基于MB/PPy/COFs纳米复合材料构建超灵敏电化学生物传感器用于尿酸检测

An Ultra-Sensitive Electrochemical Biosensor Was Constructed Based on MB/PPy/COFs Nanocomposites for Uric Acid Detection

摘要: 基于亚甲基蓝(MB)、聚吡咯(PPy)和COFs构建了一种具有高选择性和高灵敏度的新型电化学生物传感器用于检测尿酸(UA)。该电化学生物传感器无需其他外在电化学信号物可直接产生电化学响应信号。实验结果表明，该传感器的氧化峰电流与UA浓度的对数呈现良好线性关系，检测范围为10 ng/mL~10000 ng/mL，检测限为2 ng/mL。此外，构建传感器的基底材料间具有良好的协同作用，MB的电子传递、PPy的导电性和COFs的孔道与比表面积优势三者的功能互补，显著提升电催化效率，为UA的快速、灵敏检测提供了新型传感平台。该研究拓展了COFs基纳米复合材料在生物医学检测中的应用，有望助力临床诊断和健康监测。

Abstract: A novel electrochemical biosensor with high selectivity and high sensitivity was constructed based on methylene blue (MB), polypyrrole (PPy) and COFs for the detection of uric acid (UA). This electrochemical biosensor can directly generate electrochemical response signals without the need for other external electrochemical signal substances. Experimental analysis shows that the oxidation peak current of this sensor presents a good linear relationship with the logarithm of UA concentration. The detection range is 10 ng/mL~10,000 ng/mL, and the detection limit is 2 ng/mL. In addition, this sensor also has a good material synergy. The complementary functions of the electron transfer of MB, the conductivity of PPy, and the pore and specific surface area advantages of COFs significantly enhance the electrocatalytic efficiency, providing a new sensing platform for the rapid and sensitive detection of UA. This research expands the application of CoFs-based nanocomposites in biomedical detection and is expected to contribute to clinical diagnosis and health monitoring.

1. 引言

尿酸(UA)是人体内嘌呤代谢的最终产物，一般以尿酸盐的形式存在于血液中，主要由人体自身细胞代谢过程产生，例如细胞更新、核酸分解等均会产生嘌呤，最终经过代谢生成尿酸，也可通过日常饮食摄入富有嘌呤的食物，例如海鲜、肉类、动物内脏等，这些食物中的嘌呤经肠道吸收后代谢产物是尿酸。尿酸作为一种重要的神经递质，在人体新陈代谢中起着关键作用，其血清含量与多种疾病的诊断、监测、预防和治疗密切相关，如高血压、肾脏疾病、痛风和关节炎等[1]。目前为止，人们对尿酸含量检测开展了大量的探究。现有检测方法是比色法[2]，高效液相色谱法[3]，酶联免疫吸附法[4]，这些方法易受样本中其他物质干扰，或者高度依赖精密仪器，操作程序繁琐、耗时和灵敏度有限等因素限制，在实际应用中受到了限制。因此，开发一种高效、准确、灵敏的尿酸检测方法对于人体健康和临床诊断具有重要意义。基于电化学生物传感器对尿酸的检测因其具有选择性高、经济、快速、易于小型化而受到越来越多的关注。

因MB/PPy/COFs纳米复合材料之间的协同效应，极大提高了电化学响应信号，增强了电化学生物传感器的灵敏度。MB作为电子媒介体，能够加速UA氧化过程中的电子转移速率，显著提升响应电流信号[5]。其与COFs的氢键或π-π相互作用可增强材料稳定性。导电聚合物PPy提供高电导率，同时其多孔结构可负载更多MB分子，并通过化学交联与COFs结合，形成三维导电网络，提高复合材料比表面积和离子扩散效率。COFs的高比表面积和可调控孔道结构为UA分子提供大量吸附位点，同时其表面官能团(如氨基、羟基)可通过共价键固定MB和PPy，形成稳定复合界面[3]。

综上所述，基于MB/PPy/COFs纳米复合材料构建电化学生物传感器用于检测尿酸，对影响尿酸检测灵敏度的因素进行了优化，包括MB/PPy/COFs浓度、测试液pH、反应温度和反应时间，进一步提高了尿酸检测的灵敏度和选择性。

2. 实验部分

2.1. 实验主要试剂和仪器

2.1.1. 主要试剂

实验所用试剂见表1。

Table 1. Experimental reagents

表1. 实验试剂

试剂名称	分子式	规格	生产厂家
亚甲基蓝	C16H18ClN3S	99.5%	阿拉丁试剂有限公司
氯化钠	NaCl	99.5%	阿拉丁试剂有限公司
磷酸氢二钠	Na2HPO4	99%	阿拉丁试剂有限公司
牛血清白蛋白	BSA	AR	阿拉丁试剂有限公司
氯化钾	KCl	99.5%	阿拉丁试剂有限公司
过二硫酸钾	K2S2O8	38%	阿拉丁试剂有限公司
戊二醛	C5H8O2	50%	阿拉丁试剂有限公司
磷酸二氢钠	NaH2PO4	99%	阿拉丁试剂有限公司
吡咯	C4H5N	99%	阿拉丁试剂有限公司
乙醇	CH3CH2OH	99.7%	国药化学试剂有限公司
硝酸	HNO3	AR	国药化学试剂有限公司
乙酸	CH3COOH	AR	国药化学试剂有限公司
硫酸	H2SO4	AR	国药化学试剂有限公司
1,4-二氧六环	C4H8O2	AR	国药化学试剂有限公司
正丁醇	C4H10O	AR	国药化学试剂有限公司
甲醇	CH3OH	AR	国药化学试剂有限公司
丙酮	C3H6O	AR	国药化学试剂有限公司
1,3,5-三(4-氨苯基)苯	C24H21N3	97%	上海麦克林生化科技有限公司
2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛	C10H10O4	98%	上海麦克林生化科技有限公司

2.1.2. 实验仪器

实验所用仪器见表2。

Table 2. Experimental instruments

表2. 实验仪器

仪器名称	型号	生产厂家
pH计	PHS-3C	上海雷磁有限公司
电化学工作站	CHI660D	上海辰华仪器有限公司
真空干燥箱		精宏实验仪器有限公司
BGZ系列加热烘箱		上海博迅工业贸易有限公司
扫描电子显微镜	S-4800	日本日立有限公司
傅里叶变换红外光谱仪	iS50	美国尼科拉仪器有限公司有限公司
X射线光电子能谱	250Xi	美国热电公司
分析天平	HZK	华志科技有限公司
高分辨透射电子显微镜	JEM-2100	日本JEOL公司

2.2. MB/PPy/COFs纳米复合材料的制备

利用水热生长法制备水溶性MB/PPy/COFs纳米复合材料，制备方法基于已有文献的合成方法并做了些许改进[6]。具体如下：首先，称取0.25 g的亚甲基蓝于100 mL的烧杯中，并加入50 mL的二次水溶解。然后加入50 μL的吡咯和5 mL的戊二醛，最后加入0.1 M的盐酸，调节反应体系的pH值至酸性。室温下超声0.5 h并搅拌，随后加入0.6 g过二硫酸钾，保持6 h。此过程中，吡咯单体在过二硫酸钾的作用下，通过氧化聚合形成聚吡咯，同时以亚甲基蓝为电活性中心，聚吡咯对亚甲基蓝进行修饰，形成“包覆”结构。反应结束后，并依次使用去离子水和乙醇分别对复合材料进行洗涤处理，随后在真空干燥箱中50℃干燥，进而获得MB/PPy复合材料。

量取1,4-二氧六环、正丁醇和甲醇三种溶液，按照体积比4:4:1配置混合溶液18 mL。称取TAPB 10.5 mg和DMTP 18.7 mg于混合溶液中并搅拌，随后加入10.5 mg的MB/PPy复合材料于混合溶液中，并加入0.2 mL的冰醋酸调节反应体系酸碱度，加快反应进程，同时与反应物发生相互作用，通过质子化等方式活化反应物，降低反应活化能。随后，混合体系在室温下超声0.5 h，使得反应物均匀分散于混合溶液中。最后将混合溶液转移至反应釜中，再加入1.2 mL冰醋酸活化，并加入20 mL的乙醇，紧接着将反应釜置于烘箱中70℃反应24 h。反应完成后，将反应液进行离心处理，并使用四氢呋喃和乙醇分别对复合材料进行离心洗涤，然后将固体离心物置于真空干燥箱中干12 h，从而得到MB/PPy/COFs纳米复合材料。

根据文献报道方法，合成单一的MB/PPy [7]和COF [8]。

2.3. 电化学生物传感器制备

首先，将玻碳电极(GCE，直径3 mm)在1.0、0.3和0.05 μm氧化铝粉上进行抛光处理，并依次在去离子水、乙醇和去离子水中交替超声洗涤，去离子水冲洗电极表面并用氮气吹干得到镜状表面。接着，在处理后的玻碳电极表面滴加10.0 μL MB/PPy/COFs纳米复合材料溶液(1 mg/mL)，空气中自然晾干，待用。

2.4. UA的电化学测定

所有的电化学测量均在室温下进行，并采用传统的三电极系统：以上述电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极。采用电化学阻抗谱(EIS)研究了免疫传感器的制备附载过程。测试条件为5.0 mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和0.1 M KCl的混合溶液，频率为0.01 Hz~100 kHz，振幅为5 mV。工作电极在37℃下孵育一系列不同浓度的UA (10.0 μL) 60分钟，然后将10 μL BSA (1%)滴加在GCE表面，在37℃下孵育1 h，以差分脉冲伏安法(DPV)作为测试方法，电解质溶液为0.01 M PBS溶液(pH = 10)作为检测液。测试电压从−0.4 V到−0.15 V之间进行DPV响应信号的记录，振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.05 s，静置时间为2 s，灵敏度为10⁻³ A/V。

2.5. 电化学测量原理

首先MB/PPy/COFs纳米复合材料通过简单的化学聚合方法制备而成，MB作为氧化还原活性分子，本身具有可逆的氧化还原特性(MB⁺/MB²⁺)，可作为电子媒介体[9]。PPy作为导电聚合物，具有高电导率和较大的比表面积，可在电极表面形成导电网络，加速电子传递，其表面的吡咯环结构具有一定的吸附作用，可以富集目标物，同时可以提高检测灵敏度。COFs具有规则的多孔结构和可调的孔径，可以提供超大比表面积和丰富的活性位点，能增强其对目标物的吸附能力，其具有很好的化学稳定性和结构刚性，可以改善复合材料的机械性能，避免电极表面在检测过程中脱落。通过形成化学键和静电力等方式将三种材料复合在一起，从而形成MB/PPy/COFs纳米复合材料[10]。

MB/PPy/COFs纳米复合材料三者结合形成“导电基质(PPy)–电子媒介体(MB)–吸附载体(COFs)”的三维结构。COFs富集尿酸分子并传输至PPy/MB界面；PPy加速电子传导，MB介导尿酸与电极间的电子转移，降低氧化反应的活化能，使尿酸在较低电位下即可发生氧化[11]。尿酸分子通过COFs的孔道扩散至电极表面，被PPy和COFs的极性位点吸附富集，在施加的正向电位下，尿酸失去电子被氧化，生成的电子通过PPy导电网络传递至GCE基底，同时MB作为媒介体，通过自身氧化还原态的循环促进电子跳跃，加速这一过程[12]。氧化反应产生的法拉第电流与尿酸浓度成正比，然后通过差分脉冲伏安法采集电流信号，基于响应信号与UA的浓度的相关性，从而实现对UA的定量检测，如图1所示。

Figure 1. Schematic diagram of the preparation process of MB/PPy/COFs nanocomposites and the construction process of electrochemical sensors

图1. MB/PPy/COFs纳米复合材料的制备过程及电化学传感器构建过程示意图

2.6. 纳米复合材料的表征

采用扫描电子显微镜(SEM)技术对合成的MB/PPy和MB/PPy/COFs纳米复合材料的形貌进行了表征。如图2(A)所示，MB/PPy复合材料在图像中呈现出大量不规则的颗粒聚集体。这些颗粒并非规则球形，而是具有复杂的轮廓，表面凹凸不平。如图2(B)所示，MB/PPy/COFs材料在图像中的颗粒呈现出不规则形状，没有明显的几何对称性，颗粒表面粗糙，存在许多微小的凸起和凹陷，显示出复杂的表面结构。这是因为MB、PPy和COFs在氧化聚合过程中，分子间的反应是随机且复杂的，COFs的多孔结构和独特骨架也会影响聚合产物的生长方向，导致最终颗粒形态各异。这种不规则形态增加了材料的比表面积，使其可能具有更多的活性位点，在吸附、催化等应用中更具备潜在优势。颗粒还存在明显的团聚现象，形成大小不一的聚集体，聚集体之间存在一定的空隙[13]。这主要是因为纳米颗粒具有较高的表面能，为降低表面能，颗粒倾向于相互靠近聚集。此外，COFs的孔道结构可能会捕获一些聚合产物，促进团聚。适当的空隙可以为物质传输提供通道，在吸附、分离等应用中有利于分子的扩散和传输。综上得出MB/PPy/COFs纳米复合材料成功制备。

通过分析XRD探究了MB/PPy/COFs纳米材料的晶型结构。从图3(A)可以看出，COFs的衍射峰出现在2.78˚、4.87˚、5.64˚、7.47˚、9.40˚和25.73˚这六个位置[8]，这是COFs在低角度呈现典型的结晶衍射峰，是其有序晶体结构的标志。MB/PPy在8.27˚、10.89˚、12.61˚、13.81˚等位置有特征峰，对应MB和PPy的分子堆积或结晶结构。对于MB/PPy/COFs纳米粒子，其衍射峰出现在7.04˚、9.58˚、11.36˚、12.68˚、15.63˚、20.19˚和24.27˚这七个位置。其保留COFs特征峰，如4.87˚、7.47˚、9.40˚附近的峰(虽强度或峰形略有变化，但位置吻合)，证明COFs的骨架结构在复合材料中得以保留。保留MB/PPy特征峰，如13.81˚、16.83˚附近的峰，表明MB和PPy成功负载于COFs上。MB/PPy/COFs曲线并非COFs、MB/PPy曲线的简单叠加，部分峰(如25.73˚附近，COFs为25.73˚，MB/PPy为25.46˚，复合材料为24.27˚左右)显示出相互作用导致的晶体结构调整(如分子间相互作用、堆积方式改变)，而非物理混合。对比三者图谱，MB/PPy/COFs的XRD峰同时包含COFs和MB/PPy的特征，且具有独特的峰形组合(如15.63˚、20.19˚、24.27˚等峰，既非纯COFs也非纯MB/PPy所有)，证明其为新的物相(复合材料)，而非各组分的机械混合。综上，图3(A)的XRD数据从晶体结构层面，全面证明了MB/PPy/COFs复合材料的成功制备。

Figure 2. SEM test results of nanocomposites: (A) MB/PPy, (B) MB/PPy/COF

图2. 纳米复合材料SEM测试结果：(A) MB/PPy, (B) MB/PPy/COF

Figure 3. (A) XRD patterns of nanomaterials, (B) Infrared spectra of different products: (a) MB/PPy/COFs, (b) MB/PPy, (c) COFs

图3. (A) 纳米材料的XRD图像，(B) 不同产物红外谱图：(a) MB/PPy/COFs，(b) MB/PPy，(c) COFs

图3(B)中b曲线是MB/PPy材料的红外谱图，如图所示，在3420.7 cm⁻¹ (N-H或O-H伸缩振动，PPy中吡咯环的N-H及MB中杂环的O-H特征)、1603.4 cm⁻¹ (C=C骨架振动，PPy共轭结构)、1408.9 cm⁻¹ (C-N伸缩振动，PPy特征)等，在a曲线中以3414.1 cm⁻¹ (峰位微移，复合后氢键或π-π作用影响)、1679.0 cm⁻¹ (C=C/C=N共轭增强，MB/PPy与COFs骨架的共轭耦合)、1408.9 cm⁻¹ (C-N振动保留)形式存在，证明MB/PPy的结构单元被引入。c曲线是COFs材料的红外光谱图，在2926.7 cm⁻¹ (C-H伸缩振动)、2843.5 cm⁻¹ (饱和C-H弯曲振动)、1624.8 cm⁻¹ (C=N或C=C伸缩振动，COFs骨架特征)等，在a曲线中均有对应(如2971.2 cm⁻¹峰位略移，可能因复合后分子间相互作用，仍体现COFs的结构贡献)。a曲线中部分峰(如COFs的2926.7 cm⁻¹变为2971.2 cm⁻¹，MB/PPy的3420.7 cm⁻¹变为3414.1 cm⁻¹)，反映了MB/PPy与COFs之间的相互作用(如氢键、π-π堆叠)，导致化学键振动环境改变。a曲线中既有COFs骨架的强峰(如1679.0 cm⁻¹附近的共轭振动峰，继承COFs的刚性骨架)，也有MB/PPy的特征峰(如1408.9 cm⁻¹的C-N振动，体现PPy的导电聚合物结构)，强度分布表明两者在复合材料中均匀复合，而非简单物理混合(若为混合，峰强应是b曲线和图c曲线的线性叠加，而a曲线呈现协同增强或调整，由此表明MB/PPy/COFs纳米复合材料成功制备。

Figure 4. XPS spectra of MB/PPy/COFs nanocomposites: (A) Full-spectrum analysis diagram; (B) S2p spectrogram; (C) C1s spectrogram; (D) N1s spectrum

图4. MB/PPy/COFs纳米复合材料的XPS图谱：(A) 全谱分析图；(B) S2p光谱图；C1s光谱图；(D) N1s光谱图

为了考察纳米复合材料表面各元素的化学状态，我们对纳米复合材料进行了X射线光电子能谱(XPS)表征，结果如图4(A)~(D)所示，各元素的结合能参照C1s的结合能284.6 eV进行标准化。图4(A)为MB/PPy/COFs纳米复合材料的XPS全谱分析图，从图中可以观察到峰值为533.13 eV、399.46 eV、284.8 eV和168.49 eV分别为O1s、N1s、C1s和S2p的结合能。图4(B)为S2p的光谱图，由图中观察到S2p结合能分布，在168.49 eV为硫醚键(-S-)，是来自MB的噻嗪环，或者是COFs材料中的DMTP的硫取代基，并且无168 eV以上的峰，表明未检测到磺酸基(−SO₃H)，这说明在氧化聚合过程中硫未被显著氧化，且保持原始硫醚结构。硫元素的存在确认了MB和COFs的引入，硫醚键的保留表明氧化聚合未破坏硫官能团。图4(C)为C1s的光谱图，由图可得在284.8 eV (主峰)出为sp²杂化碳(芳香族碳)，来自PPy的共轭骨架、COFs的苯环及MB的噻嗪环结构。在285.98 eV (次峰)出可能为sp³杂化碳(脂肪族碳)，或者为(C-N、C-S键)中与N/S相连的碳。在288.25 eV、290.96 eV出为氧化态碳，表明氧化聚合过程中部分碳被氧化。碳元素的多化学环境分布证实了PPy、COFs和MB中碳骨架的共存，且氧化聚合导致部分碳官能团转化。图4(D)为N1s的光谱图，由图可得在399.46 eV出为吡啶型氮(PPy环内氮)和氨基(TAPB的−NH₂)。在401~402 eV (肩峰)出为季铵氮(PPy氧化后形成的N⁺)或者为MB中的三甲氨基(−N(CH₃)₃)。氮的存在及不同化学环境(吡啶氮、氨基、季铵氮)验证了PPy、MB和COFs的成功聚合，季铵氮的出现表明PPy发生了氧化掺杂，表明通过氧化聚合生成了导电PPy链。

综上所述，XPS分析表明C、N、S、O的存在与MB、PPy和COFs的组成一致，PPy的共轭结构(sp²碳、吡啶氮)和氧化掺杂(季铵氮)证实其聚合状态。MB的硫醚键和COFs的氨基未完全消失，表明通过氧化聚合形成共价连接而非完全分解。各组分的特征官能团均被检测到，且存在氧化聚合导致的化学环境变化。表明各组分通过共价键连接，形成具有多元官能团的共轭体系，表明MB/PPy/COFs纳米复合材料成功制备。

2.7. 电化学传感器可行性分析

通过差分脉冲伏安法(DPV)对所提出的UA测定方法的可行性进行分析，如图5(A)所示，a曲线是裸玻碳电极(GCE)表面未修饰任何功能性材料，没有电活性物质而无明显电化学响应。b曲线是在a曲线的基础上附载MB/PPy/COFs纳米复合材料，在复合材料中，PPy虽具有导电性，COFs有高比表面积，MB可作为电子媒介体，但此时无尿酸参与反应，仅体现复合材料自身的背景电化学信号，故信号较弱。c曲线是在b曲线的基础上滴加UA，滴加UA后，MB加速UA的氧化还原反应，PPy促进电子传递，COFs 的高比表面积增加UA吸附量，三者协同作用使电化学反应显著增强，产生较强的DPV信号[14]。d曲线是在c曲线的基础上滴加上BSA，BSA为蛋白质，滴加后会部分覆盖电极表面活性位点，一定程度抑制UA反应，导致信号相较于c曲线减弱。但UA已部分结合于电极，且复合材料仍有部分活性位点可参与反应，因此信号仍高于b曲线。因此UA的存在会导致电化学信号增强，最终所构建的电化学传感器可以用来检测UA。

Figure 5. (A) DPV test results of the electrode modification process: (a) Naked GCE, (b) MB/PPy/COFs/GCE, (c) UA/MB/PPy/COFs/GCE, (d) BSA/UA/MB/PPy/COFs/GCE DPV was performed in 0.01 M PBS (pH = 10); (B) Impedance diagrams of different products

图5. (A) 电极修饰过程的DPV测试结果：(a) 裸GCE，(b) MB/PPy/COFs/GCE，(c) UA/MB/PPy/COFs/GCE，(d) BSA/UA/MB/PPy/COFs/GCEDPV在0.01 M PBS (pH = 10)中进行；(B) 不同产物阻抗图

图5(B)为不同产物阻抗图，对于MB/PPy材料，在低频区呈现明显的阻抗尾(向下弯曲)，表明扩散控制显著(离子/电子扩散阻力大)，高频区半圆对应电荷转移电阻，整体阻抗较高，限制电荷传输效率。对于COFs材料，无明显阻抗尾，高频区半圆较窄，说明扩散阻力小(COFs多孔结构利于传质)。对于MB/PPy/COFs材料，在低频区，斜率接近直线(阻抗显著降低)，表明扩散阻力大幅减小(MB/PPy与COFs协同，改善离子/电子扩散路径，如COFs多孔骨架提供快速通道，MB/PPy增强界面电荷传输)。在高频区，曲线介于两者之间，既保留COFs的低扩散阻力，又通过MB/PPy的共轭结构优化电荷转移电阻(如π-π堆积促进电子传导，或MB的活性加速电荷交换)，整体阻抗特性更优。MB/PPy/COFs材料结合MB/PPy的电子传导能力(共轭聚合物，利于电子迁移)和COFs的多孔结构(低扩散阻力，加速离子/分子传质)，形成“电子–离子双通道”，显著降低电化学阻抗。MB/PPy/COFs材料的阻抗曲线更平滑，无明显畸变，表明结构稳定性增强(COFs骨架支撑MB/PPy，抑制其在循环中的结构坍塌，提升长期电化学性能)。综上所述MB/PPy/COFs复合材料通过组分协同，实现了扩散阻力降低、电荷转移加速、结构稳定性增强，其阻抗特性显著优于单一组分。

2.8. 电化学传感器响应条件的优化

Figure 6. Influencing factors: (A) pH of PBS solution; (B) Mass ratio of MB/PPy to COFs; (C) Incubation temperature of UA; (D) Incubation time of UA

图6. 影响因素：(A) PBS溶液pH；(B) MB/PPy与COFs的质量比；(C) UA孵化温度；(D) UA孵化时间

通过对实验条件的优化，包括测试溶液的pH值、UA孵化的温度与时间，使得免疫传感器达到最优的检测性能。

电解质溶液的pH值变化显著影响峰电流(Ipa)大小，同时UA的活性也受到pH值的影响，因此合适的pH值是影响传感器响应信号的关键因素。如图6(A)所示：曲线呈现先上升后下降的趋势，在pH = 10左右时电流达到峰值。pH值影响UA的离解状态及复合材料表面电荷分布，进而作用于电子转移过程。pH值过低或过高时，UA的存在形式不利于在电极上氧化，或者是复合材料的活性位点受抑制，导致峰电流减小；而在pH = 10时，UA离解状态与复合材料表面性质匹配最佳，电子转移效率高，电化学信号最强，检测效果最佳。

MB/PPy：COFs的不同质量比例对峰电流大小有影响，如图6(B)所示，曲线呈现先上升后下降，在MB/PPy：COF = 3:1时，电流达到峰值。COFs比例低，多孔吸附能力不足，UA传质受限；MB/PPy过量团聚，活性位点暴露少，电荷转移效率低(如PPy堆积阻塞COFs孔道，MB分子间相互作用增强，催化活性下降)。达到最佳比例时，COFs多孔骨架充分支撑MB/PPy分散(无团聚)，孔道匹配UA尺寸，高效吸附富集(提高局部浓度)；PPy形成三维导电网络，快速传输电子；MB均匀分布，作为介体加速UA氧化(耦合反应提升法拉第电流)。COFs孔道开放(保留高比表面积)，PPy网络完整(电子传输高效)，MB分散均匀(催化位点充足)，共同推动UA氧化反应的热力学(平衡电位)和动力学(反应速率)最佳，使DPV信号最大化，MB/PPy：COF = 3:1为最佳比例。

孵育时的温度对峰电流大小也有影响，如图6(C)所示：曲线先上升后下降，在37℃左右电流达到峰值。温度影响分子扩散速率与反应动力学。低温时分子扩散慢，反应速率低，电流小；适当升温可以加快扩散与反应，电流增大。但温度过高可能破坏复合材料结构或促使尿酸分解，导致电流下降。37℃左右时，扩散与反应速率达到平衡，检测电流最大，为最适宜孵育温度。

孵育时间对峰电流大小也有较强的影响，如图6(D)所示：电流随孵育时间延长逐渐上升，至120 min左右趋于平稳。孵育时间短，导致UA与复合材料接触不充分，反应不完全，电流小；随着时间增加，反应逐步充分，电流增大。120 min左右时，反应接近平衡，延长时间对电流提升无显著作用，故最佳孵育时间约为120 min。

综上所述，通过对pH、孵育温度和孵育时间的优化分析，确定了该电化学传感器检测UA的最佳条件：pH = 10、孵育温度37℃、孵育时间120 min。在这些条件下，尿酸与MB/PPy/COFs纳米复合材料的相互作用最充分，电极反应的电化学信号最强，可实现对UA的高灵敏度检测。

2.9. 电化学传感器的性能

Figure 7. (A) Current response of the biosensor to UA concentration; (B) Calibration curve of the logarithm of the sensor peak current response and UA concentration

图7. (A) 生物传感器对UA浓度的电流响应；(B) 传感器峰电流响应与UA浓度的对数的校准曲线

在最优条件下进行电化学测量，分析电化学生物传感器对UA的检测性能。如图7(A)所示，电流响应信号随着UA浓度的增大而增大。随着UA浓度的增加，电流响应的绝对值呈现出明显的变化趋势。这表明该传感器对UA浓度具有良好的响应特性，浓度越高，电化学反应越显著，产生的电流信号越强。这种浓度依赖的响应特性说明传感器能够有效区分不同浓度的UA，具备作为检测工具的基本性能，对UA具有灵敏的识别与信号输出能力。并且UA浓度的对数值与峰电流呈现线性关系，结果如图7(B)中所示。线性回归方程：

I = 35.85 logC_UA + 10.67 (R² = 0.9963, S/N = 1.7)

I (μA)为峰值电流，C (ng/mL)为UA浓度，线性范围为10 ng/mL~10000 ng/mL，检测限为2 ng/mL (S/N = 1.7)。如表3所示，通过与文献报道中的其他UA传感器进行对比，可以看出此传感器线性范围宽、检测限低，对于检测UA电化学性能具有可比性或更好。

Table 3. Comparison with other detection methods

表3. 与其他检测方法的对比

传感器	线性范围(μm)	检出限(μm)	检测方法	文献
β-CD/CPE	10~170	4.6	A	[15]
UOx-GO/PANI/Nf-Gr/Pt	3~300	3	A	[16]
3D-LGSPZs/GCE	5~560 560~2620	0.27	CV	[17]
Co3O4-ERGO/SPE	5~500	1.5	DPV	[18]
BSAT/LIG	20~1000	2.1	DPV	[19]
MB/PPy/COFs/GCE	10~10000	2	DPV	本工作

2.10. 电化学传感器的选择性、重现性和稳定性

如图8所示，通过选择一些可能的干扰物质进行对照实验来评估传感器的特异性。将10000 ng/m AA、DA与100 ng/mL UA进行混合，用构建的传感器进行检测。单独用10000 ng/m AA、DA分别与构建的传感器进行检测，最后用水洗后的10000 ng/m AA、DA与构建的传感器进行检测。UA与干扰物质混合时：电流值低于单独检测UA时，但仍显著高于AA和DA单独检测时的电流。这表明AA和DA对UA检测有一定干扰，但传感器仍能识别UA，具备一定的抗干扰能力。干扰物质单独检测(AA、DA)时：电流值远低于尿酸检测值，说明传感器对AA和DA的响应微弱，对UA具有较好的选择性，可减少这些物质对UA检测的干扰。干扰物质水洗后检测(AA + 水洗、DA + 水洗)时：电流值进一步降低，表明水洗可去除部分干扰物质，验证了传感器在实际应用中通过简单处理能提升抗干扰性能，增强检测的准确性[20]。

Figure 8. Current responses of the sensor to UA, UA + AA + DA, AA, DA, AA+ water washing, and DA+ water washing respectively (UA concentration is 100 ng/mL, interfering substance concentration is 10,000 ng/mL)

图8. 传感器分别对UA，UA + AA + DA，AA，DA，AA+水洗，DA+水洗的电流响应(UA浓度为100 ng/mL，干扰物质浓度为10000 ng/mL)

综上所得，该传感器对UA检测具有较好的选择性和一定的抗干扰能力，在复杂体系中(如存在AA、DA时)仍可有效检测UA，且通过简单水洗处理能进一步降低干扰影响，适用于实际样品中UA的检测。

使用7个平行修饰电极在最佳条件下对200 ng/mL UA进行检测，以测试传感器的重现性，如表4所示，相对标准偏差为0.72 %，说明重现性优异。

Table 4. Reproducibility test of the prepared sensor (n = 7)

表4. 制备的传感器的重现性测试(n = 7)

组数	电流强度(μA)	平均值(μA)	RSD (%)
1	88.17	88.33	0.72
2	88.36
3	88.61
4	88.72
5	88.48
6	87.93
7	88.04

Figure 9. (A) Stability test of MB/PPy/COFs, (B) Tests after saving for different periods of time

图9. (A) MB/PPy/COFs稳定性测试，(B) 保存不同时间后测试

图9(A)是MB/PPy/COFs纳米复合材料在相同条件下测得DPV数据所拟合成均值和误差柱状图。由图可得：

MB/PPy/COFs纳米复合材料具有较高信号重复性：各柱状高度接近都约为68 μA，波动范围小，误差较小，表明每次测试中材料的电活性物质响应及电子传递效率较一致，说明复合材料在电化学测试中结构稳定，电活性位点不易流失或改变，稳定性较好。

MB/PPy/COFs纳米复合材料具有电活性物质响应稳定性：DPV信号直接关联电活性物质的氧化还原行为。信号稳定表明每次测试中参与反应的电活性位点数量基本恒定，说明复合材料内部结构稳固，各组分对电活性物质的支撑与协同作用稳定，未出现活性位点流失或结构坍塌。

MB/PPy/COFs纳米复合材料具有材料组成协同性：PPy的导电性与稳定性、COFs的规整结构，与MB形成强相互作用及稳定复合结构，可保障整体材料的电化学稳定性。信号均值稳定间接反映了这种协同结构在测试中的可靠性。

传感器的稳定性是通过长期储存实验来进行评估的。如图9(B)所示，1天和3天的电流值几乎无差异，表明传感器在短期保存(3天内)时，性能稳定，纳米复合材料的活性位点未受明显影响，能保持高效的电化学反应响应。7天的电流值较1~3天有所下降，但降幅较小。这可能是由于材料表面轻微变化或少量活性位点失活，但整体仍维持较高响应，说明传感器在中期保存时稳定性依然良好。14天和28天的电流值持续下降，但即使到28天，仍保持一定水平。这表明尽管随时间延长，材料可能发生缓慢变化，但传感器仍具备检测能力，长期稳定性较为优异。

3. 总结

本文构建一种电化学生物传感方法用于检测UA，制备的MB/PPy/COFs纳米复合材料作为传感器的基底材料显示出较为突出的优点。MB具有良好的电化学活性，PPy作为导电聚合物可有效促进电子传输，二者与COFs结合，提升了复合材料整体的电子转移效率，利于UA的电化学反应检测。氧化聚合法无需复杂设备，反应条件相对温和，易于控制，有利于大规模制备。该方法可使MB、PPy和COFs在聚合过程中充分混合，形成均匀的纳米复合材料，保障材料性能的一致性与重复性。也可通过调整氧化聚合条件(如反应时间、温度、氧化剂浓度等)，灵活调控复合材料的结构与性能，以满足不同检测需求。此传感器在检测UA方面表现出优异的性能，具有10~10000 ng/mL宽的检测范围、2 ng/mL低的检测限和可接受的选择性、稳定性和重现性，为UA的检测提供了新的选择。

基金项目

滁州学院科研启动基金(2024qd33)、滁州学院大学生创新创业训练计划资助项目(2024CXXL017, 2025CXXL096)。

NOTES

^*通讯作者。