载氟尿嘧啶的肝细胞癌靶向外泌体构建与疗效评价

Construction and Efficacy Evaluation of Fluorouracil-Loading Hepatocellular Carcinoma-Targeted Exosomes

摘要: 目的：构建一种负载氟尿嘧啶的肝细胞癌靶向外泌体，并对其疗效与安全性进行评价。方法：采用慢病毒转染法，将磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3单克隆抗体单链可变区修饰至外泌体表面，构建肝细胞癌靶向外泌体GPC3-Exo，用体外细胞摄取实验，研究其肝细胞癌靶向能力；采用超声处理法，将氟尿嘧啶载入外泌体，得载药外泌体GPC3-Exo-5FU，用细胞毒性实验，研究其对肝细胞癌细胞的杀伤能力；最后构建肝细胞癌皮下荷瘤裸鼠模型，研究载药外泌体的体内疗效及安全性。结果：成功构建肝细胞癌靶向外泌体GPC3-Exo，用多种细胞对GPC3-Exo的靶向能力进行探究，发现GPC3-Exo可高效靶向肝细胞癌细胞；经超声载药处理，得载药外泌体GPC3-Exo-5FU，载药率为(4.96 ± 0.26)%，用肝细胞癌细胞对GPC3-Exo-5FU的细胞毒性进行评估，发现GPC3-Exo-5FU可有效抑制肝细胞癌细胞的活力；最后用肝细胞癌皮下荷瘤小鼠评价GPC3-Exo-5FU的体内药效及安全性，发现GPC3-Exo-5FU有效抑制小鼠肿瘤增殖，抗肿瘤疗效与安全性均强于游离氟尿嘧啶。结论：本研究成功构建了一种负载氟尿嘧啶的肝细胞癌靶向外泌体，在肝细胞癌治疗中表现出良好的疗效及安全性。

Abstract: Objective: This study aimed to develop a hepatocellular carcinoma (HCC)-targeted exosome system loaded with 5-fluorouracil (5-FU) and to evaluate its therapeutic efficacy and safety. Methods: Glypican-3 (GPC3)-specific single-chain variable fragment (scFv) was incorporated onto the exosome membrane via lentiviral transfection to generate GPC3-targeted exosomes (GPC3-Exo). The targeting ability of GPC3-Exo toward HCC cells was assessed using in vitro cellular uptake assays. 5-FU was loaded into GPC3-Exo by ultrasonic treatment to prepare the drug-loaded exosomes (GPC3-Exo-5FU). Cytotoxicity assays were performed to evaluate the anti-tumor activity of GPC3-Exo-5FU against HCC cells in vitro. Finally, a subcutaneous HCC xenograft nude mouse model was established to assess the in vivo therapeutic efficacy and safety of GPC3-Exo-5FU. Results: GPC3-Exo was successfully constructed and demonstrated efficient targeting toward HCC cells in various in vitro models. Following ultrasonic drug loading, GPC3-Exo-5FU was obtained with a drug-loading efficiency of 4.96% ± 0.26%. In vitro cytotoxicity assays confirmed that GPC3-Exo-5FU significantly inhibited the viability of HCC cells. In vivo studies using HCC-bearing nude mice showed that GPC3-Exo-5FU effectively suppressed tumor growth, with superior anti-tumor efficacy and safety compared to free 5-FU. Conclusion: This study successfully established a 5-FU-loaded, HCC-targeted exosome delivery system that demonstrated promising therapeutic potential and safety in the treatment of hepatocellular carcinoma.

1. 引言

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全部癌症类型中位居第六，死亡率位居第三[1]。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性肝癌最常见的病理学类型，占全部病例的75%~85% [2]。HCC起病隐匿，早期症状不明显，多数患者在初次确诊时便已经处于疾病中晚期阶段，治疗方法有限[3]，晚期HCC患者生存期普遍较短，5年生存率仅22% [4]，更高效的晚期HCC治疗策略亟待开发。

氟尿嘧啶(5-fluoroufacil, 5-FU)是有数十年应用历史的经典化疗药物，通过抑制胸苷酸合成酶，干扰DNA及RNA的合成，发挥抗肿瘤作用[5]，在中国被批准用于晚期不可切除HCC的一线治疗[6]。但5-FU缺乏肿瘤特异性，难以在肿瘤部位蓄积，导致临床疗效差，且易引发呕吐、腹泻、脱发、骨髓抑制等不良反应[7] [8]，提示有必要探索5-FU肿瘤靶向递送策略，以提高药物疗效并减轻毒副作用。

外泌体(Exosomes)是一种直径30 nm~150 nm的天然囊泡，属于细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种亚群，可由几乎所有类型的真核细胞分泌，广泛存在于几乎所有类型的体液之中，在胞间通讯中发挥重要作用[9]。外泌体具有以脂质双分子层包围的亲水性内部空间，可携带大量来自亲本细胞的脂质、蛋白、核酸等可溶性小分子物质[10]，其脂质双分子层表面通常表达有多种蛋白标志物，如四跨膜蛋白超家族CD9、CD63、CD81等[11]，可通过膜蛋白与受体细胞发生相互作用，调节靶细胞的生理生化活动[12]。

作为天然囊泡，外泌体具有良好的生物相容性与较低的毒性及免疫原性，被认为是理想的药物递送载体[13]，但用于肿瘤药物递送时，外泌体存在靶向能力不足的问题[14]。使用化学方法或基因工程方法，对外泌体进行修饰，可在外泌体表面连接靶向配体，增强外泌体对治疗部位的定位能力，实现肿瘤靶向药物递送[15]。如Wang等[16]将抗HER2的scFv抗体ML39修饰在外泌体表面，实现了对HER2阳性乳腺癌的mRNA特异性递送。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (Glypican-3, GPC3)是一种70 kDa的跨膜蛋白，通过与糖基磷脂酰肌醇锚定结合在细胞膜表面[17]。GPC3在成人正常人体组织中低表达或不表达，但在多数HCC中高度表达，通过激活多种癌症信号，如Wnt、Hh、FGF及HGF等，调节HCC细胞的增殖、转移及免疫逃逸，提示GPC3不仅可作为HCC诊断的特异性标志物，也是HCC治疗的重要潜在靶点之一[18]。目前已有多项针对GPC3的HCC疗法处于临床研究阶段，如科济药业的CT011与索拉非尼联合治疗，使两例晚期HCC患者获得7年以上无病生存[19]；24名晚期HCC患者接受西比曼生物的C-CAR031治疗，22名疗效可接受评估的患者中，90.9%患者观察到肝内及肝外肿瘤缩小，随访9.03个月时，预估中位总生存期为11.14个月[20]。

本研究拟采用HEK-293细胞来源的外泌体，通过基因工程方法进行表面修饰，使外泌体表面表达抗GPC3的scFv抗体，得HCC靶向外泌体(GPC3-Exo)，使用多株HCC及非HCC细胞探究其HCC靶向能力。采用超声处理法，使外泌体负载5-FU，得载5-FU的HCC靶向外泌体(GPC3-Exo-5FU)，使用HCC细胞，探究其对HCC细胞活力的抑制作用。最后，构建HCC皮下荷瘤裸鼠模型，尾静脉给予载药外泌体，探究其体内抗HCC疗效及安全性。

2. 材料

2.1. 主要药品与试剂

DMEM培养基(上海奥浦迈生物科技股份有限公司)；RPMI-1640培养基、青霉素/链霉素、BCA蛋白浓度测定试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)；胎牛血清、CellCounting-Lite细胞活力检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；氟尿嘧啶、聚乙二醇10000(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；兔抗CD63、兔抗CD81抗体(Cell Signaling Technology)；兔抗GPC3、兔抗GAPDH、兔抗Ki67、兔抗Cleaved Caspase 3、HRP酶标山羊抗兔IgG (武汉三鹰生物技术有限公司)；ECL化学发光超敏显色试剂盒(Thermo Fisher Scientific)；H&E染色试剂、DAB显色试剂(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

2.2. 主要仪器

Zetasizer Pro纳米粒度分析仪(Malvern Panalytical)；HT7700透射电子显微镜(Hitachi)；SpectraMax M3微孔板检测器(Molecular Devices)；Agilent 1100高效液相色谱系统(Agilent)；TBA-40FR全自动生化分析仪(Toshiba)；BC-5000 Vet全自动血液细胞分析仪(Mindray Animal)。

2.3. 实验细胞与培养方法

人肝星状细胞LX-2、人肝癌细胞Hep3B、人肝癌细胞Huh7、人胚胎肾细胞HEK-293、人胚胎肾细胞HEK-293T (武汉普诺赛生物科技有限公司)，人恶性黑色素瘤细胞A375、人肝癌细胞HepG2 (南京科佰生物科技有限公司)培养于DMEM培养基内，人非小细胞肺癌细胞H1568培养于RPMI-1640培养基内，培养基添加10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素，置于恒温培养箱内37℃，5% CO₂培养。

2.4. 实验动物

SFP级Nu/Nu裸鼠(四川维通利华实验动物技术有限公司)，雌性，4-6周龄，许可证号：SCXK(川)2023-0040。本研究严格遵循动物福利伦理原则，动物实验经中国药科大学实验动物伦理委员会的批准。

3. 方法

3.1. 细胞转染

在GPC3单克隆抗体scFv片段序列[21]的5’端连接Igκ leader信号肽及His标签序列，3’端连接PDGFR跨膜结构域，插入慢病毒载体质粒pLenti-CMV-GFP-Blast，构建慢病毒载体pLenti-GPC3Exo，靶向肽序列结构可总结为Igκ leader-His标签-GPC3 scFv-PDGFR跨膜结构域-GFP，在跨膜结构域及信号肽作用下可向胞外分泌并锚定于细胞膜表面。

按照制造商说明书，pLenti-GPC3Exo与慢病毒包装质粒psPAX2及pMD2.G以1.5 μg:1 μg:0.5 μg比例，通过Lipofectamine 3000转染HEK-293T细胞，培养48 h后收集含慢病毒培养上清。

HEK-293接种于6孔板内，培养至汇合度达70%，加入慢病毒及10 μg/mL的Polybrene转染24 h，更换新鲜培养基继续培养24 h后，向培养基内加入10 μg/mL的Blasticidin S，继续培养7 d，筛选稳细胞系GE-293。

3.2. 外泌体纯化

GE-293细胞系培养于含10%无外泌体血清及1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，无外泌体血清参考文献方法[22]，通过超速离心法，以4℃，100,000 ×g条件离心18 h制备。细胞培养48 h后收集培养上清，使用聚合物沉淀法纯外泌体，培养上清在4℃下300×g离心10 min、2000×g离心10 min、10,000×g离心30 min，取上清以0.45 μm微孔滤膜过滤，加入8% PEG10000及0.5 M氯化钠，充分混匀，4℃沉淀过夜，后在4℃下16,000×g离心60 min，弃上清，以PBS缓冲液重悬沉淀，得工程化外泌体GPC3-Exo，−20℃保存备用。

3.3. 外泌体表征

3.3.1. 外泌体粒径表征

取适当浓度的外泌体溶液(1 mg/mL，以总蛋白量计) 100 μL置于样品池中，以PBS稀释至1 mL，使用Zetasizer Pro测定外泌体粒径分布。

3.3.2. 外泌体形貌表征

取外泌体溶液10 μL滴加于铜网上，室温吸附10 min，小心吸去多余液体，随后向铜网滴加10 μL 2%醋酸双氧铀染色液，室温染色2 min，小心吸去多余染色液，室温干燥，铜网置于透射电子显微镜下，80 kV检测拍照。

3.3.3. 外泌体蛋白标志物表征

GPC3-Exo外泌体及GE-293细胞以RIPA裂解液裂解，使用BCA蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度并调节至相同。与SDS-PAGE Loading Buffer混合后100℃加热5 min以变性蛋白，冰浴冷却至常温后短暂离心，10% SDS-PAGE凝胶加样电泳。电泳结束后，100 mA恒流湿法转膜1.5 h，将蛋白转移至PVDF膜上。根据目标蛋白分子量，于适当位置裁剪PVDF膜，以5% BSA室温封闭1.5 h，并与相对应一抗(CD81、CD63、GAPDH、His)在4℃下孵育过夜。次日以TBST洗膜3次，再与酶标二抗室温避光孵育2 h，TBST洗膜3次，最终加入ECL发光液显色，在化学发光成像系统中检测发光信号并拍照记录。

3.4. 5-FU装载与载药率检测

1 mg/mL外泌体溶液及1 mg/mL 5-FU溶液各取5 mL混匀，超声破碎仪处理，超声功率150 W，超声处理30 s，暂停60 s，重复6次[23]，全程冰浴。超声处理结束后，溶液置于37℃继续孵育1 h促进外泌体膜修复。外泌体溶液转移入100 kDa MWCO超滤离心管内，25℃，4000×g离心30 min，去除游离5-FU，以PBS重悬管内沉淀，得载药外泌体GPC3-Exo-5FU，分装，保存于−20℃备用。

载药率通过高效液相色谱法测定，取载药外泌体溶液100 μL，加等体积RIPA裂解液裂解30 min，加入1 mL乙酸乙酯/异丙醇(85:15, V/V)萃取液，涡旋震荡5 min，后4℃，16,000×g离心10 min，吸取上层有机相900 μL，温和氮气流干燥，残留物以100 μL PBS重新溶解，高效液相色谱进样检测。色谱条件：色谱柱，Waters Atlantis T3 (4.6 × 150 mm, 3 µm)；流动相A，0.1%甲酸水溶液(V/V)；流动相B，甲醇；流动相流速，0.8 mL/min；洗脱梯度，0~2 min，10% B，2~2.1 min，10%~40% B，2.1~5 min，40% B，5~5.1 min，40%~10% B，5.1~12 min，10% B；VWD检测器波长，265 nm，柱温，35℃；进样量，20 μL。

同时配置外加5-FU 1、10、20、50、75、100 μg/mL的系列外泌体溶液，同法测定，以色谱峰面积对5-FU浓度做标准曲线，用于计算样品中5-FU浓度，GPC3-Exo-5FU载药率计算方法为：

$\text{Loading}\text{capacity}\left(\text{\%}\right)=\frac{{\text{W}}_{\text{D}}}{{\text{W}}_{\text{E}}}\times 100$

其中W_D表示载药外泌体中5-FU含量，W_E表示载药外泌体中外泌体含量(以外泌体总蛋白浓度计)。

3.5. 细胞摄取实验

细胞以2 × 10⁶/mL密度接种于12孔板，每孔1 mL，培养过夜。浓度1 mg/mL的外泌体以5 μM DiD染料标记30 min，100 kDa MWCO超滤离心管25℃，4000×g离心30 min，去除游离染料。10 μL标记外泌体与细胞共孵育4 h，PBS洗涤细胞2次，胰酶消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞DiD荧光强度。

3.6. 细胞增殖实验

细胞以1 × 10⁴/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL，培养过夜。以PBS将GPC3-Exo-5FU稀释至5-FU浓度50 μg/mL，向细胞中加入1 μL上述GPC3-Exo-5FU溶液，同时设置由同浓度5-FU处理的5-FU组、仅以PBS处理的空白对照组及仅含培养基的矫正组，每组设6个复孔，孵育3 d，每日按照CellCounting-Lite细胞活力检测试剂盒说明书检测各组细胞活力，并按照以下公式计算细胞抑制率：

$\text{Inhibition}\text{Rate}\left(\text{\%}\right)=\frac{\left[{\text{L}}_{\text{C}}-{\text{L}}_{\text{S}}\right]}{\left[{\text{L}}_{\text{C}}-{\text{L}}_{\text{B}}\right]}\times 100$

其中L_s表示实验孔(含细胞、培养基、药物溶液及CCL试剂)辉光强度；L_c表示对照孔(含细胞、培养基及CCL试剂，不含药物)辉光强度；L_b表示校正孔(含培养基、CCL试剂，不含细胞及药物)辉光强度。

3.7. HCC裸鼠模型

处于对数生长期的HepG2细胞以DMEM培养基稀释至3 × 10⁷/mL，与等体积基质胶混合，裸鼠右侧腋下接种细胞悬液200 μL。接种14 d后，裸鼠按平均瘤体积随机分为三组：PBS组、5-FU组及GPC3-Exo-5FU组，每组5只裸鼠，瘤体积计算方法如下：

$\text{Tumer}\text{Volume}\left({\text{mm}}^3\right)=0.5\times \text{a}\times {\text{b}}^2$

其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。

分组日记为0 d，自0 d起各组分别尾静脉通过尾静脉给予PBS、5-FU及GPC3-Exo-5FU，给药剂量以5-FU计30 mg/kg，给药体积10 ml/kg，每3日给药一次，共给药5次。

给药周期内，每2日记录裸鼠体重及肿瘤体积。15 d结束给药，16 d时裸鼠摘眼球取血，测定肝肾功能生化指标ALT、AST、CREA、UREA及外周白细胞数量。取肿瘤组织，称重并拍照记录，做苏木精–伊红(Hematoxylin-Eosin Staining, H&E)染色检测肿瘤组织坏死情况，以免疫组织化学染色(Immunohistochemistry, IHC)检测肿瘤组织内Ki67及Cleaved Caspase 3表达水平，取主要脏器做H&E染色，评估各组器官损伤情况。

3.8. H&E染色

器官及肿瘤组织以10%甲醛溶液固定。以50%、70%、85%、95%、100%梯度乙醇脱水1 h，再以无水乙醇/二甲苯(1:1)浸泡20 min，二甲苯透化10 min 2次。石蜡包埋，切5 μm薄片。切片65℃烤片1 h，以二甲苯脱蜡2次，各10 min，再以100%、95%、85%、70%梯度乙醇各水化5 min，蒸馏水冲洗5 min。以苏木精染色液染色5 min，以1%盐酸乙醇分化数秒，0.6%氨水反蓝，后用伊红染色液染色2 min。染色结束后，依次以75%、85%及无水乙醇脱水5 min，二甲苯透化2次，每次10 min，切片干燥后，以中性树胶封片，显微镜下白光观察。

3.9. IHC

肿瘤组织切片65℃烤片1 h后以二甲苯脱蜡2次，各10 min，再以100%、95%、85%、70%梯度乙醇各水化5 min，蒸馏水冲洗5 min。加入抗原修复液，100℃修复15 min，冷却至室温，PBS洗涤，以3%过氧化氢溶液孵育30 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤后以5% BSA室温封闭30 min，加入一抗(Ki67、Cleaved Caspase 3)，4℃孵育过夜。次日取出切片，以PBS漂洗，加入酶标二抗，室温孵育60 min，PBS漂洗。加入DAB显色液孵育，切片呈现棕色后以大量蒸馏水终止显色，最后用苏木精核染，依次以75%、85%及无水乙醇脱水5 min，二甲苯透化2次，每次10 min，切片干燥后，以中性树胶封片，显微镜下白光观察。

3.10. 统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism 10.2.2进行分析，两组数据间比较采用t检验，多组数据间比较采用One-Way ANOVA分析，数据结果以(Mean ± SEM)形式呈现，P < 0.05表示有统计学差异。

4. 结果

4.1. GPC3-Exo与GPC3-Exo-5FU构建及表征

外泌体表征结果如图1及表1所示。通过透射电镜，观察到GPC3-Exo呈现典型一侧凹陷的半球形结构，经超声处理装载5-FU的GPC3-Exo-5FU形态未发生明显改变(图1(A))。通过动态光散射系统测量外泌体粒径大小，结果显示GPC3-Exo与GPC3-Exo-5FU平均粒径分别为(151.6 ± 3.2) nm及(191.8 ± 8.3) nm (图1(B)、表1)，GPC3-Exo-5FU粒径显著增大，可能是由于5-FU被载入外泌体中所导致。通过免疫印记实验，检测外泌体蛋白标志物，结果表明，外泌体阳性特征蛋白CD63及CD81在GPC3-Exo中高表达，阴性蛋白GAPDH在GPC3-Exo中几乎未见表达，且在GPC3-Exo中检测到了His标签标记的GPC3 scFv抗体(图1(C))，表明GPC3靶向肽成功整合到GPC3-Exo中。使用高效液相色谱法检测，GPC3-Exo-5FU载药率为(4.96 ± 0.26)%。

Table 1. Particle size of GPC3-Exo and GPC3-Exo-5FU (n = 3, *: P < 0.05)

表1. GPC3-Exo与GPC3-Exo-5FU的粒径(n = 3, *: P < 0.05)

样品	分散介质	平均粒径(nm)
GPC3-Exo	PBS缓冲液	151.6 ± 3.2
GPC3-Exo-5FU	PBS缓冲液	191.8 ± 8.3^*

Figure 1. Characterization of GPC3-Exo and GPC3-Exo-5FU

图1. GPC3-Exo及GPC3-Exo-5FU表征

4.2. GPC3-Exo与GPC3-Exo-5FU在体外靶向HCC细胞

Figure 2. GPC3-Exo and GPC3-Exo-5FU targeting HCC cells in vitro (***: P < 0.001, ns: no significant difference)

图2. GPC3-Exo与GPC3-Exo-5FU在体外靶向HCC细胞 (***：P < 0.001，ns：无显著差异)

按照2.7.3中免疫印记实验方法，检测HepG2、Huh7、Hep3B、LX-2、H1568、A375细胞的GPC3表达水平，结果如图2(A)所示，GPC3在HCC细胞系HepG2、Huh7中高表达。按照2.9中方法，以DiD染料标记GPC3-Exo，与上述细胞系共孵育4 h，检测各细胞系平均荧光强度，结果表明HepG2及Huh7细胞平均荧光强度显著高于其他细胞，与GPC3表达水平检测结果相符合，表明GPC3-Exo通过靶向GPC3，实现对HCC细胞的靶向(图2(B))。按照2.9中方法，以DiD染料标记GPC3-Exo及GPC3-Exo-5FU，分别与HepG2及Huh7细胞系共孵育4 h，检测细胞平均荧光强度，结果表明GPC3-Exo与GPC3-Exo-5FU组细胞平均荧光强度没有明显差异(图2(C))，表明经超声处理后，GPC3-Exo-5FU的HCC细胞靶向能力未发生改变。

4.3. GPC3-Exo-5FU在体外抑制HCC细胞活力

如图3所示，GPC3-Exo-5FU处理HCC细胞3 d，其细胞抑制率均达到50%以上，表明GPC3-Exo-5FU在体外具有较强HCC细胞抑制能力。对GPC3高表达HCC细胞HepG2及Huh7，相比于游离5-FU，GPC3-Exo-5FU在孵育早期细胞抑制作用更强(图3(A)、图3(B))，此现象可能因相比于5-FU通过被动扩散或经hOat2等转运体进入细胞[24]，5-FU随外泌体被细胞摄取速度更快导致，低GPC3表达HCC细胞Hep3B在孵育第1 d时，5-FU与GPC3-Exo-5FU组细胞抑制率无明显差异。HepG2细胞在孵育第2 d后，5-FU与GPC3-Exo-5FU组细胞抑制率差异消失，此现象可能因HepG2细胞倍增速度快[25]，掩盖了GPC3-Exo-5FU与游离5-FU间的细胞毒性差异导致。

Figure 3. GPC3-Exo-5FU inhibits HCC cell viability in vitro (*: P < 0.05, ***: P < 0.001)

图3. GPC3-Exo-5FU在体外抑制HCC细胞活力 (*: P < 0.05, ***: P < 0.001)

4.4. GPC3-Exo-5FU体内抗HCC疗效

GPC3-Exo-5FU的体内抗HCC疗效如图4所示。HCC皮下荷瘤裸鼠分别尾静脉注射PBS、5-FU及GPC3-Exo-5FU，GPC3-Exo-5FU治疗组裸鼠肿瘤体积为(728.97 ± 74.37) mm³，显著小于5-FU治疗组((1194.21 ± 123.7) mm³)及PBS组((1560.64 ± 76.23) mm³) (图4(A)、图4(B))，各组瘤重测量结果与瘤体积测量结果相符，GPC3-Exo-5FU治疗组瘤重最轻，为(1.01 ± 0.08) g，显著低于5-FU组((1.61 ± 0.18) g)及PBS组((2.14 ± 0.11) g) (图4(C))，表明GPC3-Exo-5FU在体内具有抑制HCC的能力，且其抗HCC疗效强于游离5-FU。

为进一步探究GPC3-Exo-5FU对肿瘤组织增殖及凋亡的影响，取肿瘤组织进行H&E与IHC染色，结果如图5所示。GPC3-Exo-5FU治疗组肿瘤组织内可见明显坏死区域，IHC结果表明GPC3-Exo-5FU组肿瘤内凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3表达水平明显提升，而细胞增殖标志物Ki67表达水平下降，表明GPC3-Exo-5FU诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖。

Figure 4. In vivo anti-HCC efficacy of GPC3-Exo-5FU (n = 5, *: P < 0.05, ***: P < 0.001)

图4. GPC3-Exo-5FU的体内抗HCC疗效 (n = 5, *: P < 0.05, ***: P < 0.001)

Figure 5. H&E staining and IHC of mice tumor tissue, scale bar 50 μm

图5. 小鼠肿瘤组织H&E及IHC染色，标尺50 μm

4.5. GPC3-Exo-5FU的体内安全性

治疗期间，小鼠的体重变化趋势可一定程度上反映药物的体内安全性。如图6所示，HCC皮下荷瘤小鼠尾静脉注射PBS、5-FU及GPC3-Exo-5FU，PBS组及GPC3-Exo-5FU组小鼠体重总体呈上升趋势，治疗结束时GPC3-Exo-5FU组小鼠体重低于PBS组，但无显著差异。5-FU组小鼠体重增长缓慢，治疗结束时显著低于GPC3-Exo-5FU组，表明GPC3-Exo-5FU体内安全性高于游离5-FU。

Figure 6. Body weight curve of mice (n = 5, *: P < 0.05, ns: no significant difference)

图6. 小鼠体重变化曲线(n = 5，*：P < 0.05，ns：无显著差异)

取小鼠血液进行血生化及血常规分析，常见肝肾功能指标ALT、AST、CREA、UREA及外周白细胞数量检测结果如图7所示。GPC3-Exo-5FU细胞常见肝肾功能损伤指标ALT、AST、CREA水平降低，三组间肾功能损伤指标UREA水平无明显差异，表明GPC3-Exo-5FU不易造成肝肾功能损伤。GPC3-Exo-5FU组外周血白细胞计数与PBS组无明显差异，5-FU组与PBS组相比显著降低，表明GPC3-Exo-5FU的血液毒性比游离5-FU更低。

Figure 7. Blood biochemistry and blood routine test results of mice (n = 5, *: P < 0.05, ns: no significant difference)

图7. 小鼠血生化及血常规检测结果(n = 5，*：P < 0.05，ns：无显著差异)

为进一步探究GPC3-Exo-5FU的体内安全性，取小鼠主要脏器心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色，结果如图8所示。各组小鼠主要脏器均未见形态异常，进一步表明GPC3-Exo-5FU具有良好的体内安全性。

Figure 8. H&E staining of mice major organs, scale bar 50 μm

图8. 小鼠主要器官H&E染色，标尺50 μm

5. 结论

本研究通过基因工程修饰法构建，并使用聚合物沉淀法纯化了在膜表面表达GPC3 scFv抗体的工程化外泌体GPC3-Exo，其在体外表现出对GPC3高表达HCC细胞的特异性靶向能力，展现出作为HCC药物递送载体的潜力。为利用GPC3-Exo进行HCC靶向药物递送，本研究采用超声处理法，将HCC治疗药物5-FU载入GPC3-Exo内，得载药外泌体GPC3-Exo-5FU。经超声处理，GPC3-Exo-5FU结构完整，HCC靶向能力未发生改变，使用高效液相色谱法检测，载药率达(4.96 ± 0.26)%，在体外可显著抑制HCC细胞活力，细胞毒性较游离5-FU更强。最后，本研究构建了HCC皮下荷瘤裸鼠模型，探究GPC3-Exo-5FU的体内抗HCC活性及安全性，结果表明GPC3-Exo-5FU可显著抑制裸鼠肿瘤生长，同时其抗肿瘤疗效与安全性均高于同剂量游离5-FU。本研究构建了一种具有良好HCC靶向能力的工程化外泌体，用作HCC药物递送载体时可提高药物疗效、降低毒副反应，或将为晚期HCC治疗提供一种新的选择。

NOTES

^*通讯作者。