1. 前言
卵巢高级别浆液性癌(High-grade serous ovarian carcinoma, HGSC)占卵巢上皮性癌的70%，是妇科恶性肿瘤死亡的首要原因，其5年生存率不足30% [1]。转移与复发是治疗失败的主要因素，而上皮–间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)作为侵袭转移的核心机制，在HGSC腹膜播散中起关键作用[2]。尽管TGF-β、Snail等通路已被证实参与EMT调控[3]，但HGSC特有的分子开关仍未明确。我们前期生物信息学分析提示，NOL7在TCGA卵巢癌数据集中的表达与患者生存显著正相关(HR = 0.62, P = 0.003) [4]，但其临床意义及机制亟待验证。
本研究首次结合临床队列分析与分子功能实验：通过120例HGSC样本明确NOL7表达特征及其与临床病理参数、预后的关联；进一步构建慢病毒过表达模型，从增殖、迁移侵袭及EMT通路多维度解析NOL7的抑癌机制，为靶向EMT的HGSC治疗提供新靶点。
2. 研究方法与材料
2.1. 研究对象
本研究回顾性纳入淮安市第五人民医院收治的、经术后病理确诊为卵巢高级别浆液性癌的患者，纳入标准要求：术前未接受任何抗肿瘤治疗；具有完整的临床病理资料(包括年龄、肿瘤长径、FIGO分期、分化程度及淋巴结转移状态)；具有有效的肿瘤组织NOL7蛋白免疫组化检测结果。排除标准为：术前接受过抗肿瘤治疗；非高级别浆液性癌病理类型(如其他卵巢上皮性癌亚型或转移性肿瘤)；关键临床病理数据或NOL7蛋白表达数据缺失者。最终符合上述标准共120例患者纳入分析，并按NOL7蛋白表达水平分为高表达组(n = 32)和低表达组(n = 88)。实验中所用的卵巢癌细胞系购自湖南丰晖生物技术有限公司，产品标号为OVCAR-3，细胞培养液配方为：RPMI 1640培养基(Gibco，货号11875093) (80%)、胎牛血清FBS (Gibco) (20%)，额外添加胰岛素至终浓度0.01 mg/ml。
2.2. 免疫组织化学分析
采用标准免疫组织化学染色法检测：石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，进行柠檬酸盐热诱导抗原修复；滴加NOL7一抗(1:50)于4℃孵育过夜，复温后以HRP标记二抗室温孵育30 min；DAB显色控制系统性控制于显微镜下终止，苏木精复染细胞核，中性树胶封片。IHC分组的截断值定义为区分NOL7高表达组与低表达组的定量阈值，其确定依据如下：要求≥30%的肿瘤细胞显示阳性信号，要求≥2+ (采用半定量评分，如：0 = 无染色，1+ = 弱阳性，2+ = 中等阳性，3+ = 强阳性)。仅当样本同时满足阳性细胞百分比 ≥ 30%且染色强度 ≥ 2+时，才被归类为高表达组(n = 32)；否则归为低表达组(n = 88)。此标准由两名病理医师通过双盲阅片验证，确保结果可重复性。
2.3. 生存分析及诊断效能分析
本研究采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线评估NOL7表达对预后的影响，以生存时间(月)为横轴、累积生存函数为纵轴，依据蛋白表达水平分为高表达组与低表达组，并通过log-rank检验比较组间差异；同时利用ROC曲线分析诊断效能，横轴为1-特异性、纵轴为敏感度，以曲线下面积(AUC)量化区分度。ROC曲线分析的目标是评估NOL7表达对肿瘤进展的诊断效能，其结局变量定义为HGSC的临床进展状态，以区分患者是否处于高进展风险状态，具体结局变量整合了以下临床病理参数：肿瘤长径 > 8 cm (反映局部侵袭性)；FIGO分期III~IV期(晚期疾病)；低分化(病理恶性度)；淋巴结转移(转移证据)。患者满足任一参数即归类为“进展状态阳性”，否则为阴性。此定义直接关联NOL7低表达与侵袭性特征。
2.4. CCK-8增值能力分析
采用CCK-8法检测细胞增殖能力：将培养细胞分为三组——空白对照组(未处理)、慢病毒空载体转染组(LV-NC)及慢病毒介导NOL7过表达组(LV-NOL7)，每组设置5复孔；分别于0 h、24 h、48 h、72 h时间点向细胞培养体系加入CCK-8试剂，37℃孵育2 h后使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度(OD450 nm)值。
2.5. 迁移及侵袭实验分析
采用划痕实验及Transwell小室法检测细胞迁移侵袭能力：将细胞分为空白对照组、慢病毒空载体转染组(LV-NC组)及慢病毒介导NOL7过表达组(LV-NOL7组)，划痕实验使用200 μL无菌枪头于单层细胞制造创面，0 h及48 h观察时间点拍照记录，以ImageJ软件计算创面愈合率(迁移率 = 1~48 h划痕面积/0h划痕面积)；Transwell实验以基质胶包被小室上室，接种细胞后37℃培养24 h，下室加入20% FBS培养基诱导侵袭，4%多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色后镜下随机选取5视野计数穿膜细胞数。
2.6. 免疫蛋白印迹
采用标准Western Blot法检测蛋白表达：细胞经裂解液提取总蛋白，BCA法测定浓度后取等量样品(30 μg)行SDS-PAGE电泳(浓缩胶80 V，分离胶120 V)；转膜至PVDF膜(恒定电流300 mA，90 min)，5%脱脂牛奶封闭2 h；依次加入一抗(E-cadherin 1:1000、Claudins 1:800、Occludin 1:1000、N-cadherin 1:1500、Vimentin 1:2000、MMP-9 1:1000、β-actin 1:5000) 4℃孵育过夜；TBST漂洗3次(10 min/次)后滴加HRP标记二抗(1:5000)室温孵育2 h；ECL化学发光显影，Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，Image Lab软件分析IOD值(目的蛋白IOD值/β-actin IOD值标准化处理)；所有实验重复3次。
2.7. 统计学方法
计量资料以均值 ± 标准差 ( ± S)表示表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较选用Bonferroni法(CCK-8实验)或LSD-t检验(划痕/Transwell实验)；计数资料以频数(%)描述，组间比较使用卡方检验(χ2检验)；生存分析采用Kaplan-Meier法并进行log-rank检验；诊断效能通过ROC曲线下面积(AUC)评估。所有统计分析均使用SPSS 26.0软件完成，检验水准α = 0.05，双侧P < 0.05判定差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. NOL7在卵巢高级别浆液性癌中的亚细胞定位及表达异质性
免疫组化检测明确显示NOL7蛋白表达定位于细胞核(图1)，在120例卵巢高级别浆液性癌组织标本中，高表达组(n = 32)与低表达组(n = 88)的染色结果呈现显著异质性：典型病例对比可见高表达样本细胞核内棕黄色颗粒密集分布(图1右)，而低表达样本仅见稀疏染色(图1左)，二者差异为后续统计学分析提供直观形态学依据。
注：左图为低表达样本(核染色稀疏)，右图为高表达样本(核内棕黄色颗粒密集分布)。
Figure 1. Immunolocalization of NOL7 expression in high-grade serous ovarian carcinoma tissues
图1. NOL7在卵巢高级别浆液性癌组织中的免疫组化表达定位
3.2. NOL7表达与临床病理特征的关联性分析
统计学分析显示，NOL7表达水平与年龄无显著关联(χ2 = 0.21, P = 0.650)，而与多种临床病理参数呈显著相关性：在肿瘤长径 ≤ 8 cm患者中NOL7高表达率为43.3% (26/60)，显著高于>8 cm组的10.0% (6/60) (χ2 = 20.89, P < 0.05)；I~II期患者高表达率为44.4% (20/45)，明显高于III~IV期患者的16.0% (12/75) (χ2 = 15.76, P < 0.05)；高中分化组高表达率达60.0% (24/40)，显著高于低分化组的10.0% (8/80) (χ2 = 32.18, P < 0.05)；无淋巴结转移患者高表达率为62.9% (22/35)，远高于转移组的11.8% (10/85) (χ2 = 26.34, P < 0.05) (表1)。上述结果提示NOL7低表达与肿瘤侵袭性特征(较大肿瘤尺寸、晚期分期、低分化及淋巴结转移)密切相关。
Table 1. Analysis of the correlation between NOL7 expression and clinicopathological parameters in high-grade serous ovarian carcinoma
表1. NOL7表达与卵巢高级别浆液性癌临床病理参数的相关性分析
临床病理参数 |
n = 120 |
NOL7表达 |
χ2 |
P |
高表达(n = 32) |
低表达(n = 88) |
年龄(岁) |
|
|
|
|
|
≤60 |
48 |
13 |
35 |
0.21 |
0.650 |
>60 |
72 |
19 |
53 |
肿瘤长径(cm) |
|
|
|
|
|
≤8 |
60 |
26 |
34 |
20.89 |
<0.05 |
>8 |
60 |
6 |
54 |
FIGO分期 |
|
|
|
|
|
I~II期 |
45 |
20 |
25 |
15.76 |
<0.05 |
III~IV期 |
75 |
12 |
63 |
分化程度 |
|
|
|
|
|
高中分化 |
40 |
24 |
16 |
32.18 |
<0.05 |
低分化 |
80 |
8 |
72 |
淋巴结转移 |
|
|
|
|
|
无 |
35 |
22 |
13 |
26.34 |
<0.05 |
有 |
85 |
10 |
75 |
3.3. NOL7表达水平对患者生存预后及诊断效能的评估
生存分析显示：低表达组累积生存率随时间显著下降，基线生存率为1.0，至10个月时降至0.80 (95%CI: 0.75~0.85)，观察期末(60个月)稳定于0.30 (95%CI: 0.25~0.35)；而高表达组始终维持在0.85~0.90区间(log-rank χ2 = 24.76, P < 0.001)，两组生存差异具有统计学意义(图2(a))。低表达组中位生存期约为18个月，反映不良预后。高表达组中位生存期未达，突显NOL7的保护作用。ROC曲线分析表明，NOL7表达的诊断效能AUC达0.86 (95%CI: 0.82~0.90)，当敏感度为82.5%时对应1-特异性为19.3%，曲线呈阶梯状上升且显著高于参考线(P < 0.001)，提示其对肿瘤进展具有良好的区分能力(图2(b))。
3.4. NOL7过表达对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用
CCK-8检测显示：0 h时三组OD450 nm值无统计学差异(对照组：0.24 ± 0.06，LV-NC组：0.23 ± 0.05，LV-NOL7组：0.25 ± 0.08，P > 0.05)；随时间延长，LV-NOL7组增殖速率显著降低，其24 h、48 h、72 h的OD值(分别为0.36 ± 0.03、0.50 ± 0.07、0.63 ± 0.08)均明显低于对照组(0.45 ± 0.02、0.67 ± 0.10、0.89 ± 0.12)及LV-NC组(0.44 ± 0.04、0.65 ± 0.09、0.87 ± 0.11) (P < 0.05)，而对照组与LV-NC组在各时间点均无显著差异(P > 0.05)；折线图显示LV-NOL7组72 h时增殖抑制率达29.2% (较对照组) (图3)，证实NOL7过表达显著抑制细胞增殖活性。
(a) (b)
Figure 2. Impact of NOL7 expression on patient survival prognosis and diagnostic efficacy. (a): Kaplan-Meier survival curve (log-rank χ² = 24.76, P < 0.001); (b): ROC curve (AUC = 0.86, 95%CI: 0.82~0.90
图2. NOL7表达对患者生存预后及诊断效能的影响。(a)：Kaplan-Meier生存曲线(log-rank χ2 = 24.76, P < 0.001)；(b)：ROC曲线(AUC = 0.86, 95%CI: 0.82~0.90)
Figure 3. Inhibitory effect of NOL7 overexpression on cell proliferation (CCK-8 assay)
图3. NOL7过表达对细胞增殖的抑制效应(CCK-8法)
3.5. NOL7过表达对细胞迁移侵袭能力的调控效应
细胞功能实验显示：划痕实验中，48 h时LV-NOL7组细胞迁移率显著降低至(21.54 ± 3.49)%，远低于对照组(56.82 ± 5.38)%及LV-NC组(54.71 ± 6.79)% (F = 58.33，组间P < 0.05，两两比较均P < 0.001)；Transwell实验中，LV-NOL7组穿膜细胞数为(86.54 ± 23.51)个，较对照组(349.50 ± 48.63)个及LV-NC组(372.43 ± 52.27)个减少75.2% (F = 92.47，组间P < 0.05，两两比较均P < 0.001)；对照组与LV-NC组细胞均呈现密集迁移侵袭表现，而LV-NOL7组创面愈合延迟、穿膜细胞稀疏(图4)，直观证实NOL7过表达可显著抑制肿瘤细胞的迁移侵袭能力。
Figure 4. Inhibitory effects of NOL7 overexpression on cell migration and invasion capabilities. (a): Scratch wound healing assay (48 h migration rate: 21.54% ± 3.49% vs 56.82% ± 5.38%); (b): Transwell invasion assay (number of invading cells: 86.54 ± 23.51 vs 349.50 ± 48.63)
图4. NOL7过表达对细胞迁移侵袭能力的抑制作用。(a)：划痕实验(48 h迁移率：21.54% ± 3.49% vs 56.82% ± 5.38%)；(b)：Transwell侵袭实验(穿膜细胞数：86.54 ± 23.51 vs 349.50 ± 48.63)
3.6. NOL7通过EMT相关分子抑制肿瘤转移
Western Blot检测显示：条带定性分析中，LV-NOL7组上皮标志物E-cadherin (97 kDa)、Claudins (27 kDa)及Occludin (65 kDa)条带显色加深，而间充质标志物N-cadherin (130 kDa)、Vimentin (57 kDa)和侵袭相关蛋白MMP-9 (92 kDa)条带显著变浅，β-actin (43 kDa)内参条带均匀(图5(a))；定量分析证实：与对照组及LV-NC组相比，LV-NOL7组E-cadherin (0.82 ± 0.07 vs 0.47 ± 0.05/0.50 ± 0.06)、Claudins (0.75 ± 0.08 vs 0.43 ± 0.04/0.46 ± 0.07)、Occludin (0.68 ± 0.06 vs 0.38 ± 0.05/0.39 ± 0.04)表达显著上调(均P < 0.05)，而N-cadherin (0.31 ± 0.05 vs 0.85 ± 0.09/0.83 ± 0.08)、Vimentin (0.28 ± 0.03 vs 0.78 ± 0.07/0.77 ± 0.09)、MMP-9 (0.24 ± 0.04 vs 0.82 ± 0.10/0.80 ± 0.11)表达显著下调(均P < 0.05) (图5(b))；蛋白表达模式变化提示NOL7过表达可能通过逆转EMT进程抑制肿瘤转移。
4. 讨论
NOL7 (又称PQBP3)作为多功能核仁蛋白，其生物学功能呈现显著的组织环境依赖性和分子机制复杂性。NOL7在癌症中扮演双重角色：在宫颈癌、肝癌和卵巢癌中作为抑癌基因发挥作用，通过调控血管生成(TSP-1上调)、EMT进程(E-cadherin/Vimentin调控)和核膜稳定性抑制肿瘤进展[5]-[9]；然而在黑色素瘤中却表现为促癌因子[10]，促进转移并导致不良预后。这种矛盾功能可能与组织特异性互作网络相关——例如在宫颈癌中，NOL7受RB肿瘤抑制因子直接转录激活[11]，而在黑色素瘤中可能与特定癌基因协同驱动恶性表型。作为核糖体生物合成关键因子，NOL7通过维持核仁结构完整性调控细胞增殖[12] [13]。其C末端核仁定位信号(NoLS)介导的高亲和力结合是其发挥抑癌作用的结构基础，而核仁结构破坏会导致NOL7核质泄露并丧失功能[14]。
(a) (b)
Figure 5. Regulation of EMT-related protein expression by NOL7 overexpression. (a): Western Blot band images (molecular weight markers indicated); (b): Histogram of relative protein expression levels (P < 0.05 vs controls and LV-NC group)
图5. NOL7过表达调控EMT相关蛋白的表达。(a)：Western Blot条带图(分子量标注)；(b)：蛋白相对表达量柱状图(P < 0.05 vs 对照组及LV-NC组)
本研究结果显示，HGSC中NOL7阳性表达率低于癌旁正常组织组，说明NOL7呈现表达水平低的表象，可能参与了HGSC的发生发展过程。统计分析NOL7与患者临床特征的关系研究结果显示，NOL7低表达与较大肿瘤尺寸、晚期分期、低分化及淋巴结转移和预后生存期短密切相关。本研究结果表明低表达的NOL7在多项肿瘤发挥抑癌基因作用的研究结果相似[5]-[9]。NOL7在HGSC中发挥抑癌基因的作用，本文在体外实验中也得到了证实，即过表达NOL7后卵巢癌细胞的增殖活力和侵袭迁移能力明显下降。另外，通过统计发现NOL7阴性患者的生存期高于NOL7阳性患者；进一步说明NOL7阳性也是HGSC患者生存预后的影响因素之一，可能今后会作为HGSC患者预后评估的生物分子。
上皮间质转化(EMT)激活是癌细胞转移的关键过程，在此过程中，上皮细胞获得间充质细胞的特征，细胞运动性和迁移能力增强。EMT的特征在于上皮细胞标志物(例如cytokeratins和E-cadherin)缺失，间充质细胞标志物(例如N-cadherin、vimentin和纤连蛋白)的表达上调。最终导致上皮细胞失去顶基细胞极性，重组细胞骨架，并重编基因表达；促进侵袭性表型在癌症转移中的发展[15]-[18]。本研究在探索NOL7的作用机制上表明过表达NOL7后E-cadherin、Claudins、Occludin表达显著上调，而N-cadherin、Vimentin、MMP-9表达显著下调；这一类EMT相关蛋白的表达提示NOL7过表达可能通过逆转EMT进程抑制肿瘤转移。
综上所述，在HGSC中NOL7阳性表达率低于癌旁组织，NOL7低表达与较大肿瘤尺寸、晚期分期、低分化及淋巴结转移和预后生存期短密切相关。NOL7过表达可能通过逆转EMT进程抑制肿瘤侵袭转移。本研究认为NOL7可作为HGSC转移和评估患者预后的生物标记物。
NOTES
*通讯作者。