摘要: 目的：采用网络药理学和分子对接的方法研究四黄散和妇可靖胶囊联用治疗慢性盆腔炎的机制。方法：检索TCMSP和HERB数据库得到两种药物的成分以及对应靶点；基于GeneCards和OMIM数据库获得慢性盆腔炎的治疗靶点；使用Venny在线分析工具获得交集靶点；运用Cytoscape3.9.1软件结合STRING数据库分别进行成分、靶点和PPI网络分析；使用DAVID数据库进行GO分析和KEGG分析；通过分子对接分别验证。结果：网络药理学分析结果得到包括槲皮素、木犀草素、山奈酚等成分289个；关键靶点160个，包括ATK1、TNF、IL-6等；关键通路158条，包括IL-17信号通路、TNF信号通路PI3K-Akt信号通路等。分子对接的结果显示，槲皮素可与AKT1、IL-6、TNF；山奈酚可与AKT1、TNF结合；木犀草素可与IL-6结合。结论：四黄散和妇可靖胶囊通过槲皮素、木犀草素、山奈酚等主要活性成分，与AKT1、TNF、IL-6等蛋白靶点相结合，调节IL-7、TNF、PI3K/AKT等信号通路，达到治疗慢性盆腔炎的目的。
Abstract: Objective: Exploring the mechanism of chronic pelvic inflammatory disease treated with the combination of Sihuang powder and Fukejing capsules using network pharmacology and molecular docking. Methods: The TCMSP and Herb databases were searched to obtain the components and corresponding targets of the 2 drugs; the therapeutic targets of chronic pelvic inflammatory disease were obtained based on the GeneCards and OMIM databases; the intersecting targets were obtained by using the Venny online analysis tool; the components, targets and PPIs were analyzed by using the Cytoscape 3.9.1 software in combination with the String database. Network analysis; GO analysis and KEGG analysis using David database; validated by molecular docking, respectively. Results: The results of network pharmacological analysis yielded 289 ingredients including quercetin, lignocerotoxin, and kaempferol; 160 key targets including ATK1, TNF, and IL-6; and 158 key pathways including IL-17 signaling pathway, TNF signaling pathway PI3K-Akt signaling pathway, and so on. The results of molecular docking showed that quercetin binds to AKT1, IL-6, and TNF; kaempferol binds to AKT1 and TNF; and lignans binds to IL-6. Conclusion: Sihuang powder and Fukejing capsules can regulate the signaling pathways such as IL7, TNF, PI3K/AKT, etc. through the main active ingredients such as quercetin, lignocerotoxin, and kaempferol, which can bind to the protein targets such as AKT1, TNF, and IL-6, and achieve the purpose of treating chronic pelvic inflammatory disease.
1. 引言
盆腔炎(Pelvic inflammatory disease, PID)是一种常见的生殖疾病，指女性上生殖道器官及其周围组织发生的炎症，盆腔炎的潜在后遗症包括异位妊娠、输卵管性不孕和慢性盆腔疼痛(Chronic pelvic pain, CPP) [1]。慢性盆腔炎会严重影响患者的生活质量，导致女性盆腔发生组织粘连、破损、增生等症状[2]。目前，慢性盆腔炎的治疗主要以抗菌抗炎为主，采用相应的抗菌药物和抗生素干预；然而患者在长期服用抗生素类的药物时会产生严重的耐药性并增加二次感染风险[3]，同时出现肝肾功能损伤、菌群失调等不良反应[4]。
中医理论认为，慢性盆腔炎是由于“热、湿、瘀、虚”等因素相互作用而形成的湿热蕴结以及气滞血瘀导致，对盆腔炎的治疗应从活血祛瘀、消肿止痛等方面进[5]。四黄散由大黄粉、黄芩粉、黄连粉、黄柏粉组成，大黄可清泻湿热，活血化瘀；黄芩、黄连和黄柏可清热燥湿，凉血解毒，具备抗菌作用；整方具有消肿止痛、活血化瘀、清热解毒的功效[6]。妇可靖胶囊是由二十多种药材配伍而成的中药复方制剂，其中北败酱、蒲公英、车前子作为君药，可清热利湿，解毒排脓；赤芍、三七、红花、丹参、延胡索作为臣药，可活血化瘀，疏肝理气，止疼痛；白术、茯苓、鳖甲、地骨皮、当归、熟地黄、白芍作为佐药可益气健脾，补气生血，滋补阴液，凉血除蒸，养血调经，滋阴柔肝。诸药合用，具有清热利湿，化瘀散结，行气止痛的功效，对于慢性盆腔炎具有很好的治疗效果[7]。
网络药理学可通过分析药物和疾病互作关系，探究药物活性成分、潜在作用靶点，筛选调节信号通路，最终达到提高药物治疗效果，降低毒副作用的目的。分子对接通过蛋白受体和药物分子配体间的相互作用辅助药物设计[8]。本研究应用网络药理学及分子对接技术筛选妇可靖胶囊和四黄散两种药物的有效成分及相关靶点，从分子机制层面为四黄散联合妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎提供理论基础。
2. 方法
2.1. 药物有效成分及靶点的获取
使用TCMSP数据库(http://tcmspw.com)搜索大黄、黄芩、黄连、黄柏、白术、北败酱、柴胡、车前子、赤芍、丹参、当归、党参、地骨皮、茯苓、海藻、红花、马齿苋、秦艽，三七、熟地、香附、延胡索，以口服生物利用度(Oralbioavailability, OB) ≥ 30%和类药性(Drug-likeness, DL) ≥ 0.18为标准对活性成分进行筛选，用UniProt数据库统一靶点名称和去除重复值后,得到有效靶点。使用HERB数据库(http://herb.ac.cn/)搜索鳖甲、蒲公英，运用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得其有效成分及SMILES(Simplified Molecular Input Line Entry System)号，后将SMILES号导入到Swiss数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)预测其有效靶点。
2.2. 疾病靶点的获取
以“chronic pelvic inflammatory disease”为关键词，搜索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、和OMIM数据库(https://omim.org/)，整合去重后得到慢性盆腔炎的相关靶点。
2.3. 交集靶点的获取
将“四黄散”、“妇可靖胶囊”和“慢性盆腔炎”三者的靶点导入Venny2.1.0软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中，获取三者的交集靶点，作为治疗慢性盆腔炎的潜在靶点。
2.4. “疾病–成分–靶点”网络的构建
将四黄散、妇可靖胶囊的活性成分，获取到的交集靶点数据导入Cytoscape3.9.1软件进行拓扑计算，并进行可视化分析以展示其相互关系。
2.5. PPI网络的构建
将“四黄散”、“妇可靖胶囊”和“慢性盆腔炎”三者的交集靶点导入STRING数据库(https://www.string-db.org)并进行PPI网络构建，生物背景设定为Homo sapiens，其他为默认设置，得到PPI网络；将PPI网络导入Cytoscape3.9.1中，使用Network Analyzer工具进行拓扑分析并优化网络图。
2.6. GO和KEGG富集分析
将“四黄散”、“妇可靖胶囊”和“慢性盆腔炎”三者的交集靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)，设置生物背景为Homo sapiens，进行GO分析和KEGG分析，并通过微生信平台将分析结果进行可视化展示。
2.7. 分子对接
选取PPI分析结果中度值前5的蛋白靶点与网络药理学筛选出的活性成分进行分子对接。在PubChem数据库中(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载化合物quercetin、β-sitosterol、luteolin、kaempferol、stigmasterol的3D结构mol2文件，在PDB数据库下载TNF、IL-1β、IL-6、AKT1、TP53的3D结构PDB文件。利用Chem 3D软件计算化合物的最小结合能；利用PyMOL软件对蛋白受体PDB文件进行预处理，去除水分子和不必要的结构。利用AutoDockTools软件进行分子对接，首先以蛋白质的活性位点为中心，在AutoDockTools中设置盒子和参数，并保存为GPF文件。运行自动对接网格，剔除对接效果不好的结果，最后结果通过PyMOL软件进行可视化展示。
3. 结果
3.1. 药物成分和靶点收集结果
结合TCMSP数据库和HERB数据库，以口服利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%，类药性(drug likeness, DL) ≥ 0.18为标准，筛选四黄散和妇可靖胶囊的药物成分和对应靶点，整合去重后合计得到301个药物成分和427个对应靶点。
3.2. 疾病靶点收集结果
以关键词“chronic pelvic inflammatory disease”检索GeneCards和OMIM数据库，去重整合得到4440个靶点。
3.3. 共同靶点以及“疾病–成分–靶点”网络图分析
Figure 1. Intersecting targets of Sihuang powder, Fukejing capsule, and chronic pelvic inflammatory disease
图1. 四黄散、妇可靖胶囊、慢性盆腔炎三者的交集靶点
将四黄散、妇可靖胶囊、慢性盆腔炎三者的潜在靶点取交集，绘制韦恩图(见图1)，最终得到159个交集靶点。在Cytoscape3.9.1软件中导入疾病名称、核心成分、交集靶点，构建“疾病–成分–靶点”网络(见图2)。使用Network Analyzer工具进行分析，结果得到289个活性成分，包含有槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、山奈酚、黄芩苷、异鼠李素、刺槐黄素、黄藤素、小檗碱等。
Figure 2. “Disease-component-target” network diagram
图2. “疾病–成分–靶点”网络图
Figure 3. PPI network diagram
图3. PPI网络图
3.4. PPI网络分析
将四黄散、妇可靖胶囊与慢性盆腔炎三者的交集靶点导入STRING数据库，设置生物背景为Homo sapiens，获取PPI网络，除去游离蛋白后，将数据导入Cytoscape3.9.1软件并使用Network Analyzer工具分析，依据度中心性、接近中心性、中介中心性大于等于其中位数，平均最短路径长度小于等于其中位数的规则筛选出核心靶点160个(见图3)，包括AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1β、JUN、CASP3、ESR1、PTGS2、EGFR等。
3.5. GO分析
将两种药物与疾病的交集靶点导入DAVID数据库，设置生物背景为Homo sapiens，进行GO富集分析，分别得到生物过程(BP) 744条；细胞成分(CC) 81条；分子功能(MF) 160条。利用微生信平台对三部分P值最小的前10项进行可视化展示(见图4)。其中，生物过程(BP)主要涉及对异生物刺激的反应、基因表达的正向调节、DNA触发转录的正向调节、RNA聚合酶II对转录的正向调节、miRNA转录的正向调节、细胞迁移的正向调节、细胞群体增殖的正向调节等；细胞成分(CC)主要包括细胞外空间、含蛋白质的复合体、核质、细胞外区域、染色质、细胞质、膜筏等；分子功能(MF)中主要涉及酶结合、蛋白质结合、相同蛋白质结合、核受体活性、转录激活子结合、蛋白质同源二聚化活性、泛素蛋白连接酶结合、蛋白激酶结合、DNA结合转录因子活性、核类固醇受体活性等。
Figure 4. GO enrichment analysis
图4. GO富集分析
3.6. KEGG富集分析
将两种药物与疾病的交集靶点导入DAVID数据库，设置生物背景为Homo sapiens，进行KEGG通路富集分析，共计富集到158条信号通路，条件设置为P < 0.05且FDR < 0.05 (错误发现率)，剔除不相关通路后，通过微生信平台对P值最小的前20项进行可视化展示(见图5)。结果显示，富集显著性较高的通路主要包括IL-17信号通路、TNF信号通路、p53信号途径、C型凝集素受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等。
Figure 5. KEGG enrichment analysis
图5. KEGG富集分析
Figure 6. (A) Quercetin-AKT1 docking result; (B) Quercetin-TNF docking result; (C) Quercetin-IL-6; docking result (D) Kaempferol-AKT1 docking result; (E) Kaempferol-TNF docking result; (F) Luteolin-IL-6 docking result
图6. (A) Quercetin-AKT1对接结果；(B) Quercetin-TNF对接结果；(C) Quercetin-IL-6对接结果；(D) kaempferolakt1对接结果；(E) Kaempferol-TNF对接结果；(F) Luteolin-IL-6对接结果
3.7. 分子对接
一般情况下，结合能小于−5.0 kcal/mol说明配体和蛋白受体有良好的结合活性，结合能小于−8.0 kcal/mol可证明配体和蛋白受体有较强的结合活性。剔除无法对接的结果后，最终得到槲皮素(quercetin)与AKT1的结合能为−6.1 kcal/mol，与IL-6的结合能为−6.9 kcal/mol，有良好的结合活性，槲皮素(quercetin)与TNF的结合能为−8.7 kcal/mol，有较强的结合活性；山奈酚(kaempferol)与AKT1的结合能为−6.1 kcal/mol，结合效果良好，山奈酚(kaempferol)与TNF的结合能为−8.6 kcal/mol，结合更为紧密；木犀草素(luteolin)与IL-6的结合能为−7.2 kcal/mol，结合活性良好(见图6)。
4. 讨论
本研究结合网络药理学和分子对接两种方法深入挖掘了四黄散和妇可靖胶囊治疗慢性盆腔炎的主要活性成分以及相关蛋白靶点。网络药理学筛选后共得到四黄散、妇可靖胶囊的主要活性成分289种，主要包含槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山奈酚、黄芩苷、小檗碱等，其中木犀草素、槲皮素、山奈酚可下调TNF-α、IL-6等促炎因子的表达，减轻炎性因子的刺激，从而缓解慢性盆腔炎引起的小腹、腰骶部坠胀疼痛等不适[9]。慢性盆腔炎引起的局部活化巨噬细胞会分泌过量的炎性介质NO，槲皮素可通过调节MAPK信号通路，下调iNOS蛋白的表达，减少炎性介质NO的释放，进而发挥抗炎作用[10] [11]；山奈酚可阻断IκBα磷酸化，使NF-κB无法进入细胞激活下游炎性因子的表达，从而降低炎性因子的释放[12]；木犀草素可抑制细胞核p65的表达，从而阻断NF-κB信号，达到抗炎目的[13]。PPI网络拓扑分析得到治疗慢性盆腔炎的关键核心靶点160个，包括AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1β等。TNF和IL-6作为促炎细胞因子，感染炎症时，其指数会升高，因此可作为慢性盆腔炎的治疗靶标[8]；AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信号通路中的重要下游因子，可通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥治疗慢性盆腔炎的作用[14]。分子对接的结果表明槲皮素与AKT1、IL-6、TNF具备较好的结合活性；山奈酚与AKT1和TNF结合更为紧密；木犀草素与IL-6结合活性良好，再次验证了网络药理分析结果的可行性。GO分析和KEGG通路富集分析的结果表明，四黄散和妇可靖胶囊联用治疗慢性盆腔炎的靶点蛋白和信号通路与炎症反应、免疫反应高度相关，与药物活性成分分析得到的槲皮素、山奈酚、木犀草素等表现出的抗炎效果一致。IL-17、TNF、PI3K-Akt等信号通路为治疗慢性盆腔炎的关键通路。TNF、IL-17作为促炎细胞因子，可加剧炎症反应，研究表明，以丹参、当归、香附为主的清炎方可降低机体炎症反应并改善免疫功能[15]；PI3K/AKT信号通路可调节炎症反应，调控下游细胞因子，实验证明，患有慢性盆腔炎的大鼠的PI3K/AKT信号通路已被激活，给药抑制PI3K/AKT信号通路后对慢性盆腔炎有较好的治疗效果[16]。
5. 结论
综上所述，四黄散和妇可靖胶囊通过槲皮素、木犀草素、山奈酚等主要活性成分，与AKT1、TNF、IL-6等蛋白靶点相结合，调节IL7、TNF、PI3K/AKT等信号通路，达到治疗慢性盆腔炎的目的。四黄散和妇可靖胶囊的药物组分偏多，慢性盆腔炎的发病机制复杂，通过网络药理学的分析方法可从整体水平上分析筛选药物的活性成分，作用靶点和信号通路，初步探究两种药物联用治疗慢性盆腔炎的主要活性成分和可能的作用机制，分子对接可初步验证成分与蛋白靶点的互作结果，为后续设计实验，深入研究四黄散、妇可靖胶囊联用治疗慢性盆腔炎的机制奠定研究基础。
致 谢
本研究感谢邓向亮老师和蔡雪梅老师的思路指导；感谢课题组同门的鼎力支持；感谢广东省中医药局的基金支持。
基金项目
广东省中医药局中医药科研项目(20221477)。
NOTES
*通讯作者。