桩蛋白调控肝肺综合征大鼠血清诱导PASMCs的增殖和迁移

The Regulation of Paxillin on the Proliferation and Migration of PASMCs Induced by the Serum of Rats with HPS

摘要: 目的：评价桩蛋白(Paxillin)在肝肺综合征(HPS)大鼠血清诱导肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖和迁移中的作用。方法：选取20只雄性Sprague-Dawley大鼠，运用慢性胆总管结扎法构建HPS大鼠模型，并采集腹主动脉血样制备血清。将培养的大鼠PASMCs分别接种于6孔板、24孔板和96孔板，通过随机数字表法均分为2组：对照组(C组)和HPS组。C组添加正常大鼠血清，HPS组加入HPS大鼠血清，使两组血清终浓度均为5%。于细胞孵育24 h (T1)、48 h (T2)和72 h (T3)，采用RT-PCR法和Western blot法测定PASMCs内paxillin mRNA及其蛋白的表达水平；运用³H-TdR法检测PASMCs的增殖水平，借助Transwell小室(T1)及划痕实验(T1~T3)测定PASMCs的迁移水平。结果：与C组相比，HPS组PASMCs的增殖和迁移能力显著增强(P < 0.05)；且HPS组随着刺激时间的延长，paxillin mRNA及其蛋白表达呈现逐渐上调趋势(P < 0.05)。结论：在HPS大鼠血清刺激下，PASMCs中paxillin表达逐渐上调，这可能在HPS相关的PASMCs异常增殖和迁移过程中发挥重要的调节作用。

Abstract: Objective: To explore the mechanism of action of paxillin in the proliferation and migration of pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) induced by the serum of rats with hepatopulmonary syndrome (HPS). Methods: Twenty male Sprague-Dawley rats were selected. The HPS rat model was established by chronic common bile duct ligation, and abdominal aortic blood was collected to prepare serum. The cultured rat PASMCs were seeded into 6-well, 24-well, and 96-well plates respectively, and randomly divided into a control group (Group C) and an HPS group using the random number table method. Group C was supplemented with normal rat serum, while the HPS group was added with HPS rat serum, with the final serum concentration adjusted to 5% in both groups. At the time points of 24 h (T1), 48 h (T2), and 72 h (T3) of cell incubation, RT-PCR and Western blot were used to determine the expression levels of paxillin mRNA and protein in PASMCs. The ³H-TdR method was employed to detect the proliferation level of PASMCs, and the Transwell chamber (T1) and scratch assay (T1~T3) were used to measure the migration level of PASMCs. Results: Compared with Group C, the proliferation and migration abilities of PASMCs in the HPS group were significantly enhanced (P < 0.05). In the HPS group, the expression of paxillin mRNA and protein showed a gradually increasing trend with the extension of the stimulation time (P < 0.05). Conclusion: Stimulation by the serum of HPS rats can gradually upregulate the expression of paxillin in PASMCs, which may play a crucial regulatory role in the abnormal proliferation and migration of PASMCs associated with HPS.

1. 引言

肝肺综合征(HPS)是以慢性肝病、肺内微血管扩张和低氧血症为主要特征的临床综合征[1]。低氧血症引发的肺内低氧环境促使肺动脉平滑肌细胞发生表型转换，从血管中膜迁移至内膜并大量增殖和迁移；同时，病肝释放的多种循环细胞因子经血液作用于PASMCs，进一步加重其病理改变，这种肝源性肺血管重建是肝肺综合征的基本病理变化之一[2]。桩蛋白(Paxillin)是一种定位于黏着斑的磷酸蛋白，在多种细胞内的信号转导以及骨架蛋白与细胞外基质的联系中发挥“枢纽”作用[3]。本研究通过观察HPS大鼠血清诱导PASMCs增殖和迁移时paxillin的表达变化，深入探讨其在HPS相关肝源性肺血管重建中的作用机制。

2. 材料与方法

2.1. 主要实验材料和仪器

选用20只清洁级成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重220~250 g，由第三军医大学实验动物中心提供。实验材料包括：美国PAA公司的低糖DMEM培养基、美国Hyclone公司的D.Hanks液、英国Abcam公司的小鼠抗F-actin单克隆抗体、小鼠抗α-tubulin单克隆抗体、兔抗Destrin单克隆抗体，北京康为世纪生物科技有限公司的兔抗大鼠GAPDH一抗、HRP标记羊抗兔二抗、HRP标记大鼠抗小鼠二抗，美国康宁公司的Transwell小室，其余试剂均为国产分析纯。实验仪器有德国Herseus公司的二氧化碳恒温培养箱、美国Alpha Innotech公司的Imager凝胶成像分析系统等。

2.2. HPS大鼠模型建立

取30只健康SD大鼠(雌雄不拘，3~4月龄，体重220~250 g，购自第三军医大学实验动物中心)，参考文献[4]，采用慢性胆总管结扎法构建HPS模型。经腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.1 ml/100g)实施全身麻醉，于剑突下沿腹白线作约3 cm切口进腹，沿十二指肠暴露上段胆总管，在近肝门处及近十二指肠处分别结扎胆总管，随后剪断胆总管，分层缝合关腹。术后5周，采集1 ml腹主动脉血样进行动脉血气分析，其余血样离心后收集血清，处死大鼠并取肺组织，经多聚甲醛固定后制作病理切片，通过HE染色观察肺组织病理变化。以PaO₂ < 85 mmHg且肺泡–动脉血氧分压差 > 18 mmHg，同时伴有相应肺部病理改变作为HPS模型成功的判断标准。

2.3. 大鼠PASMCs培养及分组

依据文献[5]的组织块法对大鼠PASMCs进行原代培养，并完成纯化鉴定。选取第4~9代PASMCs用于实验，将细胞浓度调整为5 × 10⁵个/mL后，接种于6孔板和96孔板。采用随机数字表法将其分为对照组(C组)和HPS组，每组6孔板含18孔、96孔板含30孔。C组添加正常大鼠血清，HPS组加入HPS大鼠血清，利用低糖DMEM培养基将血清终浓度调节为5%。对两组细胞进行同步化处理后，分别在24 h (T1)、48 h (T2)和72 h (T3)三个时间点进行孵育。

2.4. RT-PCR法检测Paxillin mRNA的表达

在T1~T3各时间点，每组随机选取6孔板中的3孔，使用TRIzon Reagent法提取总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认无降解，利用紫外分光光度计测定纯度并定量，确保吸光度值(A₂₆₀/A₂₈₀)比值在1.85左右。取2 µg总RNA进行逆转录，随后各取5 µl逆转录产物进行PCR。以GAPDH作为内参照，paxillin上游引物：5'-CCAAACGGCCAGTGTTCTTG-3'，下游引物：5'-GGAACCACTAGGCTGCCATT-3'，扩增片段长度为167 bp；GAPDH上游引物：5'-TACGACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCTGTGGCTGTA-3'，扩增片段长度为493 bp。反应条件设定为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，退火30 s (paxillin退火温度58℃，GAPDH退火温度56℃)，72℃延伸60 s，共进行35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR结束后，取10 µl产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，借助Imager凝胶成像分析系统进行灰度扫描，以paxillin吸光度值与GAPDH吸光度值的比值反映其表达水平。

2.5. Western-Blot法检测Paxillin蛋白的表达

在T1~T3各时间点，每组随机选取6孔板中的3孔，加入蛋白裂解液(RIPA裂解液)，在冰上裂解细胞。随后以10,000 ×g离心20 min，取上清，用紫外分光光度计(美国PE公司)进行蛋白定量。取40 µg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白以恒流180 mA、电压上限70 V、转膜时间45 min的条件电转印至PVDF膜。将PVDF膜浸入含5%脱脂奶粉的溶液中封闭2 h，分别加入1:1000稀释的兔抗paxillin多克隆一抗(英国Abcam公司)、1:2000稀释的兔抗大鼠GAPDH一抗(北京康为世纪生物科技有限公司)，4℃孵育过夜。经TBS洗膜3次后，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(北京康为世纪生物科技有限公司)，室温孵育2 h，再次用TBS洗膜3次，进行DAB显色。利用Imager凝胶成像分析系统进行灰度扫描，以paxillin灰度值与GAPDH灰度值的比值反映其表达水平。

2.6. PASMCs增殖水平的检测

采用氚–胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)渗入法：在T1-T3各时间点，每组随机选取96孔板中的5孔(每孔200 µl)，每孔加入1µCi³H-TdR (北京原子能研究所)，培养6 h后，弃去培养液，用冷PBS液终止掺入。加入0.25%胰酶消化细胞使其脱离孔壁，使用多头细胞样品收集器将细胞收集至玻璃纤维膜上，经生理盐水冲洗、10%三氯乙酸固定、无水乙醇脱色后，于80℃干烤30 min，放入闪烁液中，通过液体闪烁计数仪测定放射性，以counts/min表示³H-TdR掺入率，以此反映PASMCs的增殖水平。

2.7. PASMCs迁移水平的检测

Transwell小室[6]：将孔径8.0 μm的Transwell小室插入24孔板，上室部分不涂基底胶。将大鼠PASMCs接种于上室，随机分为C组和HPS组，分别用正常和HPS大鼠血清孵育细胞24小时。孵育结束后，用棉签去除未穿过膜迁移至下室的细胞，对下室表面细胞进行结晶紫染色，在显微镜(ECLIPSETi-E)下以200倍放大倍数计数迁移到下室的细胞数量。划痕实验[7]：将大鼠PASMCs接种于6孔板(每孔1.50 × 10⁵个细胞)的玻璃盖玻片上，待细胞生长至汇合状态。随机分为C组和HPS组，血清剥夺24小时后，通过可重复使用的模板去除每组盖玻片中间部分细胞以制造标准伤口，分别用正常和HPS大鼠血清孵育两组细胞。在24 h (T1)、48 h (T2)和72 h (T3)，借助显微镜配备的十字线测量每组细胞迁移距离占初始距离(T0)的百分比(%)。

2.8. 统计学处理

运用SPSS13.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数 ± 标准差(x ± s)表示。组间比较采用成组t检验，组内比较采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. HPS大鼠模型制备及肺组织病理改变

HPS组11只大鼠符合模型制备成功标准；C组1只大鼠因麻醉因素死亡。HPS组形态学改变：肺体积增大，呈现充血、水肿状态。HPS组肺组织病理学改变：肺泡腔减小，肺间隔增宽且细胞数增多，以巨噬细胞为主；与C组大鼠肺组织比较，HPS组大鼠肺组织可见毛细血管显著扩张，肺间质纤维组织增生明显。

Table 1. Comparison of the transcription and expression levels of paxillin, as well as the proliferation and migration of PASMCs (n = 4, $\overline{x}\pm s$ )

表1. Paxillin转录及表达水平，以及PASMCs增殖和迁移情况比较(n = 4, $\overline{x}\pm s$ )

组别	时间	paxillin mRNA (%)	Paxillin蛋白(%)	PASMCs增殖情况	PASMCs迁移情况
				^3H-TdR渗入法(cpm)	Transwell小室(个数)	划痕实验(%)
C组	T1	35.3 ± 1.7	23.3 ± 1.2	6503.8 ± 319.0	23 ± 3	93.4 ± 4.2
	T2	37.6 ± 1.9	23.4 ± 0.9	7927.1 ± 150.1		69.0 ± 3.4
	T3	38.2 ± 0.8	25.5 ± 1.0	9223.9 ± 459.1		34.8 ± 4.6
HPS组	T1	39.2 ± 0.6^a	38.6 ± 1.5^a	8739.7 ± 181.9^a	49 ± 8^*	60.9 ± 0.9^a
	T2	63.2 ± 1.4^ab	49.0 ± 1.4^ab	11096.6 ± 292.3^ab		30.9 ± 3.3^ab
	T3	75.2 ± 1.0^abc	65.6 ± 0.6^abc	13253.7 ± 1178.1^abc		4.9 ± 1.6^abc

与C组同时相点比较，^aP < 0.05；与HPS组T1比较，^bP < 0.05；与HPS组T2比较，^cP < 0.05。

3.2. Paxillin转录及表达水平，以及PASMCs增殖和迁移情况

与C组相比，HPS组paxillin mRNA及其蛋白表达水平显著上调(P < 0.05)；且HPS组paxillin mRNA及其蛋白表达水平随着刺激时间的延长呈现逐渐上调趋势(P < 0.05)，具体结果见表1。与C组相比，HPS组PASMCs的增殖和迁移能力显著增强(P < 0.05)；HPS组PASMCs的增殖和迁移能力随着刺激时间的延长逐渐增强(P < 0.05)，详见表1。

4. 讨论

肝肺综合征是终末期肝病患者常见的临床综合征，具有高死亡率和难治性特点，深入研究其分子机制意义重大，其中PASMCs异常增殖和迁移是HPS重要的病理改变。既往研究表明，低氧等刺激因子可激活多条信号转导通路，最终导致PASMCs异常增殖和迁移，但信号转导通路复杂，阻断单一通路难以有效遏制HPS的发展。我们前期研究发现，低氧刺激下PASMCs中表型相关蛋白表达发生显著变化，推测该变化可能由细胞骨架重组引发，是PASMCs异常增殖和迁移的上游环节[8]。

本研究结果显示，HPS大鼠血清可诱导PASMCs增殖和迁移水平显著增强，同时paxillin mRNA及蛋白表达水平上调；并且随着刺激时间的延长，PASMCs迁移水平和paxillin mRNA及蛋白表达水平持续上升，提示HPS大鼠血清可能通过上调桩蛋白的表达，进一步诱导PASMCs的异常增殖和迁移。

桩蛋白是细胞骨架上的磷酸蛋白，分子量68~70 kD，定位于黏着斑。其结构包含LD、LIM、SH3及SH2等多种结构域，广泛存在于肝脏、肺脏等多种器官组织中，在多种细胞生物学功能调节中发挥重要作用，包括介导蛋白间相互作用、促进黏着斑激酶(FAK)磷酸化、作为接头蛋白促使骨架蛋白与适配器蛋白形成黏着斑复合物等[9]。有研究报道[10]，食管癌组织中paxillin的表达明显上调；Veith C.等[11]的研究表明，paxillin可促使FAK磷酸化激活，进而调节PASMCs的黏附、增殖和迁移。Paxillin作为黏着斑复合物的关键成分，对骨架蛋白和细胞外基质的连接起重要调节作用，与细胞骨架重组密切相关[12]。因此，paxillin可能通过调节细胞骨架蛋白的表达，促使细胞骨架重组，使细胞转变为合成表型，最终导致PASMCs异常增殖和迁移。

综上所述，HPS大鼠血清诱导PASMCs增殖和迁移时，桩蛋白表达上调，这一变化可能是HPS相关肝源性肺血管重建的重要机制之一。

基金项目

重庆市自然科学基金项目(CSTB2022NSCQ-MSX0218)；重庆市科卫联合面上项目(2025MSXM012)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。