1. 引言
云木香(Saussurea costus (Falc.) Lipsch.)又名木香、广木香、青木香，是菊科(Asteraceae)风毛菊属(Saussurea DC.)植物，入药部位为干燥的根，其性温，味辛、苦，归胃、脾、肝、大肠经，临床上多用于治疗健脾消食、行气止痛、止泻等症状[1]。现代药理研究表明，主要含挥发油、木香碱、菊糖及甾醇等化学成分，木香烃内酯和去氢木香内酯为主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、肝保护和免疫调节等作用[2]。云木香是云南省十大道地药材之一，主要产地为高海拔地区。云木香环境适应性强，植株高大，生长迅速，这些特点说明云木香内部可能蕴含着丰富多样的内生菌资源，因此有必要对云木香内生菌情况进行全面剖析。
植物内生菌是一种在植物体内生长旺盛的有益植物微生物，可以在正常和具有挑战性的条件下促进植物的生长，是植物微生态系统的重要组成部分[3]。传统微生物分离方法是最早用于了解微生物群落结构的方法，但是由于其工作量大，且无法分离相对丰度较低的大部分微生物，不能全面反映菌群结构，因而存在一定的局限性[4]。随着分子生物学技术的不断发展，高通量测序技术已经成为研究微生物的一种重要手段，与传统分离方法相比，高通量测序技术能够更加精确地揭示内生菌群落的种类多样性，可以直观地呈现微生物群落结构信息[5]-[7]。目前，关于云木香微生物菌群多样性研究鲜见报道。本研究利用Illumina Miseq高通量测序技术对药用植物云木香根、叶、种子3个样品中内生细菌和内生真菌的群落结构及多样性进行分析，并采用传统组织分离法从云木香植株中初步分离出部分可培养的内生菌菌株，希望为进一步研究云木香内生菌资源奠定基础。
2. 材料和方法
2.1. 样品采集
本实验所用云木香植株采集自云南丽江中药种植基地，采集样品为健康生长的植株。经云南中医药大学赵爽副教授鉴定为菊科植物云木香。
2.2. 样品处理
采集的云木香植株用流水洗净泥土后晾干，将根切成0.5~1.0 cm的小段，叶切成1 cm2的小块。把根、叶、种子分别浸泡在75%的乙醇3 min、1 min、5 min，后用无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干置于无菌离心管中，−80℃保存备用。
2.3. DNA提取和PCR扩增
利用MN NucleoSpin 96 Soi试剂盒对样本基因组DNA进行提取，之后利用1.0%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行检测，作为细菌16S rDNA和真菌ITS的PCR扩增模板。利用引物338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'对内生细菌16S rRNA V3-V4区进行PCR扩增。利用引物ITS1F 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS2 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'对内生真菌ITS区进行PCR扩增。PCR扩增产物寄送至北京百迈客生物科技有限公司，使用Illumina公司的Novaseq 6000平台进行测序。
2.4. 云木香中微生物的分离
所需培养基：PDA固体培养基、RBC琼脂培养基(孟加拉红培养基)、LB固体培养基、CDA培养基(察式琼脂培养基)和WA培养基(水琼脂培养基)。
新鲜的云木香植株用清水冲洗表面，在流水下冲洗1 h。将云木香植株和种子于超净工作台上用75%乙醇浸泡30 s，无菌水清洗3次，用4%的次氯酸钠浸泡叶1 min，根5 min，种子10 min，无菌水清洗8次后，取出，置于滤纸上吸干水分。保留最后一次清洗的无菌水，涂布于LB固体培养基上检测是否消毒彻底。
用无菌小刀将植株组织切割成1 cm的组织小块，将种子剥去外皮并切碎，无菌镊子挑取相应的组织分别接种于提前灭菌备好的各固体培养基上，在28℃恒温培养箱观察培养，待组织周围长出单个菌落时，挑选形态不同的单个菌落接种于PDA固体培养基和LB固体培养基，进行纯化培养。
无菌条件下将活化后的菌液与无菌的50%甘油1:1等体积混合于离心管中，置于−80℃冰箱长期保存。
2.5. 菌种鉴定
采用16S rDNA和ITS对云木香内生细菌进行分析生物学鉴定，用DNA提取试剂盒提取菌株的DNA，利用引物对内生细菌和内生真菌进行PCR扩增。PCR扩增产物寄送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对。
2.6. 数据处理
使用FLASH软件对原始数据进行拼接，Trimmomatic将拼接得到的序列进行质量过滤，UCHIME去除嵌合体，最后得到高质量的Tags序列。USEARCH软件在相似性97%的水平上对序列进行聚类，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU。利用软件进行物种注释以及丰度分析，可以揭示样品的物种构成；进一步进行α多样性分析、β多样性分析、显著物种差异分析、相关性分析、功能预测分析等，可以挖掘样品之间的差异。
3. 结果与分析
3.1. 云木香内生菌OTUs分析
根据图1可知，云木香内生细菌OTUs总数为6454个，其中根、叶和种子分别含有2359、1925、2717个，3个组织共有内生细菌OTUs 99个；种子特有OTUs数量最多，为2409个，根次之，叶特有OTUs数量最少。云木香内生真菌OTUs总数为3632个，其中根、叶和种子分别含有694、2349、774个，3个组织共有内生真菌OTUs 29个；叶特有OTUs数量最多，为2215个，种子次之，根特有OTUs数量最少。
(a) (b)
注：G：根，Y：叶，Z：种子。
Figure 1. OTUs distribution Venn diagram. (bacteria (a), fungi (b))
图1. OTUs分布韦恩图(细菌(a)，真菌(b))
3.2. 云木香内生菌群落Alpha多样性分析
在一定范围内，随着测序条数的加大，若曲线表现为急剧上升则表示群落中有大量物种被发现；当曲线趋于平缓，则表示此环境中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多。稀释曲线可以作为对各样本测序量是否充分的判断，线急剧上升表明测序量不足，需要增加序列条数；反之，则表明样品序列充分，可以进行数据分析。图2显示，真菌和细菌的稀释曲线先上升后趋于平缓，表示本研究取样数据合理。
(a)
(b)
注：G：根，Y：叶，Z：种子。
Figure 2. Dilution curves of leaves, roots and seeds of S. costus. (bacteria (a), fungi (b))
图2. 云木香叶、根和种子稀释曲线(细菌(a)，真菌(b))
Alpha多样性反映的是单个样品物种丰富度及物种多样性，有多种衡量指标。Chao1和ACE指数衡量物种丰富度即物种数量的多少[8]。Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰富度和物种均匀度的影响[9] [10]。Shannon指数和Simpson指数值越大，说明样品物种多样性越高。另外还统计了覆盖率(Coverage)，其数值越高，则样本中物种被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低，指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。
由表1可知，6个样品的Coverage指数均高于99.9%，表明测序深度能覆盖云木香样品中的大部分物种。云木香种子内生细菌的Chao1指数和ACE指数均高于根和叶，但是Shannon指数和Simpson指数却低于根和叶。而叶内生真菌的Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数均高于根和种子。表明云木香种子的内生细菌丰富度高于根和叶，多样性低于根和叶；叶的内生真菌丰富度和多样性均高于根和种子。
Table 1. Alpha diversity analysis of endophytic community in S. costus
表1. 云木香内生菌群落的Alpha多样性分析
基因 |
组别 |
Chao1指数 |
ACE指数 |
Shannon指数 |
Simpson指数 |
Coverage指数 |
16S rDNA |
G |
943.09 |
943.78 |
7.59 |
0.98 |
0.99 |
Y |
752.73 |
753.20 |
7.66 |
0.96 |
1.00 |
Z |
951.68 |
951.94 |
7.04 |
0.94 |
1.00 |
ITS |
G |
252.69 |
252.96 |
6.06 |
0.96 |
0.99 |
Y |
1008.59 |
1009.91 |
8.37 |
0.99 |
0.99 |
Z |
274.33 |
274.45 |
4.02 |
0.81 |
1.00 |
3.3. 云木香内生菌群落结构组成
3.3.1. 云木香内生细菌群落结构组成
在门分类水平上，如图3(a)所示，云木香内生细菌相对丰度前10的优势菌群分别为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、粘球菌门(Myxococcota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadota)、蛭弧菌门(Bdellovibrionota)、酸酐菌门(Acidobacteriota)、硝化螺旋菌门(Nitrospirota)、未分类的细菌(unclassified_Bacteria)，其相对丰度分别为74.81%、8.34%、5.81%、3.47%、2.19%、1.32%、0.93%、0.81%、0.43%、0.40%。云木香三个组织内生细菌相对丰度最高的都为变形菌门(Proteobacteria)，根部其次的优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidota)，叶和种子为厚壁菌门(Firmicutes)，表明云木香三个组织的优势菌门都是变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Bacteroidota)、拟杆菌门(Firmicutes)。
在属水平上，如图4(a)所示，云木香叶内生细菌中可被分类出来的相对丰度最高的为变形菌门中的埃希氏–志贺氏菌属(Escherichia_Shigella)，相对丰度为16.28%；其次为马赛菌属(Massilia)、布赫纳氏菌属(Buchnera)，相对丰度为9.64%和5.33%。根部内生细菌中可被分类出来的相对丰度最高的为根瘤菌属(Rhizobium)，相对丰度为8.88%；其次为杜檊氏菌属(Duganella)、假单孢菌属(Pseudomonas)，相对丰度为7.42%和7.02%。种子内生细菌中可被分类出来的相对丰度最高的为泛菌属(Pantoea)，相对丰度为23.47%；其次为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单孢菌属(Pseudomonas)，相对丰度为12.59%和3.73%。其中，布赫纳氏菌属只在云木香叶中检测到。
(a)
(b)
注：G：根，Y：叶，Z：种子。
Figure 3. Species composition of endophytic bacteria and fungi at phylum level in S. costus (bacteria (a), fungi (b))
图3. 云木香内生细菌和内生真菌门水平物种组成(细菌(a)，真菌(b))
(a)
(b)
注：G：根，Y：叶，Z：种子。
Figure 4. Species composition of endophytic bacteria and fungi at genus level in S. costus. (bacteria (a), fungi (b))
图4. 云木香内生细菌和生真菌属水平物种组成(细菌(a)，真菌(b))
3.3.2. 云木香内生真菌群落结构组成
在门分类水平上，如图3(b)所示，云木香叶内生真菌中可分类的相对丰度最高的为子囊菌门(Ascomycota)，其相对丰度为60.67%；其次为担子菌门(Basidiomycota)，相对丰度为21.96%；被孢霉门(Mortierellomycota)，相对丰度为5.93%。根部内生真菌中可分类的相对丰度最高的为子囊菌门(Ascomycota)，相对丰度为33.47%；其次为球囊菌门(Glomeromycota)，相对丰度为32.76%；担子菌门(Basidiomycota)，相对丰度为20.29%。种子内生真菌中可分类的相对丰度最高的为子囊菌门(Ascomycota)，相对丰度为90.85%；其次为担子菌门(Basidiomycota)，相对丰度为6.78%；被孢霉门(Mortierellomycota)，相对丰度为0.49%。表明云木香各组织中真菌群落中的优势菌门均含有子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。
在属水平上，根据图4(b)所示，云木香叶内生真菌中可被分类出来的相对丰度最高的为被孢霉属(Mortierella)，相对丰度为5.89%，其他优势菌属有镰刀菌属(Fusarium)和曲霉属(Aspergillus)，相对丰度为5.16%和3.51%。根部内生真菌中可被分类出来的相对丰度最高的为黑蛋巢菌属(Cyathus)，相对丰度为7.31%，其他优势菌属有斗管囊霉属(Funneliformis)和油壶属(Olpidium)，相对丰度为7.20%和6.45%。种子内生真菌中可被分类出来的相对丰度最高的为镰刀菌属(Fusarium)，相对丰度为49.26%，其他优势菌属有链格孢属(Alternaria)和曲霉属(Aspergillus)，相对丰度为13.74%和3.93%。其中，黑蛋巢菌属只在云木香根中检测到。
3.4. 云木香内生菌功能预测
根据样品在数据库中的功能注释及丰度信息，基于KEGG pathway，运用PICRUSt2选取丰度排名前30的功能信息对云木香内生细菌群落进行功能预测，结果如图5(a)，可见代谢相关基因的丰度在三组样本中最高，达到76%；其次是环境信息处理，达到8%。2级KEGG通路分析如图5(b)所示，所有细菌种群都存在全局和概述图谱和碳水化合物代谢相关的基因，且相对丰度 > 8%。此外，氨基酸代谢、膜转运、能量代谢以及辅因子和维生素代谢的功能丰度较其他功能最高。功能组成的多样性说明云木香内生细菌可能有多种信号通路，其中代谢是其主要的生理活动。
通过FUNGuild数据库内生真菌群落功能预测，如图5(c)和图5(d)所示，从营养类型看，叶中腐生型占比最大，为54%，其次病理寄生型，为36%；根中共生型占比最大，为53%，其次为腐生型，为28%；种子中占比最大的依次为病理寄生型和腐生型，分别为55%和30%。根据Guild分类，除未定义腐生菌和其他菌外，叶中的植物病原菌、动物病原菌、木腐菌，分别为23%、15%；根中的丛枝菌根、植物病原菌、粪便腐生菌，分别为37%、12%、11%；种子中的植物病原菌、附生真菌，分别为45%、12%，以上功能菌群在各组织Guild分类中的占比最高，且超过10%。
3.5. 云木香中微生物的分离鉴定
利用PDA固体培养基、RBC琼脂培养基、LB固体培养基、CDA培养基和WA培养基对云木香不同部位的微生物进行分离，初步获得52株细菌，33株真菌，经分子鉴定得到20株细菌(表2)，16株真菌(表3)。其中从种子中分离得到10株细菌，11株真菌；从根中分离得到9株细菌，3株真菌；从叶中分离得到1株细菌，2株真菌。根据不同培养基分离得到的微生物数量来看，LB培养基和PDA培养基是最适合云木香微生物分离的固体培养基。
根据表2数据显示，从云木香中分离得到的20株细菌，在分类学上分别属于11个属3个门，其中芽孢杆菌属和假单孢菌属最多，其次为肠杆菌属、寡养单胞菌属、农杆菌属等其他属；变形菌门和厚壁菌门最多，其次是拟杆菌门。该结果与上述内生细菌多样性组成结果大致相同。
根据表3数据显示，从云木香中分离得到的16株真菌，在分类学上分别属于8个属2个门，其中链格孢属和镰刀菌属最多，其次为曲霉属等其他属；子囊菌门最多，其次为担子菌门。该结果与上述内生真菌多样性组成结果基本相同。
(a)
(b)
(c)
(d)
注：G：根，Y：叶，Z：种子。
Figure 5. Functional prediction of endophytic bacteria and fungi in S. costus ((a): Bacterial function prediction-level 1, (b): bacterial function prediction-level 2, (c): fungal function prediction-Trophic, (d): Fungal function prediction-Guild)
图5. 云木香内生菌功能预测((a)：细菌功能预测–第一级，(b)：细菌功能预测–第二级，(c)：真菌功能预测-Trophic，(d)：真菌功能预测-Guild)
Table 2. Isolation and identification results of endophytic bacteria in S. costus
表2. 云木香内生细菌分离鉴定结果
菌株Strain |
培养基Medium |
门Phyla |
属Genus |
种Species |
Z-1 |
LB |
变形菌门Proteobacteria |
肠杆菌属Enterobacter |
Enterobacter kobei |
Z-7 |
CDA |
Enterobacter ludwigii |
Z-4 |
CDA |
寡养单胞菌属Stenotrophomonas |
Stenotrophomonas rhizophila |
G-8 |
LB |
Stenotrophomonas maltophilia |
Z-20 |
LB |
假单孢菌属Pseudomonas |
Pseudomonas koreensis |
Y-4 |
CDA |
Pseudomonas putida |
G-1-1 |
WA |
Pseudomonas gessardii |
G-6 |
WA |
农杆菌属Agrobacterium |
Agrobacterium sp. |
G-16 |
WA |
Agrobacterium tumefaciens |
G-12 |
LB |
无色杆菌属Achromobacter |
Achromobacter xylosoxidans |
G-13 |
LB |
根瘤菌属Rhizobium |
Rhizobium sp. |
G-2 |
CDA |
泛菌属Pantoea |
Pantoea agglomerans |
Z-21 |
CDA |
厚壁菌门Firmicutes |
芽孢杆菌属Bacillus |
Bacillus pumilus |
Z-9 |
WA |
Bacillus sp. |
G-4 |
WA |
Bacillus safensis |
Z-6 |
LB |
Bacillus subtilis |
Z-3 |
LB |
Bacillus altitudinis |
Z-11 |
LB |
类芽孢杆菌属Paenibacillus |
Paenibacillus sp. |
Z-12 |
CDA |
普李斯特氏菌属Priestia |
Priestia sp. strain |
G-1 |
LB |
拟杆菌门Bacteroidetes |
鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium |
Sphingobacterium canadense |
注：Z表示种子中内生菌，G表示根中内生菌，Y表示叶内生菌。
Table 3. Isolation and identification results of endophytic fungi from S. costus
表3. 云木香内生真菌分离鉴定结果
菌株Strain |
培养基Medium |
门Phyla |
属Genus |
种Species |
Z-6 |
RBC |
子囊菌门Ascomycota |
链格孢属Alternaria |
Alternaria sp |
Z-7 |
RBC |
Alternaria tenuissima |
Z-4 |
RBC |
Alternaria alstroemeriae |
Z-12 |
PDA |
Alternaria sp. |
Z-13 |
PDA |
Alternaria alternata |
Z-10 |
PDA |
镰刀菌属Fusarium |
Fusarium citricola |
Z-3 |
PDA |
Fusarium sp. |
G-1 |
WA |
Fusarium redolens |
Z-4-1 |
PDA |
Fusarium tricinctum |
Z-4-2 |
PDA |
曲霉属Aspergillus |
Aspergillus fumigatus |
Z-1 |
PDA |
Aspergillus sp. |
G-3 |
RBC |
格孢菌属Pleosporales |
Pleosporales sp. |
Y-1 |
RBC |
毛壳菌属Chaetomium |
Chaetomium globosum |
Z-11 |
RBC |
普氏壳属Plectosphaerella |
Plectosphaerella cucumerina |
Y-2 |
PDA |
青霉属Penicillium |
Penicillium chermesinum |
G-3-1 |
RBC |
担子菌门Basidiomycota |
丝核菌属Rhizoctonia |
Rhizoctonia sp. |
注：Z表示种子中内生菌，G表示根中内生菌，Y表示叶内生菌。
4. 讨论与结论
植物内生菌作为微生物中的重要组成部分，在宿主和生态系统中发挥着重要的作用，群落结构的组成是其功能发挥的基石，因此，研究植物内生菌的群落结构有助于挖掘和分析其生态功能[11]。云木香是云南省十大道地药材之一，其独特的生长特点说明云木香内部可能蕴含着丰富多样的内生菌资源，因此对云木香内生菌资源进行全面分析非常必要。
利用高通量测序技术对云木香叶、根和种子内生细菌群落结构进行研究，结果发现，云木香种子内生细菌的丰富度高于根和叶，说明云木香种子里可能有大量促进种子萌发的内生细菌，但是随着植株的生长发育，内生菌通过代谢或传递而减少，可能是因为部分内生菌可以通过水平传播和垂直传播从种子进入植株，种子内生菌相较于其他部位内生菌，具有高度适应植物组织生活的定殖优势[12] [13]。根中内生细菌群落丰富度和多样性均高于叶，与党参(Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.) [14]、大麻(Cannabis sativa L.) [15]、南阳艾(Artemisia argyi Lévl. et Vant.) [16]中内生细菌群落多样性分析结果一致，推测可能是由于土壤中含有大量的微生物，随着植物的生长，根部可以通过释放分泌物招募特定菌群来促进植物生长。变形菌门为云木香植株的优势细菌门，埃希氏-志贺氏菌属和泛菌属是云木香植株的优势细菌属。已有研究证明变形菌门的微生物具有较强的固氮能力，并且可以适应高紫外线和抗干旱的能力，因此推测变形菌门是使云木香得以在高海拔和寒冷地区生长的重要因素[17] [18]；泛菌属在植物中广泛存在，可以作为生防菌、产生植物激素促进植物生长等作用，同时具有一定的致病性[19]。通过功能预测分析了云木香不同组织内生微生物群落的功能特征，结果显示，代谢和环境信息相关功能是最主要一级功能分类，这些功能承担了生命体所需的绝大多数基础生物学功能和生理活动[20]。全局和概述图谱和碳水化合物代谢是最主要二级功能分类。
对云木香叶、根和种子内生真菌群落结构进行研究发现，叶内生真菌的丰富度和多样性高于根和种子，与明日叶(Angelica keiskei (Miq.) Koidz.) [21]、蛇足石杉(Huperzia serrata.) [22]、肉桂(Cinnamomum cassia Presl) [23]中内生真菌群落多样性分析结果一致。这可能是因为叶除了从茎部获得真菌外，外界空气、雨水和其他因素也会携带真菌到叶上，进入植物体内[20]，而云木香植株格外高大，叶片庞大，所以导致云木香叶内生真菌的丰富度远远大于根和种子。而根的丰富度要大于种子，多样性却小于种子，可能是因为根内生真菌不容易受外界环境的影响而产生多样性变化。子囊菌门为云木香植株的优势真菌门，镰刀菌属和链格孢属是云木香植株的优势真菌属。子囊菌门微生物可以分解土壤中的有机质和无机物，对于陆地植物生态系统的养分循环具有重要作用[24]，所以推测子囊菌门可以在一定程度上通过促进根部吸收而促进植物生长。链格孢属会引起真菌毒素积累，从而影响植物次生代谢[25]；功能预测结果发现云木香植株中包含腐生型、病理寄生型、共生型等三大真菌类群，且以腐生型为主要响应功能群。一般来说，腐生营养型真菌大多归属为子囊菌门，在分解土壤有机质和营养物质循环方面起重要的作用[26]。
从云木香植株中分离得到的可培养内生细菌中，根的优势菌属是农杆菌属，种子的优势菌属是芽孢杆菌属，叶的优势菌属是假单胞菌属。其中农杆菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属都是常见的植物促生菌株[27] [28]。从云木香植株中分离得到的可培养内生真菌中，根的优势菌属是镰刀菌属、格孢菌属和丝核菌属，种子的优势菌属是链格孢属，叶的优势菌属是青霉属。其中镰刀菌属、链格孢属、丝核菌属、青霉属都是常见的致病菌[29] [30]。
本研究应用高通量测序技术对药用植物云木香根、叶和种子中的内生细菌和内生真菌进行了多样性分析，发现云木香中蕴含着丰富的内生菌资源。并采用组织分离法从云木香植株中初步分离出部分可培养的内生菌菌株，后续会不断优化培养基和分离条件，对不同时期、不同产地的云木香植株进行内生菌的分离培养，同时对已经分离纯化的内生菌菌株进行功能验证。本研究较为全面地分析了云木香不同组织内生细菌和内生真菌的群落结构和功能差异，丰富了云木香内生菌资源信息，为将来开发利用云木香内生菌资源提供理论依据。
NOTES
*通讯作者。