针刺抑制脑出血后细胞凋亡的机制及其研究进展

Mechanism of Inhibition of Apoptosis after Cerebral Hemorrhage by Acupuncture and Its Research Progress

摘要: 脑出血(Intracerebral Hemorrhage, ICH)后细胞凋亡是受损脑组织迟发性细胞死亡的主要途径，是受凋亡基因控制的，主要存在于血肿周边较大范围的缺血水肿带中。针刺是一种传承百年的中医疗法，近年来针刺作为ICH的辅助治疗手段，其保护机制逐渐成为研究热点。本文以针刺抑制ICH后细胞凋亡的机制研究进展为切入点，通过梳理近20年来国内外关于ICH后细胞凋亡机制及针刺干预效果的研究。归纳发现针刺对于调控细胞凋亡信号通路、调控双通路靶向凋亡关键因子、调节自噬与凋亡的平衡、调节神经干细胞增殖与分化、抑制氧化应激通路、介导PAR-1蛋白表达等多个环节都有干预作用，为相关机制研究提供参考。

Abstract: Apoptosis after Intracerebral hemorrhage (ICH) is the main pathway of delayed cell death in damaged brain tissues, which is controlled by apoptosis genes, and mainly exists in the larger ischemic-edematous zone around the hematoma. Acupuncture is a centuries-old traditional Chinese medicine therapy, and in recent years, as an adjunctive treatment for ICH, its protective mechanism has gradually become a research hotspot. In this paper, we take the research progress on the mechanism of inhibition of apoptosis after ICH by acupuncture as an entry point, by combing the domestic and foreign studies on the mechanism of apoptosis after ICH and the effect of acupuncture intervention in the past 20 years. It was found that acupuncture has an intervention effect on regulating apoptosis signaling pathway, regulating dual pathway targeting apoptosis key factors, regulating the balance between autophagy and apoptosis, regulating the proliferation and differentiation of neural stem cells, inhibiting the oxidative stress pathway, and mediating the expression of PAR-1 protein, which can provide references to the research of related mechanisms.

1. 引言

ICH是指急性自发性(非创伤性)颅内出血，具有高死亡率、发病率和致残率的特点，是最严重和最难治疗的卒中形式，占所有卒中事件的10%~15% [1]。ICH后血肿、水肿、氧化应激及线粒体自噬等病理反应参与了神经细胞凋亡过程，而神经细胞大量凋亡是ICH后神经功能缺损的重要原因之一[2]。因此积极有效地保护ICH后损伤的神经细胞，挽救ICH半暗带区，恢复其神经功能，仍然是目前神经科学研究的重点[3]。中医学认为中风的产生，虽然其病因病机各不相同，但患者多存在瘀血阻滞经脉，是根本病机之所在。针刺具有促使气血畅通、正气恢复的功效，并且针刺操作方便、副作用少，能安全有效地早期介入ICH的康复治疗中。本文结合相关研究、讨论了针刺抑制ICH后细胞凋亡的分子机制及临床研究进展。现从细胞凋亡信号、细胞凋亡因子、自噬与凋亡、神经干细胞、氧化应激、PAR-1蛋白等方面进行以下综述。

2. 针刺调控细胞凋亡信号通路

2.1. Caspase级联反应

天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase, Caspase)介导细胞凋亡并参与细胞凋亡的各个途径，Caspase-3和Caspase-9是由Caspase介导的细胞凋亡途径中至为关键的2种酶。由Caspase蛋白家族介导的细胞凋亡机制与ICH后线粒体功能障碍密切相关。ICH导致线粒体功能障碍时，细胞色素c (Cytochrome c, Cyt-c)从线粒体释放，首先将Caspase-9前体裂解，因此产生活化的Caspase-9，活化的Caspase-9进一步使Caspase-3前体裂解，产生活化的Caspase-3，活化的Caspase-3继续激活其下的底物，最终直至细胞发生凋亡[4]-[8]。韩佳炜等[9]通过针刺人中､内关穴治疗后，观察脑组织Caspase-3、Caspase-9蛋白表达情况，发现针刺通过降低ICH后Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平，抑制了由Caspase家族介导的神经细胞凋亡的发生，拮抗ICH后继发性脑组织损伤，保护神经元功能。

2.2. 非Caspase级联反应

调亡诱导因子(Apoptosis Inducing Factor, AIF)是一种在线粒体内介导调亡的重要蛋白，但它本身不具有引起细胞调亡的作用而是维持线粒体活性，保证细胞能够正常存在的重要因子。它不依赖于Caspase途径，而是通过另一条更为单纯、更久远的途径来诱导细胞调亡[10]：当有缺氧缺血、兴奋类毒素或缺少生长因子等条件的刺激时，AIF经蛋白酶水解形成成熟的AIF，随后释放到胞质中，然后再转移进入细胞核中，引起染色质紧密聚集和大规模DNA断裂，从而引导细胞调亡。何涛等[11]通过针刺百会、曲鬓穴治疗后，观察脑组织细胞调亡数量、AIF蛋白表达情况，发现针刺可以有效降低AIF蛋白表达，减少ICH后细胞凋亡的发生，进而降低ICH后继发性脑损伤。

3. 针刺调控双通路靶向凋亡关键因子

3.1. p38MAPK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinases, MAPKs)是胞内多个信号传递的交点和共同通路，P38是MAPKs家族中重要一员。p38MAPK信号通路包括p38、JNK、ERK1/2及其亚型[12]，其中p38能被生长因子、炎症因子、应激反应激活，从而参与细胞周期、凋亡、生长等病理生理过程[13]，如激活后的p38可以磷酸化促凋亡蛋白Bax，促进细胞凋亡；或者促进IL-6、IL-8等炎症因子的释放，炎性细胞因子释放越多，活化的p38越多，细胞凋亡的规模越大，脑组织细胞损伤越重[14]。孔莹等[15]通过针刺百会、曲鬓穴，观察脑组织p38MAPK蛋白含量、细胞凋亡数，发现针刺可下调p38MAPK蛋白表达，阻碍其介导的细胞凋亡途径，从而减轻ICH后继发性脑损伤。

3.2. PI3K/AKT信号通路

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (Phosphoinositide 3-Kinase/Protein Kinase B, PI3K/AKT)信号通路广泛存在于各种神经细胞中，是膜受体信号向细胞内转导的重要途径[16]。AKT是PI3K/AKT细胞信号通路下游的重要节点分子，AKT的磷酸化激活主要依赖PI3K的活化，磷酸化的AKT (p-AKT)参与包括细胞调亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程，能直接磷酸化多种转录因子，通过调控这些转录因子，可以抑制调亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达，从而促进细胞的存活。同时p-AKT也能使caspase家族成员磷酸化失活，抑制caspase导致的细胞凋亡，可以说其能直接抑制caspase-9、caspase-3的活性而阻止凋亡级联反应的激活[17]。包宇等[18]基于PI3K/AKT信号通路针刺百会、曲鬓穴治疗后，观察半暗带区细胞凋亡数量、PI3K和p-AKT阳性细胞表达情况，发现针刺可以提高PI3K和p-AKT表达水平，减少神经细胞凋亡数量。

3.3. Shh/Ptch1/Gli1信号通路

Shh信号通路与细胞凋亡密切相关。Shh信号通路的成员包括Shh信号肽、膜因子Ptch1、Smo和下游转录因子Gli1 [19]。在没有Shh蛋白参与的情况下，Ptch1通过在纤毛中组装并排除Smo蛋白来抑制Shh通路。在激活状态下，Shh与Ptch1结合，解除了Ptch1对Smo的抑制并激活Shh通路的下游靶标Gli1。Gli1转移到细胞核，激活转录后，保护抗凋亡蛋白(如Bcl-2)免受凋亡诱导[20] [21]。张菶等[22]通过针刺百会､曲鬓穴治疗后，观察凋亡神经细胞率、Smo和Gli1蛋白表达，发现针刺法通过激活Shh通路提高ICH后Smo、Gli1蛋白表达水平，进而实现抑制神经细胞凋亡。

4. 针刺调节自噬与凋亡的平衡

4.1. BNIP3与Bax/Bcl-2调控关系

自噬是细胞回收细胞成分并降解过量或有缺陷的细胞器的过程，这种通过自噬选择性线粒体降解的特异性调节机制被定义为线粒体自噬，此举促进线粒体更新，维持线粒体稳态。ICH后激活自噬，Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3 (Bcl-2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3, BNIP3)是线粒体自噬调节蛋白，可促进线粒体自噬过程，抑制ICH后细胞凋亡[23]。而BNIP3L与Beclin1作为ICH后自噬调控的核心耦合模块，BNIP3L定向识别损伤线粒体，Beclin1驱动自噬体包裹，二者同步响应，阻碍线粒体自噬过程，协同减轻神经元损伤，为神经保护干预的重要靶点[24]。同时ICH发生后，抗调亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等在线粒体调亡中也被激活，Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系决定着细胞凋亡的关系[25]。Rui-Qiao Guan等[26]通过针刺百会、曲鬓穴治疗后，观察线粒体自噬形态学特征、调亡细胞数量及相关蛋白表达，发现针刺不仅上调BNIP3来增强线粒体自噬，还可上调Bcl-2以及降低裂解的Bax表达水平来抑制细胞调亡。该实验进一步证实了线粒体自噬对ICH后细胞凋亡的重要性。

4.2. PINK1与Beclin1调控关系

蛋白激酶1 (Pten Induced Putative Kinase 1, PINK1)是目前研究最为广泛的一种线粒体自噬受体蛋白。当线粒体受损时，PINK1在线粒体外膜上积累，进而招募Parkin，Parkin被激活后通过泛素化标记线粒体底物蛋白，促进其被自噬体包裹和降解[27]。苄氯素1 (Recombinant Beclin 1, Beclin1)是自噬的核心启动因子，开启被标记底物蛋白自噬的进程，并且还参与Parkin向线粒体外膜的易位，促进了线粒体自噬的发展。而NIX/BINP3L在正常状态下帮助清除多余的线粒体以调控维持线粒体质量和细胞稳态，若在缺氧状态下，NIX/BINP3L就会清除受损的线粒体，改善低氧状态[28]。Peng Liu等[29]通过针刺百会、曲鬓穴治疗后，观察Beclin1、PINK1、Parkin、NIX和半暗带细胞损伤程度，发现针刺提高了Beclin1、PINK1、Parkin、NIX蛋白表达及降低了半暗带细胞损伤程度，表明针刺通过增强线粒体自噬来防止细胞调亡的发生。再次证实了线粒体自噬对ICH后细胞凋亡的重要性。

5. 针刺调节神经干细胞增殖与分化

巢蛋白(Nestin)作为中枢神经系统发育过程中的神经元干细胞的标志物，可参与神经上皮干细胞的多向分化，分化为神经元细胞或神经胶质细胞等[30]。神经营养因子是ICH后神经元细胞损伤修复的关键因子，其中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)参与神经元存活、神经生长、发育和分化，因此被广泛研究。Dan Li等[31]通过针刺百会、曲鬓治疗后，观察神经营养因子、Nestin阳性细胞表达及半暗带细胞损伤程度，发现针刺不但提高ICH后神经营养因子NGF、BDNF、GDNF和bFGF的表达，还可以上调Nestin的表达，进而增强各种神经元细胞的生长，促进受伤的神经元细胞修复，抗神经元细胞凋亡的发生。

Notch1信号通路被认为是胚胎神经干细胞生长调节的主要因素，参与调节几乎所有组织和器官的细胞增殖、分化和凋亡，具体来说，Notch1信号通路通过抑制神经干细胞分化和维持自我更新而影响神经元细胞和神经胶质细胞生成。Hes1是Notch1信号通路下游的一个关键基因，在维持神经干细胞未分化状态中有重要作用，也就是说，没有Hes1基因情况下，Notch无法抑制神经元细胞分化[32]。Wei Zou等[33]通过针刺百会、曲鬓治疗后，观察Notch1和Hes1蛋白表达，发现针刺可有效抑制脑组织Notch1和Hes1蛋白的表达，将Notch-Hes1信号传导的神经干细胞维持自我更新提高和未分化状态降低，促进了神经干细胞分化为神经元细胞和神经胶质细胞等，促进受伤的神经元细胞修复，减少了神经元细胞凋亡的几率。

6. 抑制氧化应激通路

沉寂信息调节因子1 (Silent Mating Type Information Regulation 2 Homolog 1, SIRT1)是一种营养和能量敏感的蛋白脱乙酰酶，通过靶向组蛋白和转录因子进行脱乙酰来发挥其生物活性[34]。同时叉头框转录因子1 (Forkhead Box Protein o1, FOXO1)是SIRT1的下游靶标之一，FOXO1在抗氧化信号通路中充当传感元件，在感受到氧化应激刺激下，FOXO1被SIRT1脱乙酰并激活，FOXO1的蛋白水平会显著上升，并进入细胞核中，诱导抗氧化酶(包括SOD、CAT和GSH-Px)的表达来发挥抗氧化作用；同时进入细胞核中的FOXO1转录活性增强可调控凋亡基因表达，引发细胞凋亡[35]。San-San Dong等[36]通过针刺百会、曲鬓穴治疗后，观察抗氧化酶(包括SOD、CAT和GSH-Px)的表达、氧化损伤产物(如MDA和8-OHdG)的表达及半暗带细胞损伤程度，发现针刺可介导SIRT1/FOXO1信号通路，激活SIRT1，促进FOXO1乙酰化，继而减少氧化应激损伤带来的神经细胞凋亡。

7. 针刺介导PAR-1蛋白表达

蛋白酶激活受体1 (Protease-Activated Receptors-1, PAR-1)是一种多肽受体，在脑组织中表达广泛[37]。研究发现[38]，PAR-1的激活可诱导或抑制多种细胞凋亡，具体取决于其生理激动剂凝血酶的剂量。生理状态下，PAR-1呈低水平表达，维持稳态。ICH后，血液凝固过程中产生大量凝血酶，大剂量凝血酶激活PAR-1从而引起一种神经毒性介质的神经细胞凋亡。李承基等[39]通过针刺百会、太阳穴治疗后，观察脑组织内PAR-1表达、凋亡神经细胞百分率，发现针刺抑制PAR-1蛋白的表达，降低了凝血酶对神经细胞的毒性作用，从而减轻神经细胞凋亡。

8. 思考其他可能机制

8.1. 调控TNF-α信号途径

肿瘤坏死因子α (Tumor Necrosis Factor-Alpha, TNF-α)作为一个核心的信号枢纽，其生物学效应(促炎、促凋亡、促存活、调节代谢和自噬)是通过精细调控和整合以上信号通路与调控因子来实现的，如TNF-α启动Caspase级联反应直接激活外源性凋亡、调节p38MAPK信号通路，放大炎症信号、激活强大的生存信号p38MAPK，拮抗凋亡，促进细胞增殖和存活、与Shh通路交叉对话，影响发育、修复和以及TNF-α可调控线粒体凋亡途径，如BNIP3与Bax/Bcl-2调控关系，通过影响线粒体健康和外膜通透性来放大或执行凋亡信号等等。因此TNF-α可能参与ICH后炎症反应和细胞凋亡过程。首先TNF-α作为促炎因子，可诱导IL-1β的进一步释放，加重炎症反应，导致脑损伤；TNF-α还可以通过激活Caspase-8、Caspase-1、核因子-κB (Nuclear Factor-κB, NF-κB)和鞘磷脂酶等，其中Caspase-8、Caspase-1作为凋亡蛋白可诱导神经细胞凋亡，而鞘磷脂酶有利于NF-κB的活化，NF-κB又可以促进TNF-α的基因转录，从而形成炎症通路和凋亡通路的恶性循环[40]。于晓刚等[41]在针刺对ICH大鼠TNF-α影响的实验中，通过针刺百会、太阳穴治疗后，观察脑组织TNF-α表达、半暗带体积，发现针刺可减缓TNF-α介导的免疫炎性反应过程，减轻血肿周围细胞的炎性反应，使细胞凋亡数量减少。故笔者推测针刺对ICH大鼠TNF-α影响的机制除了与调控TNF-α介导的炎症反应有关，还可能与TNF-α介导的细胞凋亡有关。

8.2. 调控死亡受体通路

Fas (又称Apo-1/CD95/TNFRSF6)是最具代表性的死亡受体，其通过与其配体FasL结合，激活Caspase信号通路，诱发细胞凋亡的级联反应，当ICH后，脑组织缺血缺氧时，脑神经细胞的Fas、及其FasL表达增加，直接激活Caspase级联，并通过tBid紧密连接并调控线粒体凋亡通路(涉及Bax/Bcl-2和BNIP3)。与此同时，促凋亡的p38MAPK可能增强Fas信号；而强大的生存信号通路(PI3K/AKT, Shh)则通过抑制凋亡因子、下调Fas表达等方式拮抗Fas的作用。自噬/线粒体自噬(PINK1/Beclin1)则扮演着复杂的角色，主要通过清除受损线粒体来保护细胞，但也能在特定条件下与凋亡通路发生交叉对话。因此Fas/ FasL信号通路被广泛地称为死亡受体凋亡通路[42]。黄坤等[43]在针刺调节Fas/FasL信号通路对缺血性卒中后大鼠神经损伤的实验中，发现针刺降低了通过Fas/FasL信号通路介导的Fas、FasL蛋白水平，减少神经细胞凋亡。也有李建设等[44]在大鼠ICH后Fas表达与神经细胞凋亡关系的实验中，发现氟桂利嗪能下调ICH后Fas的表达而减轻细胞凋亡，但未提及针刺作用。故笔者通过以上研究推测针刺可能会基于Fas/FasL信号通路抑制ICH后细胞凋亡。

归纳与总结：针刺治疗ICH后细胞凋亡的机制研究取得了一定进展，一方面反映了针刺干预的有效性，另一方面说明针刺的干预作用是多途径、多靶点的，包括调控细胞凋亡信号通路、调控双通路靶向凋亡关键因子、调节自噬与凋亡的平衡、调节神经干细胞增殖与分化、抑制氧化应激通路、介导PAR-1蛋白表达等等，可见ICH与细胞凋亡之间并非独立存在，二者之间是相互影响且密切联系的。除此之外，针刺治疗ICH后细胞凋亡的多种机制之间并非孤立存在，而是相互关联、协同合作的，共同构成一个复杂的调控网络，如氧化应激通路是凋亡始动因素，激活促凋亡通路，而针刺通过抑制氧化应激通路下调促凋亡通路(p38MAPK, Caspase)、稳定线粒体(调控Bax/Bcl-2/BNIP3)、促进保护性自噬(调控PINK1/Beclin1)以及协同激活Shh通路，形成强大的抗凋亡网络。针刺治疗ICH后细胞凋亡在临床实践中被广泛应用，既凸显了传统中医学的优势，又强化了可信度。目前，针刺作为神经学科研究重点，今后需要进一步探讨针刺从其他途径治疗ICH后细胞凋亡的具体机制，以及不同机制之间的作用联系。未来还需要更多的研究去针对以上问题进行探索，推动中西医结合精准治疗。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。