1. 引言
胃癌(GC)是起源于胃黏膜上皮细胞的最普遍的消化道恶性肿瘤。与GC相关的死亡约占所有癌症死亡人数的23%。此外，晚期GC的预后较差，残酷的5年生存率仍低于20% [1]。化疗是GC的治疗方法之一，副作用严重，可导致耐药性。天然抗癌化合物因其疗效更好、副作用少、毒性更低而是一种很有前途的肿瘤治疗药物。因此，天然抗癌药物的研究对肿瘤的治疗和预后具有重要意义。
2. 介绍
芦荟素是一种从芦荟中提取的蒽醌化合物，用作各种食物的膳食补充剂，具有抗氧化和抗炎的作用。近年来，越来越多的研究将芦荟因的药理活性扩展到肿瘤治疗。研究显示[2]-[4]芦荟素通过下调HMGB1和RAGE的表达，抑制HMGB1的释放，抑制rhHMGB1诱导的Akt-mTOR-P70S6K和ERK-P90RSK-CREB信号通路的激活，诱导胃癌细胞凋亡。沙仁高娃[5]等人发现芦荟苷通过调节NOX抑制GC细胞的增殖和迁移2-ROS介导的促生存信号通路。然而，芦荟素治疗GC的机制是多靶点的，单边因素和单靶点无法揭示芦荟素的复杂机制[6]。网络药理学是一种新的有价值的方法，它整合了系统生物学和生物信息学，以阐述药物的复杂机制[7]。为进一步研究天然药物提供了理论依据。因此，我们应用网络药理学确定了芦荟素的潜在靶点，并揭示了其治疗GC的复杂机制[8]。
3. 材料与方法
3.1. 网络药理学分析
芦荟素的潜在靶点芦荟素的分子结构(sdf格式)来自PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。芦荟素的潜在靶点从以下数据库中筛选：PharmMapper (http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)、瑞士靶点预测(http://www.swisstargetprediction.ch/)和中医药系统药理学(TCMSP)数据库(https://www.tcmsp-e.com/)。然后，我们将收集到的目标提交到Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，并将该物种限制为“智人”。获得了所有基因靶标的官方符号。GC相关基因靶标的鉴定GC相关靶标是从人类在线孟德尔遗传GeneCards (https://www.genecards.org/)，OMIM (https://omim.org/)、和DisGeNET (https://disgenet.org/)中检索到的。使用关键词“胃癌”作为检索词，并去除重复的靶基因。绘制维恩图，用于分析重叠基因，以获得芦荟因针对GC的潜在靶点。蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)网络构建将重叠基因导入STRING数据库(https://string-db.org/)以构建PPI网络。Cytoscape (版本3.8.2)用于直观地分析基因之间的复杂关系。利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行富集分析和“疾病靶点–通路”网络构建基因本体(GO)富集和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集。GO富集包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。P < 0.05和FDR < 0.05被认为是GO富集的重要指标。P < 0.01和FDR < 0.01被认为是KEGG富集的重要指标。使用Cytoscape (版本3.8.2)执行“疾病靶点–通路”网络。GEPIA、HPA和DriverDBv3数据库中关键靶点的验证利用GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)在线工具验证了TCGA-STAD中10个关键靶点的表达式。在HPA数据库中检索了10个关键靶点在正常胃和GC组织中的蛋白表达和分布(https://www.proteinatlas.org/)，DriverDBv3数据库(http://driverdb.tms.cmu.edu.tw/)中检索了10个核心基因的总生存期。
3.2. 体外实验验证
(1) 细胞和试剂人GC细胞系NCI-N87购自中国科学院上海细胞生物学研究所(中国上海)。芦荟苷(纯度 ≥ 95%，CID 12305761)购自上海源叶生物科技有限公司(中国上海)。胎牛血清(FBS)和罗斯威尔公园纪念研究所1640 (RPMI-1640)培养基购自Gibco (美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。二辛可宁酸(BCA)蛋白检测试剂盒和RIPA裂解缓冲液购自百泰生物技术研究所(中国上海)。通过细胞信号转导技术(美国马萨诸塞州丹佛斯)获得针对裂解的Caspase-3、AKT、p-AKT (Ser473)和GAPDH的抗体。针对PI3K和p-PI3K的抗体由Abcam (英国剑桥)提供。Wes分离试剂盒购自ProteinSimple (美国加利福尼亚州)。细胞计数试剂盒-8 (CCK8)购自Dojindo Laboratories (日本东京)。总RNA快速提取试剂盒、HiFiScript快速gDNA去除cDNA合成试剂盒和SYBR green PCR预混液购自北京百泰生物科技有限公司(中国北京)。PCR引物由三光生物科技(上海)有限公司(中国上海)合成。
(2) 细胞培养和活力分析将NCI-N87细胞培养在含有10%FBS和1%青霉素–链霉素的RPMI-1640培养基的5% CO中237℃加湿培养箱。将芦荟苷溶于二甲基亚砜(DMSO)中，并用培养基稀释成系列浓度(DMSO终浓度为0.1%)。为了检测芦荟素对细胞增殖的抑制作用，将处于对数生长期的NCI-N87细胞接种在96孔板中，密度为5 × 103每孔细胞并用多种浓度(100, 200, 300, 400, 500 μg/mL)或载体(含有0.1% DMSO的培养基)处理24小时。处理后，向每个孔中加入10 μCCK8溶液，并在37℃下再孵育2小时。450 nm处的吸光度由酶标仪(Bio-Tek, Winooski, VT, USA)检测。RT-qPCR分析使用总RNA快速提取试剂盒，从用不同浓度的芦荟因处理24 h的细胞中提取总RNA。总RNA的浓度由NanoDrop One分光光度计(Thermo Scientific, USA)测定。使用HiFiScript gDNA Removal cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR green PCR预混液(Low ROX)试剂盒制备PCR反应系统，扩增cDNA，并通过(Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)检测表达水平。
(3) 透射电子显微镜(TEM) NCI-N87细胞(5 × 106收集细胞，用不同浓度的芦荟处理24 h后，用2.5%戊二醛在4℃下固定过夜，然后用1% (w/v)锇酸固1 h，通过梯度乙醇–丙酮脱水。用不同比例的包埋脱水剂填充样品，然后浸泡在纯包埋剂中过夜。翌日70℃聚合24 h后，用超薄切片机(德国徕卡)将样品切成70 nm的超薄切片，并用醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。然后，在TEM (日立，东京，日本)下观察细胞的超微结构。
(4) 自动蛋白质免疫印迹分析收集NCI-N87细胞，用不同浓度的芦荟素处理24小时后，在含有蛋白酶抑制剂和PMSF的提取缓冲液中在冰上裂解2小时。以12,000 rpm对裂解物进行离心15分钟。BCA蛋白测定试剂盒用于测定蛋白质的浓度。Wes分离试剂盒用于在Peggy Sue统(ProteinSimple, California, USA)上进行简单的蛋白质免疫印迹，并根据制造商的说明检测蛋白质的表达。添加GAPDH作为内部扩增对照。统计分析实验数据以平均 ± 标准差表示。采用SPSS26.0软件和GraphPad Prism8方法，采用单因素方差分析方法对数据结果进行分析。P < 0.05的水平被认为是显著的。
4. 结果
4.1. 收购针对GC的芦荟素的潜在靶点
基于PharmMapper数据库、Swiss Target Prediction和TCMSP数据库，共确定了213个Aloin潜在靶点。GC相关基因靶标来自OMIM、GeneCards和DisGeNET。共选择了4034个目标。我们将芦荟的213个靶基因与4034个潜在的GC相关靶基因相交。有129个交叉点被认为是Aloin对抗GC的潜在候选靶点。
4.2. PPI网络建设及关键目标筛选
将所有预测的靶基因提交到STRING数据库后，设置中等置信度(0.4)进行分析。PPI网络包含126个节点和1078条边，由Cytoscape (版本3.8.2)构建。在PPI网络中，采用度法筛选Cytohubba的前10个枢纽基因：ALB (度 = 79)、AKT1 (度 = 75)、EGFR (度 = 64)、MAPK1 (度 = 59)、CASP3 (度 = 57)、HSP90AA1 (度 = 56)、MAPK8 (度 = 54)、SRC (度 = 54)、HRAS (度 = 53)和ESR1 (度 = 53)。
4.3. GO Enrichment和KEGG Enrichment
通过GO和KEGG通路富集分析，探究DAVID数据库中129个预测基因的生物学功能。结果表明，芦荟素抗GC的129个潜在靶基因在93个生物过程、19个细胞成分和37个分子功能中显著富集(P < 0.05和FDR < 0.05)。生物过程的前5项主要富集肽基丝氨酸磷酸化(GO: 0018105)、蛋白质自磷酸化(GO: 0046777)、肽基–苏氨酸磷酸化(GO: 0018107)、凋亡过程负调控(GO: 0043066)和蛋白质磷酸化(GO: 0006468)。细胞成分的前5项分别是胞质溶胶(GO: 0005829)、细胞外泌体(GO: 0070062)、细胞外空间(GO: 0005615)、细胞外区(GO: 0005576)和质膜细胞质侧的外在成分(GO: 0031234)。分子功能排名前5位的指标包括丝氨酸型内肽酶活性(GO: 0004252)、类固醇激素受体活性(GO: 0003707)、蛋白酪氨酸激酶活性(GO: 0004713)、激酶活性(GO: 0016301)和ATP结合(GO: 0005524)。
4.4. 验证GEPIA、HPA和DriverDBv3数据库中的关键目标
在GEPIA和HPA数据库中研究了STAD样品中枢纽基因的表达。结果表明，GC组织中HSP90AA1和SRC和mRNA表达高于正常胃组织(P < 0.05)。GC组织中SRC、MAPK8和EGFR的蛋白表达高于正常胃组织。CASP3的蛋白表达在正常胃组织中为中等，但在GC组织中未检测到。GC组织与正常组织之间其他基因的表达无显著差异。在DriverDBv3数据库中检索总生存期。结果表明，EGFR和ESR1的高表达与生存率显著降低相关(P < 0.05)。
4.5. 芦荟素抑制NCI-N87细胞的增殖
为验证芦荟因对GC的抗增殖作用，采用CCK8测定芦荟因处理24 h后的细胞活力。随着芦荟素浓度从100 μg/mL逐渐增加到500 μg/mL，GC细胞的存活率随着剂量，表明芦荟素对GC细胞的增殖有显著的抑制作用。芦荟因通过IC抑制NCI-N87细胞的生长50327.1 μg/mL。根据CCK8测定的实验结果，选择100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的浓度进行后续实验方案。
4.6. 芦荟苷诱导NCI-N87细胞凋亡
Caspase-3可以被激活成裂解的Caspase-3，在细胞凋亡中起着至关重要的作用。为了检测芦荟苷对NCI-N87细胞凋亡的影响，分析了Caspase-3的mRNA和蛋白表达。与未处理组相比，芦胱冬酶-3的mRNA表达在芦胱胱冬处理组中显著增加，浓度分别为200 μg/mL和400 μg/mL (P < 0.05或P < 0.01)。然而，100 μg/mL芦荟治疗组与未处理组之间差异无统计学意义(P > 0.05)。裂解Caspase-3的蛋白表达与Caspase-3的mRNA表达趋势相似。NCI-N87细胞的超微结构通过透射电镜进行。在未处理的组中，细胞的膜表面充满微绒毛。细胞结构完整，有丰富的正常细胞器。在许多细胞中都可以看到核分裂。用100 μg/mL芦荟因组处理的细胞与未处理组相似。大多数细胞处于良好状态。与未处理的细胞相比，用200 μg/mL芦荟素组处理的细胞微绒毛减少，并且细胞中有一些液泡。用400 μg/mL芦荟组处理细胞核/细胞质比显著降低，细胞核染色质出现缩合和边缘凝固现象。线粒体肿胀，甚至出现空泡化，嵴破裂或消失。细胞中有一些自噬液泡，膜表面的微绒毛消失。少数细胞处于细胞凋亡晚期，表现为继发性坏死、细胞膜不连续、细胞核裂解和细胞器消失。
4.7. 芦荟素对PI3K-AKT信号通路中相关基因mRNA和蛋白表达的影响
根据网络药理学分析结果，PI3K-AKT信号通路参与了芦荟因对GC的机制，检测信号通路上下游关键分子的表达和磷酸化水平。因此，我们评估了芦荟因对调节PI3K-AKT信号通路的作用。结果表明，不同浓度的芦荟素干预后，PI3K的mRNA表达量较未处理组显著降低(P < 0.01)。
在200 μg/mL和400 μg/mL浓度下，AKT的mRNA表达在芦荟因处理中也显著降低(P < 0.05或P < 0.01)。虽然100 μg/mL芦荟因的干预降低了AKT的mRNA表达，但与未处理组相比没有显著差异(P > 0.05)，p-PI3K和p-AKT的蛋白表达表现出与mRNA水平相似的趋势。
5. 讨论
近年来，用于癌症治疗的天然产物的研究越来越受到关注。多项研究表明[9]，芦荟素可抑制结直肠癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。芦荟素治疗GC的机制多种多样[9]。一个或两个特定的信号通路不能揭示芦荟因针对GC的多个靶点。基于网络药理学分析，可以在系统水平上有效揭示药物与其靶点之间的复杂相互作用和潜在机制。本研究旨在阐明芦荟因对GC的影响，并利用体外实验验证网络药理学预测的机制[10]。首先，我们确定了129个针对GC的芦荟因的潜在靶点。然后，构建PPI网络，发现10个枢纽基因。核心基因与GC的发病机制有关。ALB是一种编码人体血液中最丰富的蛋白质的基因。这种蛋白质在调节血浆胶体渗透压方面发挥作用，并作为多种内源性分子(包括激素、脂肪酸和代谢物)以及外源性药物的载体蛋白[11]-[14]。据报道，血清ALB升高与GC的良好预后相关。在这项研究中，我们发现EGFR的高表达与DriverDBv3数据库中显着低的生存率有关。干扰EGFR的表达可以抑制胃癌细胞的生长，增加化疗的敏感性。MAPKs参与生理和病理过程中细胞生长和存活的调节。异常的MAPK信号转导，如MAPK/ERK通路，与癌细胞的产生和转移有关。我们发现MAPK8在GC患者中高表达，表明它对GC进展至关重要。CASP3是细胞凋亡的主要执行者，必须最终转化为活化的Caspase-3 (裂解的Caspase-3)才能执行细胞凋亡程序[15] [16]，这也在我们的研究中得到证实[17] [18]。HSP90AA1是分子伴侣HSP90的亚型。GC患者HSP90AA1的高表达与疾病进展和生存率低有关。数据库验证表明，GC组织中HSP90AA1的表达高于正常组织[19]。SRC于1976年被确定为第一个致癌基因，在肿瘤生长和进展中起着重要作用，其活性与患者生存率低有关。在这项研究中，我们发现它在GC组织中高表达，表明它可能是GC诊断和治疗中的重要生物标志物[20]。HRAS是RAS家族的致癌基因，与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和促血管生成活性密切相关。ESR1编码雌激素受体α (ERα)，它可以通过多种途径与其他信号分子相互作用[21]，例如PI3K/AKT或MAPK信号通路。ESR突变最早在乳腺癌中被报道，它与胃癌的细胞增殖、转移和侵袭有关。在这项研究中[22]，ESR1被发现是GC患者生存率低的生物标志物。简而言之，这些核心基因在GC的发生、发展和预后中发挥着重要作用，GC可以成为Aloin治疗的潜在靶点。我们通过公共数据库验证了一些核心基因在GC中的作用；然而，由于数据库样本有限等多种原因，其他一些基因仍未得到验证。我们将做一些研究，以进一步阐明这些基因在GC中的作用以及芦荟因对它们的影响。
KEGG通路分析显示，芦荟素治疗GC主要涉及PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路和Ras信号通路，主要与肿瘤相关疾病相关。根据各自通路对应的靶点数量，重点研究了PI3K-AKT信号通路，该通路是可能参与Aloin抗胃癌机制的关键通路。越来越多的证据表明，PI3K-AKT通路对GC的细胞增殖、迁移、细胞凋亡和存活至关重要[23]-[25]。此外，PI3K-AKT通路与远处转移、化疗耐药有关，并有助于在耐药和转移性人类癌细胞中发生的上皮间充质转化(EMT)。因此，本研究重点关注PI3K-AKT信号通路，探讨芦荟素对GC作用的机制。
同时，我们进行了体外实验，验证了网络药理学分析的结果，并阐明了芦荟素治疗GC的机制。通过CCK8检测，我们发现芦荟素对NCI-N87细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，以响应来自内部或外部因素的刺激。细胞凋亡作为抗癌发展的保护机制，是抗癌治疗的关键。在这项研究中，结果表明[26]，芦荟素显着提高了NCI-N87细胞中Caspase-3的mRNA水平和Cleaved Caspase-3的蛋白质水平。NCI-N87细胞的超微结构也显示芦荟苷有效诱导细胞凋亡。这些结果表明，芦荟苷对GC细胞凋亡具有促进作用。PI3K-AKT通路是细胞凋亡的负调节因子。一旦PI3K-AKT信号被过度激活，细胞增殖和迁移将被促进，并导致细胞凋亡的抑制。据报道，阻断Akt激活明显增强了Aloin诱导的胃癌细胞凋亡。因此，抑制该途径可能是GC治疗的潜在靶点。然后我们发现芦荟素显著降低了PI3K和AKT的mRNA水平，降低了p-PI3K和p-AKT的蛋白表达，表明芦荟素可能通过抑制PI3K-AKT通路来抑制细胞增殖并促进NCI-N87细胞的凋亡。
综上所述，本研究结果利用网络药理学阐明了芦荟素对GC的治疗机制，并通过体外药理实验验证了结果。芦荟素有可能成为治疗GC的有效药物，这为天然化合物在抗肿瘤治疗方面的研究提供了新的前景。此外，本研究仍需通过体内实验来验证芦荟素的抗胃癌机制。
6. 结论
综上所述，本研究揭示了芦荟素多靶点、多通路治疗GC的潜在机制。我们的研究结果表明，芦荟素是一种很有前途的治疗GC的候选药物。
基金项目
本研究获得镇宁县中医院伦理委员会批准(审批号：A2024-G0001)。
NOTES
*第一作者。