摘要: 目的：通过网络药理学来探讨黄柏治疗痤疮的作用机制。方法：利用TCMSP数据库以生物利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%、类药指数(Drug-Likeness, DL) ≥ 0.18筛选出黄柏的活性成分及相对应的靶点，通过GeneCards数据库收集痤疮相关的靶点基因，采用Cytoscape软件和STRING数据库进行“药物–活性成分–靶点”网络和蛋白互作网络的构建与分析；利用Metascape在线分析工具对交集靶点进行GO和KEGG的富集分析，并借助微生信作图网站展现分析结果。结果：黄柏靶点192个，痤疮靶点1345，交集靶点50个，其中潜在核心有效成分黄连素、黄铜碱、基哈达内酯A等化合物。GO富集分析结果显示，黄柏治疗痤疮涉及对细菌来源分子的反应、炎症反应的调节、对肽的反应，白细胞–细胞粘附的调控、白细胞分化等生物进程；富集分析的结果显示可能涉及癌症的发展途径、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、炎症性肠病等信号通路。结论：本研究展现了黄柏活性成分治疗痤疮的潜在靶点及通路，为以后研究黄柏治疗痤疮的方向提供了科学基础。
Abstract: Objective: To explore the mechanism of Huangbai in treating acne through network pharmacology. Method: The active ingredients and corresponding targets of Phellodendron amurense were screened using the TCMSP database with an oral bioavailability (OB) ≥ 30% and a drug like index (DL) ≥ 0.18. Acne related target genes were collected through the GeneCards database, and the “drug active ingredient target” network and protein interaction network were constructed and analyzed using Cytoscape software and STRING database; utilize the Metascape online analysis tool to perform GO and KEGG enrichment analysis on intersecting targets, and display the analysis results on a bioinformatics mapping website. As a result, there were 192 targets for Huangbai, 1345 targets for acne, and 50 intersecting targets, among which potential core active ingredients such as berberine, berberine, and ketorolactone A were identified. The GO enrichment analysis results showed that the treatment of acne with Huangbai involves biological processes such as response to bacterial derived molecules, regulation of inflammatory response, response to peptides, regulation of leukocyte cell adhesion, and leukocyte differentiation; the results of enrichment analysis may involve the development of cancer, the role of AGE-RAGE signaling pathway in the complications of diabetes, inflammatory bowel disease and other signaling pathways. Conclusion: This study demonstrates the potential targets and pathways of Huangbai active ingredients in treating acne, providing a scientific basis for future research on Huangbai's treatment of acne.
1. 引言
痤疮是一种毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性疾病[1]，临床表现为丘疹、瘢痕、结节、脓疱、白头、囊肿、粉刺等[2]。好发于面部，额头，胸背部。病情难以痊愈并且反复发作，对于青少年来说，不仅影响面部容貌，还容易产生自卑感[3]。黄柏最初记载于《神农本草经》，黄柏生长在河边、溪边、深山中，分布在我国东北三省、河北、内蒙古、四川、云南、贵州、湖北、湖南、广西、山东、甘肃、浙江等地区[4]，味苦，性寒，归肾、膀胱经、具有清热燥湿，解毒疗疮，泻火除蒸的作用[5]，黄柏具有抗炎、抗癌、抗菌、降尿酸、降血糖等现代药理作用[6]。
2. 材料和方法
2.1. 化学成分信息及靶点获取
通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索黄柏对其中的活性成分进行初步筛选和靶点预测，以口服利用度(OB) ≥ 30%，类药性(DL) ≥ 0.18的标准筛选主要成分。
2.2. 痤疮相关靶点的筛选及共同靶点的Venny分析
以“acne”为关键词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)检索痤疮相关靶点，运用Excel去除重复靶基因。将药物和疾病靶点上传至Venny作图平台，得到疾病与药物的共同靶点，即黄柏治疗痤疮的潜在作用靶点。
2.3. “药物–活性成分–作用靶点网络”的构建与分析
将药物活性成分及其靶点利用Cytoscape绘制的“药物–活性成分–作用靶点”网络图，并运用Network Analyze对活性成分进行拓扑分析，将度值排名居前5位的药物活性成分作为黄柏的关键成分。
2.4. 构建蛋白质相互关系网络
运用STRING平台，将韦恩图得出的黄柏与痤疮的交集靶点导入String数据库，设置蛋白种类为“Homo sapiens (人类)”，构建靶蛋白互作(PPI)网络模型。从而明确交集靶蛋白之间的联系，并依据Degree筛选出重要靶点。
2.5. 靶点的GO功能及KEGG通路富集分析
利用Metascape数据库，选择人类作为研究对象，进行GO (gene ontology)和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，获得药物在疾病中的主要作用通路，并通过微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)分别对前20个作用通路绘制柱状图和气泡图。
3. 结果
3.1. 黄柏活性成分及靶点筛选结果
在TCMSP数据库中检索黄柏的有效成分为37个(见表1)，将符合筛选条件的靶点去重后，剩下靶点有192个。
Table 1. The effective active ingredients of Huangbai
表1. 黄柏的有效活性成分
MOLID |
成分 |
OB/% |
DL |
MOL001454 |
黄连素 |
36.86 |
0.78 |
MOL001458 |
黄铜碱 |
30.67 |
0.86 |
MOL002636 |
基哈达内酯A |
34.21 |
0.82 |
MOL013352 |
奥巴库诺酮 |
43.29 |
0.77 |
MOL002641 |
Phellavin_qt |
35.86 |
0.44 |
MOL002643 |
δ-7-羟醇 |
37.42 |
0.75 |
MOL002644 |
蝶呤 |
40.19 |
0.28 |
MOL002651 |
脱氢丹参酮II A |
43.76 |
0.4 |
MOL002652 |
delta7-脱氢槐花胺 |
54.45 |
0.25 |
MOL002656 |
二氢尼罗替星 |
36.43 |
0.81 |
MOL002659 |
基哈达宁A |
31.6 |
0.7 |
MOL002660 |
尼罗替星 |
41.41 |
0.82 |
MOL002662 |
芸香碱 |
40.3 |
0.6 |
MOL002663 |
脱脂苷 |
40.14 |
0.2 |
MOL002666 |
白螨菊酯 |
34.18 |
0.78 |
MOL000449 |
豆甾醇 |
43.83 |
0.76 |
MOL002668 |
沃宁 |
45.83 |
0.87 |
MOL002670 |
卡维丁 |
35.64 |
0.81 |
MOL002671 |
烛毒素A |
31.81 |
0.69 |
MOL002672 |
赫里塞诺内H |
39 |
0.63 |
MOL002673 |
希匹酮 |
36.18 |
0.83 |
MOL000358 |
β-谷甾醇 |
36.91 |
0.75 |
MOL000622 |
Magnograndiolide (木甘大内酯) |
63.71 |
0.19 |
MOL000762 |
棕榈素A |
35.36 |
0.65 |
MOL000785 |
帕尔马汀 |
64.6 |
0.65 |
MOL000787 |
福马林 |
59.26 |
0.83 |
MOL000790 |
异葡萄树碱 |
35.77 |
0.59 |
MOL000098 |
槲皮素 |
46.43 |
0.28 |
MOL001131 |
phellamurin_qt |
56.6 |
0.39 |
MOL001455 |
(S)-卡纳丁 |
53.83 |
0.77 |
MOL001771 |
多米弗司特-5-烯-3beta-醇 |
36.91 |
0.75 |
MOL002894 |
小檗碱 |
35.74 |
0.73 |
MOL005438 |
菜油甾醇 |
37.58 |
0.71 |
MOL006392 |
二氢尼罗替星 |
36.43 |
0.82 |
MOL006401 |
美利安酮 |
40.53 |
0.78 |
MOL006413 |
Phellochin (菲罗钦) |
35.41 |
0.82 |
MOL006422 |
他利芬定 |
44.41 |
0.73 |
3.2. 痤疮疾病的筛选和“黄柏–痤疮”共同靶点Venny分析图
利用GeneCards数据库得到痤疮靶点Score中位数为0.63326，最终得到1345个Score > 0.63326的潜在靶点。将筛选的黄柏活性成分靶点与痤疮靶点取交集后绘制韦恩图(见图1)。
如图1所示：痤疮的相关靶点1345个，药物作用靶点192个、药物与痤疮共同的靶点基因50个。
Figure 1. Wayne diagram of active ingredient targets in Phellodendron amurense and acne targets
图1. 黄柏活性成分靶点与痤疮靶点的韦恩图
3.3. 药物–活性成分–作用靶点网络图的构建和分析
运用Cytoscape软件来构建药物–活性成分–作用靶点图(见图2)，图中共218个节点，525条边，按照度值排序，排在前5位的是槲皮素、β-谷甾醇、异紫堇杷明碱、四氢小檗碱、豆甾醇。
Figure 2. Drug active ingredient target network diagram
图2. 药物活性成分–靶点网络图
3.4. 蛋白质相互关系网络的构建
在STRING数据库中录入黄柏和痤疮的共有靶点并进行分析，通过Cytoscape进行分析，共有49点611条边，如图3所示。图中每个节点代表蛋白，边代表蛋白与蛋白间的互作关系，排名前五的靶点是TNF (肿瘤坏死基因)、AKT1 (蛋白激酶Ba)、IL1B (白细胞介素1)、PTGS2 (磷脂酶-A2)、TGFB1 (转化生长基因β1)。
Figure 3. Intersection target protein interaction network diagram
图3. 交集靶点蛋白互作网络图
3.5. GO富集分析及KEGG通路分析
GO富集分析结果显示，黄柏治疗痤疮涉及对细菌来源分子的反应、炎症反应的调节、对肽的反应，白细胞–细胞粘附的调控、白细胞分化等(见图4)。
KEGG通路富集分析结果显示，黄柏治疗痤疮的潜在信号通路包括癌症的发展途径、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、炎症性肠病、化学致癌–受体激活、疟疾等(见图5)。
Figure 4. GO biological process enrichment analysis chart
图4. GO生物进程富集分析图
Figure 5. KEGG enrichment analysis
图5. KEGG富集分析
4. 讨论
痤疮属于中医学“粉刺”范畴，痤疮的病因病机因肺经壅热，外感风热，不断熏蒸肌肤，食肥甘厚味，久而化热所致[7]，治疗上我们应用清热解毒，消肿祛腐的方法[2]。
本研究筛选出黄柏治疗痤疮的主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、异紫堇杷明碱、四氢小檗碱、豆甾醇等。槲皮素抑制C. acnes刺激的人角质形成细胞(Ha Ca T)、人单核细胞(THP-1)和鼠巨噬细胞系(RAW) 264.7中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的产生和m RNA的表达水平，槲皮素显著减轻C. acnes诱导的痤疮小鼠的炎症反应[8]。β-谷甾醇能平衡激素水平，可以从调节激素水平的角度治疗痤疮，痤疮发病机制与性激素水平相关，尤其是与雄激素水平升高有关，同时跟微生物痤疮丙酸杆菌感染、免疫反应、炎症反应等有一定关联[9]。β-谷甾醇还能通过抑制TNF-α释放而减弱脂多糖诱导的炎症反应[10]。
PPI网络互作得知，黄连治疗痤疮主要涉及的核心靶点有TNF (肿瘤坏死基因)、AKT1 (蛋白激酶Ba)、IL1B (白细胞介素1)、PTGS2 (磷脂酶-A2)、TGFB1 (转化生长基因β1)。肿瘤坏死基因是炎性因子，可以使局部炎症增强，激活中性粒细胞[11]。
根据GO富集分析和KEGG信号通路分析，黄柏治疗痤疮主要涉及细菌来源分子的反应、炎症反应的调节、对肽的反应，白细胞–细胞粘附的调控、白细胞分化等生物过程，参与调控的信号通路有癌症的发展途径、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、炎症性肠病、化学致癌–受体激活、疟疾等。AGE-RAGE通路与脂质代谢和细胞凋亡联系紧密，其失活可改善脂质代谢紊乱，减轻氧化应激[12]。从黄柏的成分中分离出的小檗碱有抑制人肝癌细胞HepG2增殖的作用，三萜类化合物对肿瘤细胞表现出一定的细胞毒性，表现有很好的抗肿瘤活性[13]。
综上所述，通过网络药理学阐释黄柏治疗痤疮的作用机制进行了讨论，本研究黄柏主要从激素水平以及免疫炎症水平等方面来探讨痤疮的机制。通过多靶点、多途径、多通路的作用机制[14]，为黄柏治疗痤疮提供了一些参考，也为以后的实验提供一些理论基础。
基金项目
黑龙江省中医药科研项目(项目编号8HY2020-144)。
声 明
该病例报道已获得病人的知情同意。
NOTES
*通讯作者。