GNAS基因在胃癌中的表达及临床意义

Expression and Clinical Significance of the GNAS Gene in Gastric Cancer

摘要: 目的：利用生物信息学方法探讨GNAS (guanine nucleotide alpha-stimulating binding protein，鸟嘌呤核苷酸刺激结合蛋白)在胃癌组织中的表达、预后以及免疫细胞浸润的关系。方法：使用多个数据库分析GNAS基因在泛癌及胃癌中mRNA和蛋白的表达。利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)预测GNAS在胃癌中的诊断价值。通过TCGA数据和GEO数据分析GNAS表达在泛癌和胃癌中的总体生存期(overall survival, OS)。采用多种免疫浸润分析算法探讨GNAS在胃癌中与免疫浸润细胞的相关性。采用基因本体(GO)富集和京都基因与基因组数据库(KEGG)信号通路分析评估GNAS差异表达基因的功能富集分析。结果：与正常组织相比，GNAS在胃癌等多种恶性肿瘤中呈现出显著的高表达(P < 0.05)。在胃癌中GNAS的表达水平与肿瘤的T分期、TNM分期密切相关，且GNAS在晚期胃癌(III和IV期)中异常高表达(P < 0.05)。预后分析结果证实胃癌中GNAS高表达与较差预后相关。GO/KEGG功能富集分析提示GNAS与神经活性配体–受体相互作用、补体和凝血级联反应和脂肪消化吸收等通路相关。TIMER数据库分析显示GNAS的表达与中性粒细胞浸润呈负相关(P < 0.05)。结论：GNAS在胃癌中高表达，并具有较差的预后，且与中性粒细胞浸润呈负相关性，GNAS有可能成为胃癌患者诊断、预后和治疗的潜在分子靶点。

Abstract: Objective: To investigate the expression of GNAS (guanine nucleotide alpha-stimulating binding protein) in gastric cancer tissues, its prognostic value and correlation with immune cell infiltration through bioinformatics analysis. Methods: Multiple databases were utilized to analyze the mRNA and protein expression of the GNAS gene in pan-cancer and gastric cancer. The diagnostic value of GNAS in gastric cancer was predicted using receiver operating characteristic (ROC) curve analysis. Overall survival (OS) associated with GNAS expression was analyzed in pan-cancer and gastric cancer using data from TCGA and GEO datasets. Various immune infiltration analysis algorithms were employed to explore the correlation between GNAS and immune infiltrating cells in gastric cancer. Functional enrichment analysis of differentially expressed genes related to GNAS was conducted using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses. Results: Compared with normal tissues, GNAS was significantly overexpressed in multiple tumors, including gastric cancer (P < 0.05). In gastric cancer, GNAS expression was closely associated with tumor T stage and TNM stage, with significant overexpression observed in advanced gastric cancer (stages III and IV) (P < 0.05). Survival analysis indicated that elevated GNAS expression in gastric cancer is linked to an unfavorable prognosis. GO/KEGG functional enrichment analysis suggested that GNAS was related to pathways such as neuroactive ligand-receptor interaction, complement and coagulation cascades, and fat digestion and absorption. Analysis using the TIMER database revealed a negative correlation between GNAS expression and neutrophil infiltration (P < 0.05). Conclusion: GNAS exhibits robust upregulation in gastric cancer, correlating with adverse prognostic outcomes and an inverse relationship with neutrophilic infiltration. GNAS may serve as a potential molecular target for the diagnosis, prognosis, and treatment of gastric cancer patients.

1. 引言

胃癌(GC)是全球第五大常见癌症和第四大癌症相关死亡原因 。胃癌的分布存在明显地域性，高发于日本、中国、智利等国家。尽管近年来胃癌患者的发病率和病死率呈下降趋势 ，但在我国，胃癌的发病率及死亡率在所有恶性肿瘤中均排名第三，已成为严重威胁公共健康的主要因素之一 。因此，发掘胃癌差异表达基因辅助高危人群早期癌症筛查，寻找胃癌早诊的生物标志物及治疗靶点是近年研究的热点。GNAS基因是位于人类20号染色体，编码Gs蛋白的α亚基(Gαs)，负责调控腺苷酸环化酶(cAMP)的产生，从而激活cAMP信号通路-，它使用多个启动子产生多种基因产物，包括G蛋白α亚基(G(s) alpha)，将7个跨膜受体与cAMP产生酶腺苷酸环化酶结合起来GNAS突变会导致cAMP水平升高，促进细胞增殖和存活-。关于GNAS已有多项研究表明GNAS在多种癌症中异常表达-，并促进其发生发展。但GNAS在胃癌中的预后作用和肿瘤免疫细胞浸润的相关性以及在免疫治疗中的影响尚不清楚，此外，GNAS能否成为免疫治疗的新靶点尚需进一步研究验证。因此，基于肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)、基因表达综合数据库(GEO)等公共数据库，本研究系统分析了GNAS在胃癌中的表达特征、预后价值及其与肿瘤免疫浸润的关系，现报告如下。

2. 材料与方法

2.1. GNAS基因表达分析

通过TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)数据库来分析GNAS在泛癌及其癌旁组织中的差异表达，TIMER包含多种癌症类型，采用箱形图可视化GNAS表达水平。利用GTEx数据库 (http://commonfund.nih.gov/GTEx/)补充组织样本数据。采用R包(pROC、survival)建立诊断ROC曲线。通过HPA (The Human Protein Atias)数据库数据库(https://www.proteinatlas.org)验证靶基因的表达特征。

2.2. 预后价值分析及GNAS表达与病理特征的关系

为了研究GNAS表达与GC之间的潜在关联，采用TCGA数据库和GEO数据库来研究GNAS对GC预后的影响，该分析涵盖了GNAS表达在泛癌中的总体生存期(overall survival, OS)和GNAS表达在胃癌的总体生存期(overall survival, OS)。利用TCGA数据库的数据和临床资料，通过“limma”和“survival”包研究临床病理特征与GNAS表达的相关性。通过对GNAS高表达组和低表达组的对比分析，评估患者的临床病理特征(如TMN分期和肿瘤分级)。

2.3. 差异表达基因的鉴定和功能富集分析

采用R语言edgeR包分析胃癌与癌旁组织mRNA表达差异，筛选标准为|log2FC| > 2且Padj < 0.05的差异表达基因。通过pheatmap和ggplot2包绘制火山图实现差异可视化。进一步利用ClusterProfiler包进行GO功能分析(包含生物学过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC) 3类)及KEGG通路富集，结果采用ggplot2包可视化。

2.4. GNAS的表达与免疫细胞浸润的关系分析

TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析评估GNAS表达与免疫细胞浸润的相关性。通过CIBERSORT算法、QUANTISEQ算法、XCELL算法评估GNAS表达与中性粒细胞的相关性。采用ESTIMATE算法评估肿瘤微环境特征，分析GNAS高低表达组间基质评分和免疫评分的差异。

2.5. 统计学方法

使用Wilcoxon检验分析GNAS的泛癌表达特征。通过ROC曲线评估GNAS的诊断效能。运用Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon检验及logistic回归分析GNAS表达与临床病理参数的相关性。采用Spearman相关分析评估GNAS与免疫细胞浸润及检查点基因的关系，Pearson相关分析检测GNAS与微环境评分(基质、免疫及ESTIMATE评分)的关联(P < 0.05为显著性阈值)。

3. 结果

3.1. GNAS在胃癌中的表达水平

利用TIMER数据库分析GNAS在泛癌中的表达，结果显示与正常组织相比，GNAS mRNA在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、直肠腺癌、肾嫌色细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌、胃腺癌、子宫内膜癌中的表达水平上调(P < 0.05)。而GNAS在甲状腺癌中表达下调(P < 0.05)，如图1(a)。此外，进一步分析GNAS mRNA在TCGA和GTEx数据库中的表达水平，结果均证实了GC中GANS表达升高，如图1(b)，图1(c)。GNAS的ROC曲线分析显示AUC值为0.842，提示其具有较好的胃癌诊断效能，如图1(d)。在HPA数据库中发现胃癌组织GNAS蛋白水平高于正常胃粘膜组织，如图1(e)。

注：(a)：TIMER数据库分析GNAS在泛癌中的表达水平；(b)：TCGA数据库分析GNAS在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异；(c)：TCGA联合GTEx数据库分析GNAS在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异；(d)：ROC曲线分析GNAS的诊断价值 E HPA数据库中GNAS蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达。免疫组织化学(40X) (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001)。

Figure 1. The expression level of GNAS in gastric cancer

图1. GNAS在胃癌中的表达水平

3.2. GNAS表达对胃癌患者预后的价值

使用TCGA数据库分析GNAS对泛癌总生存率(Overall Survival, OS)的影响，结果显示间皮瘤(MESO)、肉瘤(SARC)、葡萄膜黑色素瘤(UVM)、胃癌(STAD)中GNAS高表达的患者具有较差的预后(P < 0.05)，如图2(a)。采用中位值将TCGA-STAD队列分为GNAS高/低表达组，生存分析显示，高表达组患者OS显著缩短(HR = 1.44, P = 0.032)，如图2(b)。在GSE62254验证队列中获得一致结果(HR = 0.58, P = 0.003)，如图2(c)，证实GNAS高表达与不良预后相关。

3.3. GNAS表达与临床病理特征的相关性

本研究进一步探究了TCGA-STAD数据集中GNAS表达水平与胃癌临床病理特征间的相关性。如表1所示，GNAS与T分期、TNM分期相关，差异具有统计学意义(P < 0.05)，而与年龄、性别、N分期、M分期无关(P > 0.05)。进一步分组比较发现GNAS表达水平在T分期的T3 & T4期和TNM分期的III、IV期异常高表达(P < 0.05)，如图3(a)，图3(b)。这些结果表明GNAS可能与胃癌的恶性程度相关。

注：(a)：GNAS在泛癌中的预后价值；(b)：TCGA数据库分析GNAS表达对胃癌患者预后的影响；(c)：GSE62254数据集中GNAS 表达对胃癌患者生存率的影响。

Figure 2. The prognostic value of GNAS expression in gastric cancer patients

图2. GNAS表达对胃癌患者预后的价值

注：(a)：TCGA-STAD数据库中GNA在胃癌患者不同T分期中的表达；(b)：TCGA-STAD数据库中GNA在胃癌患者不同TNM分期中的表达(*P < 0.05)。

Figure 3. The correlation between GNAS expression and clinicopathological features

图3. GNAS表达与临床病理特征的相关性

Table 1. The relationship between GNAS expression in gastric cancer tissues and clinicopathological characteristics

表1. GNAS在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系

特征	GNAS低表达	GNAS高表达	P值
例	187	188
年龄，例(%)			0.264
<=65	76 (20.49%)	88 (23.72%)
>65	108 (29.11%)	99 (26.68%)
性别，例(%)			0.639
女性	69 (18.40%)	65 (17.33%)
男性	118 (31.47%)	123 (32.80%)
病理T分期，例(%)			0.009
T1 & T2	61 (16.62%)	38 (10.35%)
T3 & T4	124 (33.79%)	144 (39.24%)
病理N分期，例(%)			0.216
N0	62 (17.37%)	49 (13.73%)
N1 & N2 & N3	120 (33.61%)	126 (35.29%)
病理M分期，例(%)			0.824
M0	166 (46.76%)	164 (46.20%)
M1	12 (3.38%)	13 (3.66%)
病理分期，例(%)			0.023
I期 & II期	94 (26.70%)	70 (19.89%)
III期 & IV期	85 (24.15%)	103 (29.26%)

3.4. GO和KEGG富集分析

首先利用R软件中的Limma包分析GNAS低表达组和高表达组之间的差异表达基因(DEG)。按照|log2FC| > 2和Padj < 0.05标准，共鉴定出827个DEG，其个500上调，327个下调，其中上调和下调的Top10基因用火山图展示，如图4(a)。对这些差异基因进行GO富集分析发现：在生物过程(biological process, BP)方面，主要富集在角化作用、角质形成细胞分化等方面；在细胞组成(cellularcomponent, CC)方面，主要与角膜包膜、内质网管腔、血液微粒、乳糜微滴等的组成有关；在分子功能(molecu larfunction, MF)方面，主要富集在激素活性、内肽酶抑制剂活性等方面，见图4(b)。根据KEGG富集分析，差异表达基因在神经活性配体–受体相互作用、补体和凝血级联反应和脂肪消化吸收中发挥重要作用，见图4(c)。这些结果表明，GNAS可能通过潜在的机制途径促进肿瘤进展。

3.5. GNAS与胃癌组织中免疫浸润的相关性

肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)包含多种细胞类型，如CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞、巨噬细胞等，发挥着不同的作用。为了更好地了解GNAS表达水平与TIIC丰度之间的相关性。我们利用TIMER数据库分析胃癌中GNAS与6种免疫浸润细胞的相关性，结果显示GNAS的表达与中性粒细胞的免疫浸润水平呈负相关(r = −0.128, P = 0.0135)，见图5(a)。这与CIBERSORT算法、QUANTISEQ算法、XCELL算法的研究结果一致，见图5(b)~(d)。此外，通过ESTIMATE算法计算胃癌中每例患者的基质评分

注：(a)：火山图展示GNAS高低表达组不同差异基因；(b)：差异表达基因的GO富集分析；(c)：差异表达基因的KEGG富集分析。

Figure 4. GO and KEGG enrichment analysis

图4. GO和KEGG富集分析

注：(a)：TIMER数据库中GNAS的表达与6个免疫细胞浸润的相关性；(b)~(d)：GNAS的表达与中心粒细胞浸润水平的相关性(b) CIBERSORT算法计算；(c) QUANTISEQ算法计算；(d) XCELL算法计算；(e) GNAS的表达与间质评分、免疫评分和ESTIMATE评分的相关性；(f) 胃癌中GNAS高低表达组在基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分中的表达差异。

Figure 5. The correlation between GNAS and immune infiltration in gastric cancer tissues

图5. GNAS与胃癌组织中免疫浸润的相关性

(StromalScore)、免疫评分(ImmuneScore)、ESTIMATE评分(ESTIMATEScore)，相关性分析发现GNAS的表达与免疫分数和评估分数均呈负相关(免疫分数：r = −0.185，P < 0.001；ESTIMATE评分：r = −0.134，P < 0.01)，见图5(e)。分组分析发现GNAS高表达组的免疫、ESTIMATE评分均低于GNAS低表达组P < 0.05，见图5(f)。以上结果表明GNAS高表达的胃癌患者具有较差的免疫微环境。

4. 讨论

胃癌发病率高且进展速度快，大多数胃癌患者在诊断时肿瘤已经转移，只有不到30%的胃癌在早期被诊断出来[20] [21]。对于进展期胃癌出现远处转移时，会进行化疗、靶向药物治疗或免疫疗法等全身性治疗手段，然而，由于肿瘤的异质性，患者的长期预后仍然不够理想[22] [23]，这些患者中位总生存期小于1年。近年来，随着转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术的发展，发现胃癌发生过程中关键致癌基因，从而引发了新的胃癌标志物的鉴定[25]-[27]。

GNAS是一种复杂的印迹基因，可以影响细胞的迁移、粘附等过程，从而参与肿瘤的发生发展。有研究表明，GNAS在多种癌症中过度表达，同时其较高的表达预示着较差的总生存期。Nummela等研究提出，大约5%的结直肠癌(CRC)中GNAS基因存在功能获得性突变，导致cAMP依赖性信号通路激活，并且产生不良预后。Patra 等报道，突变的GNAS通过蛋白激酶A (PKA)介导的盐诱导激酶(Sik1-3)的抑制在胰腺癌的发生发展中起到重要作用。Lu 等发现，卵巢性索间质肿瘤的幼年型粒层细胞瘤(JGCT)中有30%检查出GNAS激活改变。Yang等发现，GNAS 基因外显子中检出杂合错义突变，导致第239位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸，进而引起假性甲状旁腺功能减退症Ia型。GNAS已被证明在多种肿瘤和癌症中发挥作用，如包括导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)、垂体、甲状腺、阑尾、结直肠癌等。然而GNAS对胃癌的影响和作用机制尚不清楚。

本研究通过整合多数据库证据发现，GNAS在胃癌(GC)等多种癌症中均存在显著表达；在GC组织样本中进一步验证了GNAS的表达显著上调，且其高表达促进肿瘤浸润深度和TNM分期。TCGA数据库生存分析表明，GNAS高表达的GC患者总生存期短、生存质量差。Ding 等发现，与正常组织相比，肝细胞癌中GNAS的表达相对较高，促进肝细胞癌的进展，并且高表达的GNAS与生存率差有关。机制研究揭示，GNAS可能通过调控神经活性配体–受体相互作用及补体/凝血级联反应等分子通路促进胃癌进展。这些结果不仅提示GNAS可能具有促肿瘤作用，也表明其表达水平与胃癌预后密切相关，并且经ROC曲线验证，GNAS作为胃癌的标志物具有良好的敏感性和特异性，因此该基因有望成为胃癌诊断的新型生物标志物。

肿瘤免疫微环境(TIME)在肿瘤发展中起着关键作用。肿瘤微环境由多种细胞组成，包括基质细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及各类免疫细胞(如淋巴细胞和肿瘤相关巨噬细胞TAM) 。为探究GNAS与胃癌免疫浸润之间的联系，本研究通过TIMER数据库分析发现，GNAS的表达与胃癌中性粒细胞浸润呈显著负相关。研究表明，免疫细胞和基质细胞作为肿瘤微环境中的关键非肿瘤成分，可能对肿瘤患者的诊断和预后评估具有重要价值。基于ESTIMATE算法，免疫评分和间质评分能够有效区分肿瘤组织中的免疫成分和间质成分，从而实现对肿瘤微环境的量化分析。该算法通过识别基质细胞和免疫细胞的特异基因表达特征，可准确评估非肿瘤细胞的浸润程度。本研究发现，GNAS过表达与免疫评分及ESTIMATE评分呈负相关，提示GNAS高表达组的免疫细胞浸润水平较低。这一发现可能解释了GNAS高表达胃癌患者预后较差的原因。

本研究存在一定局限：一是基于数据库来源的数据分析可能受统计方法差异影响，导致结果存在异质性；二是GNAS高表达在胃癌发生、进展及免疫调控中的作用机制尚需更多实验验证，需进一步开展体内外实验加以证实；三是研究发现GNAS表达与免疫细胞浸润相关，但其内在机制仍需通过实验验证进行深入阐明。

综上所述，GNAS在胃癌中表达明显升高，并且高水平的GNAS与癌症发展和不良预后结果有关。研究提示GNAS具有作为胃癌诊断预后标志物及潜在治疗靶点的价值。

NOTES

^*通讯作者。