1. 引言
布鲁氏菌是胞内寄生的革兰氏阴性杆菌，可以引起以生殖系统疾病为主要特征的人畜共患的布鲁氏菌病，在全球70多个国家流行[1]，目前该病波及了我国25个省(市、自治区)。每年感染的羊、牛、猪高达百万头，造成的经济损失可达十几亿元人民币[2]，加重全球公共卫生负担以及影响畜牧业发展。布鲁氏菌侵入人体后，人感染布鲁氏菌主要症状表现为慢性持续性感染，临床表现为波状热、全身乏力、多汗及关节部位的肿痛等症状[3]，还可累及多个组织器官形成慢性感染，难以治愈。布鲁氏菌可在宿主体内造成持续性感染，但其感染机制仍不明确[2]。因此，研究布鲁氏菌的分子致病机制具有重要意义。揭示布鲁氏菌宿主互作分子机制并筛选高特异性药物靶点，已成为优化布鲁氏菌病综合防控体系的亟需突破的科研重点。
布鲁氏菌L7/L12基因是布鲁菌特有的保守基因，L7/L12蛋白作为高度保守的核糖体蛋白(分子量约10 kDa)参与布鲁氏菌胞内蛋白合成[4] [5]，L7/L12蛋白在羊、牛、猪或人体均表现出较高的免疫原性[6]-[10]，其结构与功能特性使其成为布病防控研究的关键靶标。该蛋白以四聚体形式存在于核糖体亚基，其N端与L10蛋白形成二聚体，C端通过与延伸因子EF-Tu/EF-G结合参与GTP水解供能[11]。免疫学研究表明，L7/L12的抗原表位主要位于亲水性氨基酸富集区域(80%以上)，作为T细胞优势抗原可特异性激活CD4+Th1细胞并诱导IFN-γ分泌，在细胞介导免疫中发挥核心作用[12]。相关实验证实，L7/L12能引发强效CMI反应[13]，显著增强小鼠抗布鲁氏菌攻毒能力，其真核表达载体虽诱导短期抗体应答，却为突破传统疫苗低细胞免疫缺陷提供了新策略。本研究鉴于L7/L12在布鲁氏菌各生物型中高达97.1%的基因同源性及显著的免疫保护效应，对羊种布鲁氏菌株的L7/L12蛋白进行生物信息学分析，深入解析其的抗原表位特征与免疫调控机制，对开发布鲁氏菌新型诊断试剂和疫苗提供理论基础。
2. 材料
羊种布鲁氏菌Brucella melitensis bv. 1株的L7/L12基因及其编码蛋白质氨基酸序列来自于NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)公布的基因组信息。L7/L12的基因ID为KF362131.1，该基因编码蛋白ID为AGZ13505.1。
3. 方法
3.1. L7/L12基因序列分析
从NCBI数据库中获得基因序列，使用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析其开放阅读框。
3.2. L7/L12蛋白的生物信息学分析
采用多种生物信息学工具对L7/L12蛋白的理化特性及结构特征进行系统性分析。首先，基于Expasy数据库的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)和ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)在线工具，对L7/L12蛋白的一级结构参数(如分子量、等电点等)及亲疏水性分布进行详细计算与评估。随后，利用SignalP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0)在线服务器对该蛋白的N端信号肽序列进行预测，以判断其是否存在潜在的分泌途径。在跨膜结构分析方面，采用TMHMM-2.0
(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)算法对L7/L12蛋白的跨膜螺旋区域进行精确识别，以明确其是否为膜结合蛋白。此外，借助NetPhos-3.1在线分析平台，对L7/L12蛋白序列中潜在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化修饰位点进行预测，以评估其可能的翻译后调控机制。
在蛋白结构预测方面，首先通过SOPMA
(https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)在线工具对L7/L12蛋白的二级结构组成(如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等)进行计算模拟；进一步利用SWISS-MODEL
(https://swissmodel.expasy.org/interactive)同源建模平台，基于已知的蛋白结构模板预测L7/L12蛋白的三维空间构象，以揭示其可能的生物学功能域。在免疫原性分析中，综合运用ABCpred和SYFPEITHI两种在线预测工具，分别对L7/L12蛋白的B细胞线性表位和T细胞MHC结合表位进行系统筛选，并依据软件设定的置信度阈值筛选出高评分抗原表位，为后续疫苗设计提供理论依据。
最后，在分子进化分析方面，通过NCBI数据库的BLAST工具对L7/L12蛋白序列进行同源比对，筛选高度相似的物种序列；基于MEGA 11.0软件的最大似然法(Maximum-Likelihood, ML)构建系统发育树，并通过Bootstrap检验(1000次重复)评估分支可靠性，进而探讨L7/L12蛋白在不同物种中的进化关系及保守性特征。
4. 结果
4.1. L7/L12蛋白的理化性质与一级结构
该蛋白的基因编码区包含375个碱基，翻译生成124个氨基酸的多肽链。氨基酸组成分析显示，丙氨酸(Ala)占比最高(24.2%，30个残基)，其次为谷氨酸(Glu，12.9%，16个)、赖氨酸(Lys，12.1%，15个)和亮氨酸(Leu，11.3%，14个)。蛋白分子表面电荷分布呈现极性特征，带正电荷残基16个，带负电荷残基22个。从分子结构来看，该蛋白由1813个原子构成，其化学式为C555H932N146O179S1。质谱分析测得相对分子质量为12546.44道尔顿。理论计算表明，该蛋白的等电点(pI)为4.79，提示其在生理pH条件下可能呈现负电性。光谱学特性显示，当消光系数为5500 M−1cm−1时，该蛋白在280 nm波长处的吸光度值为0.438。N端甲硫氨酸的存在使其预测半衰期达到30小时。通过生物信息学分析，该蛋白的脂肪族氨基酸指数为108.87，不稳定性指数仅为18.55 (<40)，表明其具有显著的结构稳定性。
4.2. L7/L12蛋白的亲疏水性
通过ProtScale工具对L7/L12蛋白的20种氨基酸进行亲疏水性分析，结果显示该蛋白的亲水性参数呈现明显特征性分布：最大亲水值为1.956，最小值为−1.856，平均亲水性指数为0.119。根据Hopp-Woods亲水性评价标准，该平均指数大于零的特征表明L7/L12蛋白整体呈现疏水特性。值得注意的是，蛋白序列中同时存在显著亲水区域(最高达1.956)和强疏水区域(最低至−1.856)，但整体仍以疏水性质为主导。这种特殊的亲疏水分布模式可能与其作为核糖体蛋白的结构特征和生物学功能密切相关，特别是其在蛋白质合成过程中与其他翻译因子的相互作用机制(图1)。
Figure 1. Distribution pattern of hydrophilic and hydrophobic regions in the L7/L12 protein molecule
图1. L7/L12蛋白分子中亲水性和疏水性区域的分布模式
4.3. L7/L12蛋白的二级结构
通过SOPMA在线工具对L7/L12蛋白进行二级结构预测，获得各结构元件的组成比例分别为(图2)：α-螺旋(Hh) 69.35%、无规则卷曲(Cc) 22.58%、β-折叠(Ee) 6.45%和β-转角(Tt) 1.61%。
4.4. L7/L12蛋白的信号肽、跨膜区及氨基酸磷酸化位点预测
信号肽(图3)及跨膜区(图4)分析结果显示，L7/L12蛋白不存在典型的信号肽序列，同时跨膜结构预测亦未检测到明显的跨膜结构域，表明该蛋白可能为非分泌型且非膜结合蛋白。进一步利用NetPhos3.1软件对磷酸化修饰位点进行预测(图5)，结果表明该蛋白存在3个潜在的丝氨酸(Ser)磷酸化位点和3个苏氨酸(Thr)磷酸化位点，提示L7/L12可能受到激酶介导的翻译后修饰调控。
Figure 2. Prediction analysis of the secondary structure of L7/L12 protein
图2. L7/L12蛋白二级结构的预测分析
Figure 3. Prediction of the signal peptide sequence in L7/L12 protein
图3. L7/L12蛋白信号肽序列的预测
Figure 4. Prediction of transmembrane regions in L7/L12 protein
图4. L7/L12蛋白的跨膜区预测
Figure 5. Bioinformatics prediction of phosphorylation sites in L7/L12 protein
图5. L7/L12蛋白磷酸化修饰位点的生物信息学预测
4.5. L7/L12蛋白的三级结构预测分析
采用SWISS MODEL蛋白质结构预测平台对L7/L12蛋白进行三级结构建模分析(图6)。建模过程以布鲁氏菌RL7_BRUO2结构域(模板编号A5VR16.1.A)为参考，获得高质量的三维结构模型。该预测模型显示两个重要质量参数：GMQE (全局模型质量评估)指数达到0.78，序列一致性(Identity)高达99.19%，充分证明所选模板与目标蛋白L7/L12具有极佳的结构相似性。这些参数表明，预测所得的三维结构模型能够准确反映L7/L12蛋白的真实空间构象特征。
Figure 6. Computational modeling and prediction of the tertiary structure of L7/L12 protein
图6. L7/L12蛋白三级结构的计算模拟与预测
4.6. L7/L12蛋白的抗原表位预测
采用ABCpred算法对L7/L12蛋白的B细胞抗原表位进行预测分析。在设定阈值为0.58的条件下，共鉴定出11个具有显著免疫原性的B细胞优势抗原表位(表1)。同时，运用SYFPEITHI平台对T细胞抗原表位进行系统预测，结果显示：当阈值设为21时，L7/L12蛋白存在7个HLA-A*02:01 nonamers限制性的CTL细胞抗原表位(表2)，以及19个HLA-DRB1*0101 15-mers限制性的Th细胞抗原表位(表3)。这些预测结果揭示了L7/L12蛋白潜在的免疫识别位点，为后续疫苗设计提供了重要参考依据。
Table 1. Prediction of B-cell antigenic epitopes in L7/L12 protein
表1. L7/L12蛋白的B细胞抗原表位预测
排序 |
抗原表位序列 |
氨基酸起始位置 |
评分 |
1 |
AAAAEEKTEFDVVLAD |
49 |
0.87 |
2 |
EAEKIKAQLEAAGAKV |
106 |
0.74 |
3 |
KDLVEGAPKAVKEGAS |
88 |
0.73 |
4 |
AVKEGASKDEAEKIKA |
97 |
0.70 |
5 |
DVVLADGGANKINVIK |
59 |
0.67 |
6 |
AAELSKLLEEKWGVSA |
19 |
0.67 |
7 |
GVSAAAPVAVAAAGGA |
31 |
0.66 |
8 |
TGLGLKEAKDLVEGAP |
80 |
0.64 |
9 |
GGANKINVIKEVRALT |
65 |
0.62 |
10 |
LLEEKWGVSAAAPVAV |
25 |
0.62 |
11 |
EDLSALTVLEAAELSK |
9 |
0.60 |
Table 2. Prediction of MHC-restricted CTL epitopes in L7/L12 protein
表2. L7/L12蛋白的限制性CTL细胞抗原表位预测
排序 |
抗原表位序列 |
氨基酸起始位置 |
评分 |
1 |
KIVEDLSAL |
6 |
26 |
2 |
KLLEEKWGV |
24 |
26 |
3 |
DLAKIVEDL |
3 |
25 |
4 |
QLEAAGAKV |
113 |
23 |
5 |
GLKEAKDLV |
83 |
22 |
6 |
LADGGANKI |
62 |
21 |
7 |
NVIKEVRAL |
71 |
21 |
Table 3. Prediction of MHC-restricted T-helper (Th) cell epitopes in L7/L12 protein
表3. L7/L12蛋白的限制性Th细胞抗原表位预测
排序 |
抗原表位序列 |
氨基酸起始位置 |
评分 |
1 |
IKEVRALTGLGLKEA |
73 |
36 |
2 |
LSALTVLEAAELSKL |
11 |
34 |
3 |
AKIVEDLSALTVLEA |
5 |
32 |
4 |
VRALTGLGLKEAKDL |
76 |
27 |
5 |
LTGLGLKEAKDLVEG |
79 |
27 |
续表
6 |
EKIKAQLEAAGAKVE |
108 |
27 |
7 |
EEKWGVSAAAPVAVA |
27 |
26 |
8 |
AAPVAVAAAGGAAPA |
35 |
26 |
9 |
KTEFDVVLADGGANK |
55 |
26 |
10 |
DVVLADGGANKINVI |
59 |
26 |
11 |
PVAVAAAGGAAPAAA |
37 |
25 |
12 |
MADLAKIVEDLSALT |
1 |
24 |
13 |
VEDLSALTVLEAAEL |
8 |
24 |
14 |
SKLLEEKWGVSAAAP |
23 |
24 |
15 |
AKDLVEGAPKAVKEG |
87 |
24 |
16 |
ANKINVIKEVRALTG |
87 |
24 |
17 |
INVIKEVRALTGLGL |
67 |
23 |
18 |
LEEKWGVSAAAPVAV |
70 |
23 |
19 |
KWGVSAAAPVAVAAA |
26 |
22 |
4.7. L7/L12蛋白的进化分析
基于MEGA11.0软件对L7/L12蛋白构建的分子进化树分析结果(图7)显示：羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis bv. 1)的L7/L12蛋白在系统发育上呈现出显著的种属特异性分布模式。该菌株与羊种布鲁氏菌疫苗株M5、犬布鲁氏菌(B. canis)、鳍足类布鲁氏菌(B. pinnipedialis)、牛种布鲁氏菌(B. abortus)以及猪种布鲁氏菌(B. suis)聚集成一个紧密的进化分支，表明这些菌株间存在较近的亲缘关系。值得注意的是，该进化分支与牛种布鲁氏菌疫苗株A19所属的进化支系明显分离，揭示了布鲁氏菌属内不同疫苗株间L7/L12蛋白的分子进化差异。这一发现为理解布鲁氏菌属的分子系统发育关系提供了重要线索。
Figure 7. Construction of the phylogenetic tree for L7/L12 protein using the Maximum-Likelihood (M-L) algorithm
图7. 采用M-L算法完成了L7/L12蛋白的系统进化树构建
5. 讨论
本研究综合运用多种生物信息学工具，对布鲁氏菌L7/L12蛋白的结构与功能进行系统分析，旨在深入解析其作为重要免疫靶点的分子基础，预测结果显示，该蛋白由124个氨基酸组成，具有稳定的疏水核心(亲水性均值0.119)和典型核糖体蛋白特征，α-螺旋占比69.35%，符合核糖体蛋白的典型结构特征，这种结构稳定性是其作为核糖体基本组分，持续参与蛋白质合成的重要保障。在理化性质方面，L7/L12蛋白表现出显著的结构稳定性特征。通过计算分析发现，其脂肪族氨基酸指数高达108.87，而不稳定性指数仅为18.55，远低于蛋白质不稳定性阈值40，这一结果充分证明了该蛋白在生理条件下的高度稳定性。
同时其无信号肽与跨膜区，预测存在6个磷酸化位点(3个丝氨酸、3个苏氨酸)，提示L7/L12蛋白的功能可能通过激酶介导的翻译后修饰参与调控。预测结果表明该蛋白缺乏典型的跨膜结构域，暗示其可能通过特定的转运机制定位至细胞膜表面，这一特性也解释了为何在感染宿主体内可长期检测到针对该蛋白的特异性抗体[14]。三级结构建模显示其结构高度保守(GMQE = 0.78)，表明预测模型具有高度可靠性，为理解其功能结构域和潜在的药物/表位结合位点提供了可靠的计算模型基础。
抗原表位预测筛选出11个B细胞表位(如AAAAEEKTEFDVVLAD，评分0.87)和26个T细胞表位，包括7个HLA-A*02:01限制性CTL表位(如KIVEDLSAL，评分26)及19个Th细胞表位(如IKEVRALTGLGLKEA，评分36)。这些表位多位于亲水区，符合抗原表位通常暴露于蛋白质表面的特征，理论上更容易被免疫系统识别，这些预测结果与既往实验研究报道的L7/L12蛋白具有强免疫原性的结论相呼应[6] [8]-[10] [12] [13]，例如，Kurar等[10]和曾政等[8]的研究表明L7/L12核酸疫苗能诱导免疫应答；Mallick等[9]利用重组L7/L12蛋白递送系统在小鼠模型中展示了保护效力；Huy等[13]的最新研究也证实包含L7/L12的多亚单位疫苗组合能有效诱导Th1免疫应答。本研究预测的丰富且高评分的T细胞表位(尤其是Th1型表位)，为解释L7/L12能有效诱导细胞介导免疫(CMI)，特别是激活CD4+ Th1细胞和促进IFN-γ分泌[12] [13]的分子机制提供了潜在的位点线索。且L7/L12蛋白在布鲁氏菌属内高度保守(基因同源性97.1%)，与羊种、牛种、猪种等毒力株聚为紧密分支，支持其作为广谱疫苗靶标的潜力，而疫苗株A19的分支差异提示人工传代可能导致功能微调。
综上，该研究为优化布鲁氏菌病防控策略奠定了重要理论基础，L7/L12蛋白的稳定结构、高保守性及显著免疫原性，为布鲁氏菌病新型疫苗(尤其是亚单位疫苗)和诊断试剂开发提供了关键分子靶点，这些发现不仅为深入理解布鲁氏菌的致病分子机制提供了新的线索，也为开发针对布鲁氏菌病的新型疫苗和诊断方法奠定了重要的理论基础[15] [16]。后续需通过ELISPOT、ELISA等实验验证表位免疫原性，并结合X射线晶体衍射或冷冻电镜技术解析其与EF-Tu/EF-G等互作蛋白的复合物结构，以明确其在布鲁氏菌胞内生存及致病中的具体机制。
NOTES
*通讯作者。