间的因果关系。IVW广泛用于两样本变异特异性因果估计[27]。为了增强结果的可信度和稳定性，进行了补充分析。除非特别指定，所有“IVW”的实例均意味着使用随机效应IVW，这是一种通过计算每个SNP的Wald比率(WR)进行总体因果估计的方法，假设所有SNP作为IVs的有效性。当所有IVs均显示有效性时，IVW方法会产生可靠的结果，并且不存在异质性。两样本MR涉及选择两组样本，SNP-暴露变量和SNP-结果变量，由于固定SNP位点和人群或测序方法的潜在变化，可能表现出异质性。因此，异质性的评估涉及应用Rücker的Q检验和Cochran的Q检验，分别使用MR-Egger和IVW方法，当p < 0.05时，表明可能存在异质性[23]。依赖IVW方法，MR-Egger方法将所有遗传变异视为无效IVs，计算每个SNP与GERD和AP的相关性，并拟合线性函数[28]。简单模型涉及中位数比率估计，但当个别SNP的估计效应表现出高变异性时，其有效性降低。WME方法在至少一半的权重来自有效SNPs的条件下，为因果效应提供等效的加权中位数估计[28]。WME作为一种抗多效性方法执行[29]。MR-PRESSO和MR-Egger用于检测异常值和识别潜在的水平多效性。加权模式方法遵循类似的程序，其中权重分配给个别SNPs。这些方法相互验证，为因果关系提供了稳健的证据。最后，通过迭代移除SNPs来实施留一法分析，以确保结果的稳定性和可靠性，确定它们对总体结果的有限影响。

MR分析的执行涉及使用TwoSampleMR (版本0.5.7)和MRPRESSO包(版本1.0)，这些包集成在R包(版本4.3.1)中。

3. 结果

3.1. 遗传工具强度评估

进行了统计分析以得出单个SNP的F统计量，为与相应暴露相关的SNP总体计算了一个总体F统计量。得出的R²为3.60%。F统计量的分布范围从207.50到669.24，对于单个SNP来说，这表明了一个因果关联不太容易受到弱工具变量偏差影响的范围。这一观察增强了对得出的F统计量在评估遗传变异对研究暴露的潜在影响方面的稳健性的信心。

3.2. GERD对AP因果效应的MR分析

在图2中，森林图展示了在GERD背景下，单个SNP对AP的影响。MR估计分析揭示了GERD对AP的明显因果影响。从IVW模型得出的因果效应估计显示了统计学上的显著关联，表明GERD与增加的AP风险之间有明显的联系(OR = 1.6870, 95% CI = 1.402~2.029, p = 2.940 × 10⁻⁸)。此外，从包括加权模式(OR = 1.7310, 95% CI 1.006~2.976, p = 0.050)、简单模式(OR = 1.7694, 95% CI 0.887~3.528, p = 0.109)、WME (OR = 1.7143, 95% CI 1.339~2.194, p = 1.870 × 10⁻⁵)和MR-Egger (OR = 2.7409, 95% CI 0.937~8.009, p = 0.069)在内的GERD对AP MR分析中获得了并行的因果估计(表1)。这些不同的模型共同为IVW方法的稳健性和可靠性做出了贡献，从而加强了GERD与AP之间因果联系的整体可信度，如从多种分析方法获得的结果所示(图3)。

Figure 2. MR analysis for individual SNPs associated with GERD in relation to AP risk

图2. 与GERD相关的单个SNP与AP风险的MR分析

Table 1. Results of correlation between GERD estimated by MR and AP

表1. MR估计的GERD与AP相关的结果

Exposure	Outcome	Method	p value	OR	95%CI	Cochran’s Q-tests P	MR Egger intercept test P	Egger intercept
GERD	AP	IVW	2.940E−08	1.687	1.402	0.069	0.371	−0.016
		Weighted median	1.870E−05	1.714	1.339	0.068
		MR Egger	0.069	2.741	0.938
		Simple mode	0.109	1.769	0.887
		Weighted mode	0.051	1.731	1.007

IVW：逆方差加权；OR：优势比；GERD：胃食管反流病；AP：急性胰腺炎。

Figure 3. Each point in the scatterplot represents a SNP, which shows us the association of each SNP with exposure and outcome. Solid lines represent line segments fitted using different models

图3. 散点图中的每个点代表一个SNP，向我们展示了每个SNP与暴露和结果的关联。实线表示使用不同模型拟合的线段

3.3. 敏感性分析

在使用IVW和MR-Egger回归的背景下，Rücker的Q检验和Cochran的Q检验对于SNP异质性产生了非显著性结果(分别为p = 0.067和p = 0.068)。值得注意的是，MR Egger截距检验结果为p = 0.370，非统计学上显著，支持了SNP之间不存在水平多向性(horizontal pleiotropy)的推断。这一发现增强了我们对所使用遗传工具可靠性的信心。此外，通过在留一法分析中详细迭代排除个别SNP，对结果的稳健性进行了验证(图4)。这种系统性地移除个别SNP并没有引起结果的显著波动，强调了我们发现的稳健性和一致性。同时，图5作为漏斗图显示，SNP基本上是对称分布的，不存在方向性多向性。

Figure 4. Estimating the MR between GERD and AP by excluding one SNP at a time

图4. 通过一次排除一个SNP来估计GERD和AP之间的MR

Figure 5. The funnel plot is used to check for the presence of heterogeneity in individual SNPs, and when there is no heterogeneity, the funnel plot takes on a symmetrical shape

图5. 漏斗图用于检查单个SNP中是否存在异质性，当没有异质性时，漏斗图呈现对称形状

4. 讨论

在这项研究中，我们利用最新且最大的全基因组关联研究(GWAS)数据，对GERD与AP之间的因果关系进行了研究。我们的揭示了GERD和AP之间显著的相关性，表明对GERD的遗传倾向与增加的AP风险相关。尽管之前的观察性分析和病例报告已经显示GERD和AP经常共同发生，但其确切的病因仍然不明确，通常归因于腹腔内病理[18] [30]。分析结果提供了支持AP与GERD之间存在因果关系的有力证据。此外，反流症状与随后的并发症之间可以建立更显著的关联[31]。有研究表明，GERD引起的气体和肠系膜上动脉综合征(SMAS)导致从胃到十二指肠第三部分形成一个闭合环路，导致十二指肠和胰管腔内压力增加，这可能导致AP [31]，并且由SMAS引起的继发性后阻塞乳头综合征(POMS)可能导致胆汁反向流入胰管，从而激活导致胰腺炎的炎症现象。有许多临床病例显示SAMS是AP的原因，我们的研究发现GERD更可能是AP的原因[32] [33]。

同时，在林向飞2005年的研究中发现，在急性胰腺炎患者中存在有显著的食管动力学异常，同时食管糜烂发生率达到70.8% [34]，如果长期的胃食管反流病没有进行任何治疗的患者，发展为急性胰腺炎的风险会增加。其中的原因也包括Oddi括约肌的张力下降，增加了十二指肠液的反流，继而导致急性胰腺炎的发生[35]。

显著的是，这项研究代表了首次使用MR方法探索GERD遗传易感性与AP之间因果联系的探索。我们严格遵守工具变量条件和模型假设，加上缺乏支持异质性的显著证据，增强了我们发现的可信度。我们的研究在传统观察性研究上有几个优势，主要归功于更优越的研究设计和数据来源。首先，MR分析能够最小化反向因果关系和混杂因素的干扰，评估因果关系，从而减少传统观察性调查中固有的偏见。其次，应用来自最新和最大规模研究的GWAS汇总数据显著增强了因果推断的统计能力。最后，实施严格的SNP筛选协议和应用多种MR分析方法，共同产生有意义的结果，降低假阳性率并确保结果的准确性。

尽管有这些优势，我们的MR分析并非没有局限性。首先，源自欧洲人种的GWAS数据限制了我们发现的广泛人群外推性，需要更全面的人群基础GWAS研究。其次，我们的研究未能阐明GERD-AP关系的机制基础，需要进一步的实验室调查来解决机制复杂性。

总之，这项研究对患有GERD和AP的个体具有重要的健康意义，为制定精确治疗和预防这两种状况的策略奠定了基础。例如，在Nissen胃底折叠术后，Roux-En-Y胃空肠吻合术和Roux-En-Y喂养空肠吻合术应始终关注患者AP状态的进展，并将治疗重点转移到GERD，并治疗AP的病因。同时，由于AP和GERD在临床患者的表现中有一定的相似性，均体现在上腹部疼痛伴或不伴后背部放射痛，如果在两种疾病同时发生时，极易导致GERD的漏诊，而GERD的进一步加重也会刺激AP的进一步加重，此项研究也在提示临床医生在对AP患者诊疗时也应关注GERD的发生进展。

基金项目

国家自然科学基金(No. 82472959, 82273069)；山东省医药卫生科技项目(No. 202404020093)；济宁市重点研发项目(No. 2024YXNS104)；济宁医学院附属医院临床研究基金项目(LCYJ-016)。

NOTES

^*通讯作者。