1. 引言
肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia, KP)是呼吸道感染最常见的病原菌之一，主要通过接触和空气传播，具有较强的致病性，危害人类健康。实验大、小鼠在机体免疫功能下降或处于应激状态时感染此菌，会影响动物健康以及干扰动物实验，严重时甚至造成动物死亡[1]。近几年我国实验动物质量监测结果显示，肺炎克雷伯杆菌是目前啮齿类实验动物感染率较高的病原体[2] [3]。我校实验动物中心在新进动物质量控制过程中，从国内供应商以及其他机构引进的实验动物中曾多次检出肺炎克雷伯杆菌，对我中心的实验动物存在一定的安全隐患。
肺炎克雷伯杆菌常见的检测方法有分离培养、生化鉴定等国标方法以及PCR等分子核酸检测技术。培养方法虽然经典，但是操作繁琐，检测周期比较长。PCR技术灵敏度高，特异性好，在核酸诊断中应用最为广泛。但是PCR技术存在对温控设备过度依赖，扩增时间长，对专业要求高，难以应用于现场检测等缺点[4]。然而准确的判定致病微生物来源具有时间关键性(Time critical) [5] [6]，若不能及时得到检测结果，很可能错过最佳时机。因此开发更为快速、操作简单、灵敏度高、特异性强的新一代检测技术，是分子检测领域不断追求的目标[7] [8]。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是一种新型的等温扩增新技术，具有扩增时间短、对设备要求低、操作简易等特点。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein, Cas)系统，简称CRISPR/Cas系统是一系列由RNA引导的核酸内切酶，存在于约40%的细菌和90%的古细菌中，是细菌抵御外源物质(如噬菌体和质粒)入侵的获得性免疫系统[9]。现有多种类型的CRISPR/Cas系统，包括Cas9、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14用于细菌、病毒和寄生虫检测[10]。Cas12又称为Cpf1，是属于II类V型CRISPR/Cas系统的核酸内切酶。Cas12a在执行靶向切割dsDNA的功能时，通过RNA引导的DNA结合来进行任意单链DNA切割活动从而完全降解单链DNA分子。CRISPR/Cas12系统通过改变引导RNA (guide RNA, gRNA)序列，达到易被重新编码以检测目标核酸的目的，并且对外源核酸高度特异，不对内源DNA和转录产物造成损害，在室温下即可反应[11] [12]，已被逐渐应用到识别核酸检测的生物传感器中[13]。因此，利用此切割活性，能够有效识别和降解反应体系中目的靶标的单链DNA分子，从而完成对病原微生物的快速检测[14] [15]。
本研究通过RPA等温扩增技术放大待测靶标基因，利用Cas12a蛋白的反式切割(trans-cleavage)活性有效识别和降解反应体系中目的靶标的单链DNA分子。当Cas12a蛋白与靶标序列进行碱基互补配对形成crRNA-CRISPR/Cas12a-DNA三元复合物后，该复合物能够激活Cas12a蛋白的反式剪切活性，对反应体系内任意的ssDNA进行反式切割。在ssDNA的两端加入荧光显色基团与淬灭基团，通过检测荧光信号强度实现对靶标序列的检测。通过RPA和CRISPR-Cas12a技术相融合，建立PRA-CRISPR/Cas12a检测体系，实现对肺炎克雷伯杆菌实时、准确、快速的检测，为实验动物病原微生物监测领域提供重要的快速检测技术手段。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
本实验所用实验动物饲养于上海交通大学实验动物中心SPF屏障设施内，使用许可证编号为[SYXK (沪) 2023-0042]。本研究方案经上海交通大学实验动物伦理与使用委员会(IACUC)批准，并获取研究计划编号(A2024073)。
2.2. 菌株
本实验所用肺炎克雷伯杆菌(ATCC 46117)和金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)购自广东省微生物菌种保藏中心，绿脓杆菌和嗜肺巴斯德杆菌由本实验室分离保存。肺炎链球菌(ATCC 49619)、鼠伤寒沙门氏菌(SL 1344)、大肠杆菌(CMCC 44102)由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠。
2.3. 主要试剂与仪器
营养肉汤培养基购自海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒和100 bp DNA Ladder均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；2x ES Tag Master Mix (Dye)购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖和Sybr safe核酸染料购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。T7 RNA聚合酶体外转录试剂盒，Lb Cas12a Nucleas和单链DNA寡核苷酸探针购自上海吐露港生物技术有限公司；RPA等温扩增试剂盒购于英国TwistDX公司；ERA基础型核酸扩增试剂盒购自苏州先达基因科技有限公司；新加坡ESCO Class Ⅱ BSC 生物安全柜；德国Eppendorf Innova 40恒温摇床；美国Thermo NanoDrop 2000分光光度计；美国Bio-Rad CFX Opus 96实时荧光定量PCR仪、S1000 PCR仪和Gel Doc imaging System；德国Eppendorf 5425R台式低温高速离心机；上海长肯试验设备有限公司DNP-9082-1A微生物培养箱。
2.4. 实验方法
2.4.1. 基因组DNA的提取
细菌DNA试剂盒提取法：将KP接种于营养肉汤液体培养基中，于恒温摇床中，37℃，180 r/min，培养16 h。按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。
粪便DNA试剂盒提取法：用粪便基因组DNA提取试剂盒按照说明书提取粪便样本中的DNA并于−20℃保存备用。
粪便DNA培养煮沸法：用无菌枪头沾取少量新鲜粪便样本分别接种普通营养肉汤培养基，37℃，180 r/min培养16~18 h，取1 mL菌液经4℃、8000 r/min离心3 min后弃上清，加入100 μLTE，100℃煮沸2 min后放冰上5 min，4℃、12000 r/min离心5 min后取上清后于−20℃保存备用。
提取的DNA用NanoDrop 2000 分光光度计测定浓度，并于−20℃冰箱保存备用。
2.4.2. RPA引物、crRNA及ssDNA荧光探针的设计及合成
在GenBank网站获得KP的phoE基因序列，DNA STAR进行序列比对分析，选择基因的特异性保守位点，根据RPA引物设计原则，使用Primer 5.0软件设计RPA上下游引物(见表1)。根据Cas12a蛋白crRNA识别靶序列的特性，在RPA扩增靶标基因序列中设计crRNA (见表2)。在ssDNA的两端加入荧光显色基团(FAM)与淬灭基团(BHQ1)制备荧光探针。
Table 1. The RPA primer sequences
表1. RPA引物序列表
引物序号 |
引物名称 |
引物序列(5’-3’) |
产物长度 |
RPA-PhoE1 |
RPA-PhoE-1F |
CTACCTGGCGACCATGTACTCTGAAACCCG |
134 bp |
RPA-PhoE-1R |
CATAGCCGAGGGACGGACGCAGACCGAAGT |
RPA-PhoE2 |
RPA-PhoE-2F |
ATGTACTCTGAAACCCGCAAGATGACCCCG |
121 bp |
RPA-PhoE-2R |
CATAGCCGAGGGACGGACGCAGACCGAAGT |
RPA-PhoE3 |
RPA-PhoE-3F |
CATGTACTCTGAAACCCGCAAGATGACCCC |
122 bp |
RPA-PhoE-3R |
CATAGCCGAGGGACGGACGCAGACCGAAGT |
Table 2. The crRNA primer sequences
表2. crRNA引物序列表
crRNA |
引物名称 |
引物序列(5’-3’) |
碱基数 |
crRNA1 |
T7-12a-F |
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAATTTCTACTAAGTGTAG |
43 |
Spacer-1-R |
TCAAAGTTCTGCGCTTTGTTGGCATCTACACTTAGTAGAAATTCC |
45 |
crRNA2 |
T7-12a-F |
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAATTTCTACTAAGTGTAG |
43 |
Spacer-2-R |
GATCAGCGGCGGCTTTGCCAACATCTACACTTAGTAGAAATTCCC |
45 |
2.4.3. RPA扩增体系的建立
PCR验证引物特异性：以KP基因组DNA为模板，先用普通PCR方法，对设计的RPA引物特异性进行验证。PCR反应采用50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃共六个退火温度进行扩增。PCR扩增体系(20 uL)包括：2 × ES Tag Master Mix (Dye) 10 uL，引物浓度0.30 umol/L，DNA模板20 ng。反应条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃~60℃退火30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证扩增效果。
RPA扩增：以KP基因组DNA为模板进行RPA扩增，RPA扩增体系(50 uL)包括：溶解剂20 uL，上下游引物(10 uM)各2.5 uL，DNA模板2 uL，无酶水21 uL。将上述预混液转移至冻干反应管中混匀并短暂离心，然后在管盖上加入2 uL激活剂，小心盖紧管盖，短暂振荡混匀并瞬时离心。RPA反应条件为：37℃孵育20 min。扩增结束后，用PCR纯化试剂盒纯化RPA产物，并进行琼脂糖凝胶电泳验证扩增效果。
2.4.4. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的建立
CRISPR/Cas12a反式切割体系(20uL)包括：10xHOLMES Buffer 2 uL，LbCas12a Nuclease (250 nM) 0.5 uL，crRNA (10 uM) 0.5 uL，RPA扩增产物1 uL (10 ng)，ssDNA Reporter (10 uM) 1 uL，用无酶水补足体积至20 uL。将上述溶液混匀后，在qPCR仪上，37℃，每隔30 s作为一个循环，采集一次荧光信号，采集时间为30~40 min。
2.4.5. CRISPR/Cas12a检测体系的优化
根据建立好的CRISPR/Cas12a反式切割体系，对体系中crRNA、Cas12a、ssDNA三个主要反应条件的浓度进行优化，从而确定RPA-CRISPR/Cas12a检测KP的最佳反应体系。
crRNA浓度的优化：保持CRISPR/Cas12a反式切割体系其他参数不变，将crRNA浓度调整为7个浓度梯度，分别为80 uM，40 uM，20 uM，10 uM，5 uM，2.5 uM，1.25 uM进行crRNA的浓度优化。
Cas12a浓度的优化：确定最佳的crRNA的浓度后，保持CRISPR/Cas12a反式切割体系其他参数不变，将Cas12a的浓度调整为7个浓度梯度，分别为25 nM，50 nM，100 nM，150 nM，200 nM，250 nM，500 nM进行Cas12a的浓度优化。
ssDNA浓度的优化：确定最佳的crRNA和Cas12a的浓度后，保持CRISPR/Cas12a反式切割体系其他参数不变，将ssDNA的浓度调整为7个浓度梯度，分别为10 uM，5 uM，4 uM，3 uM，2 uM，1 uM，0.5 uM进行ssDNA的浓度优化。
2.4.6. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系灵敏度测试
将KP基因组DNA的RPA扩增产物浓度调整为10个浓度梯度，分2.5 × 101 ng/uL，5 × 100 ng/uL，1 × 100 ng/uL，2 × 10−1 ng/uL，4 × 10−2 ng/uL，8 × 10−3 ng/uL，1.6 × 10−3 ng/uL，3.2 × 10−4 ng/uL，6.4 × 10−5 ng/uL，1.28 × 10−5 ng/uL，进行RPA-CRISPR/Cas12a检测体系灵敏度测试。
2.4.7. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证
将绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺巴斯德杆菌-J型、肺炎链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌等7种致病菌进行RPA扩增，将扩增产物加到CRISPR/Cas12a检测体系中，以验证该体系的特异性。
2.4.8. RPA-CRISRP/Cas12a检测体系的临床应用
采集隔离饲养的KP感染阳性的实验小鼠的新鲜粪便。分别采取两种方法提取粪便中的基因组DNA，随后进行RPA扩增。将扩增产物加到CRISPR/Cas12a检测体系中，进行该体系的临床检测应用。
3. 结果与分析
3.1. PCR扩增结果
将设计好的3对RPA引物先用普通PCR方法进行引物特异性验证。PCR结果显示(如图1)，三对引物在50℃~60℃退火温度下，扩增条带单一，无特异性条带产生，均可用于RPA扩增。
(a)：RPA-PhoE1
(b)：RPA-PhoE2
(c)：RPA-PhoE3
M：100 bp DNA Ladder；1~6：退火温度分别为50℃~60℃。
Figure 1. Specificity verification of RPA primers
图1. RPA引物特异性验证
3.2. RPA扩增结果
将PCR验证好的RPA引物，进行RPA扩增。结果显示(如图2)，3对RPA引物均可成功扩增出与目的条带大小相符的DNA片段，且第一对引物扩增效果最好，因此选用RPA-PhoE1引物进行后续实验。
M：100 bp DNA Ladder；1~3：RPA-PhoE1；RPA-PhoE2；RPA-PhoE3。
Figure 2. Amplification results of the detection target RPA for Klebsiella pneumoniae
图2. 肺炎克雷伯杆菌检测靶标RPA扩增结果
3.3. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的建立
以KP基因组DNA为模板，以RPA-PhoE1为引物先进行RPA扩增。然后将扩增产物加入到CRISPR/ Cas12a检测体系中，用设计好的crRNA1和crRNA2两种crRNA分别进行切割反应，同时将产品自带的Cas12a control target and crRNA设为阳性对照，用无酶水设为阴性对照。结果显示(如图3)，利用RPA-CRISPR/Cas12a检测体系能够成功检测到目标靶DNA的荧光信号，且crRNA1检测效果比crRNA2更好，荧光值更高，因此后续均选用crRNA1进行实验。
Figure 3. Amplification of the RPA-CRISPR/Cas12a detection system
图3. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的扩增
3.4. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的优化
以KP基因组DNA为模板，以RPA-PhoE1为引物进行RPA扩增。将扩增产物作为模板，加入到CRISPR/Cas12a检测体系中，然后对体系中crRNA、Cas12a和ssDNA三个主要参数的浓度进行优化，达到最佳检测效果。首先进行crRNA的浓度优化，由结果(如图4)可知，体系中crRNA浓度为40 uM时，检测到的荧光信号值最高。然后进行Cas12a的浓度优化，由结果(如图5)可知，体系中Cas12a浓度在250 nM时，检测到的荧光信号值最高。确定好体系中crRNA和Cas12a的最佳浓度后，最后进行ssDNA的浓度优化。由结果(如图6)可知，当ssDNA探针浓度在10 uM时，相对于其他测试组，荧光信号值最高。
Figure 4. Fluorescence signal intensities of different concentrations of crRNA in the RPA-CRISPR/Cas12a detection system
图4. 不同浓度crRNA在RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中的荧光信号强度
Figure 5. Fluorescence signal intensity of different concentrations of Cas12a in the RPA-CRISPR/Cas12a detection system
图5. 不同浓度Cas12a在RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中的荧光信号强度
Figure 6. Fluorescence signal intensity of ssDNA at different concentrations in the RPA-CRISPR/Cas12a detection system
图6. 不同浓度ssDNA在RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中的荧光信号强度
3.5. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系灵敏度测试
将不同浓度的KP基因组DNA的RPA产物作为模板，加入到CRISPR/Cas12a体系中，测试RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的灵敏度。由结果(如图7)可知，25 ng~1.28 × 10−5各个浓度梯度的检测模板均能检测出较高的荧光信号，表明利用该体系检测KP的PhoE基因检测灵敏度可达1 × 10−5。
Figure 7. Fluorescence signal intensities of RPA products at different concentrations in the RPA-CRISPR/Cas12a detection system
图7. 不同浓度的RPA产物在RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中的荧光信号强度
3.6. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证
将绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺巴斯德杆菌-J型、肺炎链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌等7种致病菌的基因组DNA先进行RPA扩增，然后将扩增产物加到CRISPR/Cas12a检测体系中，以验证该体系的特异性。由结果(如图8)可知，只有肺炎克雷伯杆菌的RPA产物能成功检测到较高的荧光信号，其他细菌和阴性对照一样，荧光信号值很低，说明建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测体系能准确的识别和切割KP的PhoE基因，具有良好的特异性。
Figure 8. Specificity verification of the RPA-CRISRP/Cas12a detection system
图8. RPA-CRISRP/Cas12a检测体系特异性验证
3.7. RPA-CRISRP/Cas12a检测体系在实验动物临床检测中的应用
分别用培养煮沸法和试剂盒方法提取KP感染阳性实验小鼠的粪便DNA，进行RPA扩增后，用CRISRP/Cas12a体系进行检测。由结果(如图9)可知，和产品自带的阳性对照(Cas12a control target and crRNA)相比较，两种小鼠粪便DNA提取方法均能检测到较高的荧光信号。该方法不但适用于试剂盒法提取临床样本的DNA，同样也适用于简单快速的煮沸法提取小鼠粪便中的DNA。表明建立的RPA-CRISRP/Cas12a检测体系应用于实验动物感染KP的临床检测中，特异性好，灵敏度高。
Figure 9. Clinical Detection application of RPA-CRISRP/Cas12a detection system
图9. RPA-CRISRP/Cas12a检测体系临床检测应用
4. 分析与讨论
实验动物广泛应用于医学、生命科学、药学和公共卫生、食品科学等研究领域。近几年来随着实验动物的需求量和饲养规模日益扩大，检测数量也随之加大，检测任务越来越严重[16]。目前实验动物感染肺炎克雷伯杆菌的检测方法主要集中于传统培养法和PCR、qPCR等常规分子检测方法。这些方法虽然经典、敏感性高、特异性强，已被广泛应用于实验动物的日常健康监测中。但是，实验动物突发疾病或者异常死亡，需要快速检测来辅助兽医进行临床疾病诊断时，建立简单快速、灵敏特异的检测方法就显得尤为重要。
实验小鼠肠道中每克肠内容物含有上亿个菌体，可分为10~15个属，上百个种。肠道正常菌群的主要菌属有双歧杆菌、拟杆菌(类杆菌)、肠球菌、乳杆菌、梭杆菌、真杆菌[17]。在如此庞杂的肠道菌群中，能够排除其他细菌和物质的干扰，灵敏、特异的检测到肺炎克雷伯杆菌特异性的靶标DNA，对粪便样本的处理和DNA的提取以及检测方法的建立都提出了较高的挑战。
近几年，Doudna研究组和张锋研究团队等相继将CRISPR/Cas系统应用于核酸检测领域。Cas12a具有非特异性切割单链DNA靶标的附带切割特性，利用此特性开发了基于Cas12a的分子检测平台——DETECTR。DETECTR利用RPA等温扩增靶标DNA，扩增产物与Cas12a/crRNA混合后启动特定靶标切割，并激活Cas12a的附带切割活性，反应体系中DNA荧光报告探针即可释放荧光信号[18]。CRISPR/Cas通过与重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)等温扩增反应相结合，实现了单个核酸分子的检测[19]。
CRISPR/Cas核酸检测技术因其具有快速、准确和对环境、仪器、操作人员要求低等优点，已广泛应用于传染病(细菌、病毒等)以及遗传病和肿瘤相关(SNP、miRNAs等)、耐药性微生物、寄生虫感染诊断、农业和转基因作物等领域[20]。但是目前在实验动物病原微生物监测领域还没有相关报道，因此利用CRISPR/Cas 核酸检测技术建立实验动物的病原微生物的快速检测方法将是该领域的一个新的突破。
本研究首先用PCR方法和RPA方法筛选出最佳的RPA引物，然后通过优化RPA-CRISRP-Cas12a检测体系，摸索出该体系三个重要参数的最适反应浓度crRNA (40 uM)、Cas12a (250 nM)和ssDNA (10 uM)，获得最佳检测反应体系。通过灵敏度测试和特异性验证，该体系对肺炎克雷伯杆菌的检测能够达到10~5 ng的灵敏度，且特异性好，与实验动物常见的致病菌无交叉反应。应用该体系进行临床检测应用时，通过培养煮沸法和粪便基因组DNA提取法两种方法提取KP感染阳性小鼠粪便中的DNA，均能被成功检测到较高的荧光信号。说明快速简单的培养煮沸法利用该体系，能够达到和试剂盒提取方法一样的检测效果。培养煮沸方法不仅操作简便、缩短样本DNA提取时间和提高KP的检出准确率，还能大大节省检测成本。
本研究建立的RPA-CRISRP-Cas12a检测体系，不但灵敏度高、特异性好，能够有效地排除小鼠粪便中其他细菌和物质的干扰，高效的检出KP感染的低菌量实验动物样本。而且不需要复杂的实验操作，在2小时内即能完成实验动物粪便样本DNA的快速检测。该体系的建立，在实验动物病原微生物检测中有重要的应用前景。利用该体系逐步建立实验动物SPF国标规定的必须要排除的其他病原微生物的快速检测方法，最终达成对实验动物活体实现实时快速、准确简便的病原体健康监测，并应用到新进隔离检疫动物的快速检测中，为兽医临床疾病诊断提供重要的检测依据，为各科研人员提供质量保障的SPF级实验动物。
致 谢
感谢上海交通大学实验动物中心检测平台给予本项目的仪器设备使用支持。感谢给予转载和引用权的资料、文献、研究思想的所有作者。
基金项目
上海交通大学校级决策咨询课题(编号：JCZXSJB2023-16)。
NOTES
*通讯作者。