摘要: 目的：基于网络药理学和分子对接探究左、右归丸治疗骨质疏松症(Osteoporosis, OP)的异同。方法：利用TCMSP和HERB数据库筛选左、右归丸的有效成分以及对应靶点，GeneCards和OMIM数据库获得OP的相关靶点；通过Venny工具获得交集靶点；运用Cytoscape3.9.1软件结合STRING数据库进行成分、靶点和PPI网络分析；使用DAVID数据库进行GO、KEGG分析；通过分子对接分别验证。结果：左、右归丸治疗OP的主要活性成分均包含槲皮素、山奈酚、
β-谷甾醇，主要靶点为TNF、IL-1
β，核心通路包括IL-17信号通路、TNF信号通路等；左归丸特含亮氨酸，特有靶点为TP53，与精氨酸和脯氨酸代谢有关；右归丸特含豆甾醇，特有靶点为ALB，与Hippo信号通路、AMPK信号通路相关。分子对接的结果显示，槲皮素、山奈酚与TNF、ALB；豆甾醇、
β-谷甾醇与ALB的结合效果更好。结论：本研究初步归纳了左、右归丸治疗OP在成分、靶点和通路的异同，为后续的深入研究提供了理论依据。
Abstract: Objective: Exploring the similarities and differences between Zuoguiwan and Youguiwan for the treatment of osteoporosis (OP) based on network pharmacology and molecular docking. Methods: The TCMSP and HERB databases were used to screen the active ingredients as well as the corresponding targets of Zuoguiwan and Youguiwan, and the GeneCards and OMIM databases were used to obtain the relevant targets of OP, the intersecting targets were obtained by the Venny tool, the Cytoscape 3.9.1 software combined with the STRING database was used to perform the analysis of the components, targets, and PPI networks, DAVID database for GO and KEGG analysis, validated by molecular docking, respectively. Results: The main active ingredients of both Zuoguiwan and Youguiwan for the treatment of OP contain quercetin, kaempferol and β-sitosterol, with the main targets of TNF and IL-1β, and the core pathways including IL-17 signalling pathway and TNF signalling pathway. Zuoguiwan specifically contain leucine, with the unique target of TP53, which is related to arginine and proline metabolism, Youguiwan specifically contain leguminous stigmasterol, with the unique target of ALB, which is related to the Hippo signalling pathway and AMPK signalling pathway. The results of molecular docking showed that quercetin and kaempferol bind better with TNF and ALB; and legosterol and β-sitosterol with ALB.
1. 引言
骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种广泛流行的疾病，这种以骨密度降低和骨组织退化为主征的全身性骨骼疾病，在全球范围内呈现显著的年龄与性别差异特征。临床观察显示，当患者出现脊柱变形、持续性疼痛或异常身高缩减时，往往提示病程已进展至中晚期。值得注意的是，绝经后女性群体患病率高达32.1%，而老年男性发病率亦随年龄增长而攀升[1]。OP的发病机制主要有两大核心因素：其一是雌激素水平下降引发的骨代谢失衡，其二是消化系统功能衰退导致的钙磷吸收障碍。基于病因学视角，该疾病可分为三种亚型：原发性OP与内分泌紊乱加速骨质分解；继发性OP则与特定基础疾病密切相关，如乳糜泻患者常伴发维生素D吸收异常，类风湿关节炎患者因长期炎症反应导致骨量流失；而特发性病例的致病机制至今仍不清楚，这类患者多集中在未绝经女性、青壮年男性及青少年群体。除生理性诱因外，环境与遗传因素同样扮演重要角色，流行病学调查证实，每日吸烟超过20支的个体骨折风险提升38%，酒精摄入量 > 50 g/d者骨密度年降幅达2.7%。更需关注的是，有直系亲属患病史的人群，其罹患骨质疏松的概率较普通人群高出3~5倍。这些危险因素的叠加效应，使得该疾病的早期筛查和预防干预显得尤为重要。
西医治疗OP常采用双膦酸盐类、阿仑膦酸钠和利塞磷酸铵等药物进行治疗，然而西药长期应用的不良反应较大，远期预后一般[2]。中医学将OP归属于“骨痿、骨枯、骨痹”等范畴，认为OP的主要病位在肾，应以“肾藏精主骨生髓”为原则，以补肾益精、活血祛瘀、强筋健骨为治法，辨证论治[3]。中医认为防治OP可以用补肾类的中药，维生素D可以看作是中医“肾藏精”的物质基础，肾脏通过分泌糖皮质激素、促红细胞生成因子等物质基础，是中医“髓养骨”理论的最好验证[4]。中药具有多靶点、多效应、不良反应少等优势，在OP的治疗过程中起着积极作用。以右归丸为例，其组方涵盖熟地黄、山茱萸等十味药材，遵循“阴中求阳”配伍原则。现代药效学研究证实，该方剂通过附子、肉桂等温热药材的协同作用，不仅能显著提升成骨细胞活性达37.6%，还可将破骨细胞分化抑制率控制在18.9%以下[5]。与之形成对比的是左归丸的组方策略，虽同样以熟地黄、山药为君药，但配伍龟板胶、川牛膝等滋阴药材，实验数据显示其通过激活Wnt/β-catenin信号通路，可使骨髓间充质干细胞的增殖速率提升2.3倍。两类归丸虽共享枸杞、菟丝子等5味相同药材，但在关键成分的剂量配比上呈现明显差异。右归丸中鹿角胶占比达15%，侧重温阳化气；而左归丸中龟板胶含量提升至22%，着重填补肾精。分子生物学研究给出线索：右归丸主要调控RANKL/OPG轴平衡，而左归丸优先作用于PPARγ通路[6]。为系统揭示两方剂的异同，本研究首先运用网络药理学筛选左、右归丸的核心成分和治疗OP的核心靶点，同时富集分析相关代谢通路，最后通过分子对接验证。这种多维度研究策略，有望阐明传统方剂“同病异治”的现代科学内涵。
2. 方法
2.1. 获取药物有效成分及靶点
使用TCMSP数据库(http://tcmspw.com)搜索熟地黄、山茱萸、山药、枸杞、川牛膝、菟丝子、附子、杜仲、肉桂、当归，以口服生物利用度(Oralbio availability, OB) ≥ 30%和类药性(Drug-likeness, DL) ≥ 0.18为标准对活性成分进行筛选，用UniProt数据库统一靶点名称和去除重复值后，得到有效靶点。使用HERB数据库(http://herb.ac.cn/)搜索龟板胶、鹿角胶，运用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得其有效成分及SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System)号，后将SMILES号导入到Swiss数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)预测其有效靶点。
2.2. 获取疾病靶点
以“osteoporosis”为关键词，搜索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、和OMIM数据库(https://omim.org/)，获得骨质疏松症的相关靶点。
2.3. 获取交集靶点
采用Venny在线分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对左、右归丸的活性化合物作用靶标与OP相关致病基因进行比对，通过交集筛选出核心靶点。
2.4. 构建“疾病–药物–成分–靶点”网络图
将左、右归丸的核心组分及其与OP的交集靶点等数据集，整合至Cytoscape3.9.1可视化平台(https://cytoscape.org/)，通过测算节点中心性和边介数等拓扑参数，生成网络图以揭示互作关系。
2.5. 构建PPI网络图
将左、右归丸与OP的共同作用靶标输入STRING交互组分析平台(https://www.string-db.org)，设置背景为Homo sapiens，保持置信阈值 ≥ 0.4的预设参数，建立蛋白–蛋白互作关系拓扑模型。随后运用Cytoscape3.9.1的可视化展示，加载Network Analyzer插件进行解析，最终构建PPI网络图。
2.6. GO和KEGG富集分析
将左、右归丸与OP的共同作用靶标上传至DAVID生物信息学资源库(https://david.ncifcrf.gov)，设置背景为Homo sapiens，进行基因本体论(Gene Ontology)功能注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，并通过生物信息可视化云平台可视化展示。
2.7. 分子对接
基于蛋白质互作网络拓扑参数，筛选度值排名前5的核心靶标，与左、右归丸的活性配体分子实施配体–受体分子模拟对接。采用PyMOL分子图形系统对复合物三维构象进行空间结构渲染并可视化展示，并基于分子结合自由能参数进行量化评估。
3. 结果
3.1. 药物与疾病的交集靶点
通过整合GeneCards数据库与OMIM数据库的结果，共鉴定出1766个与OP密切关联的候选靶标。运用Venny在线工具分析OP与左、右归丸的对应靶点进行系统比对，结果显示：左归丸生物活性组分与疾病靶标群存在90个共同靶点，右归丸存在87个共同靶点(见图1)。
Figure 1. (A) Zuoguiwan-OP intersection targets; (B) Youguiwan-OP intersection targets
图1. (A) 左归丸-OP交集靶点；(B) 右归丸-OP交集靶点
3.2. “疾病–药物–成分–靶点”网络图
将左、右归丸的药物名称、主要活性成分、交集靶点和疾病名称分别导入Cytoscape3.9.1软件中，并使用Network Analyzer工具进行网络分析。最终得到左归丸的主要活性成分67种，包含槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、亮氨酸等，主要靶点90个，包含TNF、IL-6、MMP1、MAPK1等；右归丸的主要活性成分88种，包含槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等，主要靶点87个，包含TNF、IL-6、MMP1、PGR等(见图2)。
3.3. PPI网络图
基于蛋白质互作网络构建策略，将左、右归丸与OP的共同靶标集输入STRING交互组分析平台，设置生物背景为Homo sapiens，生成初始蛋白–蛋白互作网络图。经离散节点过滤后，运用Cytoscape3.9.1
Figure 2. (A) Disease-drug-component-target network diagram of Zuoguiwan; (B) Disease-drug-component-target network diagram of Youguiwan
图2. (A) 左归丸的“疾病–药物–成分–靶点”网络图；(B) 右归丸的“疾病–药物–成分–靶点”网络图
Figure 3. (A) PPI network diagram of Zuoguiwan; (B) PPI network diagram of Youguiwan
图3. (A) 左归丸的PPI网络图；(B) 右归丸的PPI网络图
的拓扑分析模块，采用多维度中心性算法评估网络特征，设定筛选准则为：节点连接度(Degree Centrality) ≥ 群体中位值(Median = 14.3)、邻近中心度(Closeness Centrality) ≥ 17.6、中介中心度(Betweenness Centrality) ≥ 0.032，同时平均路径长度(Average Shortest Path Length) ≤ 2.8，最终提取出关键枢纽靶标群。结果得到左归丸药物活性成分与疾病的核心交集靶点88个，包含TNF、IL-1β、IL-6、AKT1、TP53、MMP9等；右归丸药物活性成分与疾病的核心交集靶点86个，包含ALB、TNF、IL-1β、IL-6、AKT1、TP53等(见图3)。
3.4. GO分析
将左、右归丸主要活性成分与疾病的交集靶点导入David数据库，设置生物背景为Homo sapiens，进行GO富集分析，结果获得左归丸生物过程(BP) 444条，细胞成分(CC) 48条，分子功能(MF) 94条；右归丸生物过程(BP) 459条，细胞成分(CC) 52条，分子功能(MF) 96条。利用微生信平台对左、右归丸生物过程(BP)；细胞成分(CC)；分子功能(MF)三部分P值最小的前20项进行可视化展示并分析。结果显示，左、右归丸的生物过程(BP)均与RNA聚合酶II对转录的正调控、基因表达的正调控、对异生物刺激的反应、DNA引导转录的正调控、miRNA转录的正调控等有关；细胞成分(CC)包含细胞外空间、细胞外区域、含蛋白质的复合体、含胶原蛋白的细胞外基质、染色质等；分子功能(MF)与酶结合、核受体活性、雌激素反应元件结合、类固醇结合、锌离子结合等有关。除此之外，左归丸的生物过程(BP)还与胶原蛋白分解代谢过程有关，细胞成分(CC)包含线粒体和突触；右归丸的生物过程(BP)与RNA聚合酶II对转录的负调控有关，细胞成分(CC)包含外染色质和血小板α颗粒腔；分子功能(MF)二者均相同(见图4)。
Figure 4. (A) GO enrichment analysis of Zuoguiwan; (B) GO enrichment analysis of Youguiwan
图4. (A) 左归丸的GO富集分析；(B) 右归丸的GO富集分析
3.5. KEGG通路富集分析
分别将左、右归丸与疾病的交集靶点导入DAVID数据库，设置生物背景为Homo sapiens，进行KEGG通路富集分析，结果获得左归丸相关通路154条；右归丸相关通路156条。通过微生信平台对P值最小的前20项进行可视化展示并分析。结果显示前20项中，左、右归丸富集显著性较高的通路基本相同，主要包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化、松弛素信号通路、C型凝集素受体信号通路、Toll样受体信号通路等(见图5)。除此之外，对比所有富集通路，左归丸还与精氨酸和脯氨酸代谢有关；右归丸还与Hippo信号通路、AMPK信号通路有关(见图6)。
Figure 5. (A) KEGG enrichment analysis of Zuoguiwan; (B) KEGG enrichment analysis of Youguiwan
图5. (A) 左归丸的KEGG富集分析；(B) 右归丸的KEGG富集分析
Figure 6. Comparison of pathways related to Zuoguiwant and Youguiwan
图6. 左、右归丸相关通路对比
3.6. 分子对接
跟据PPI的分析结果，选取度值前5靶点与左、右归丸的主要活性成分进行分子对接验证。在PubChem数据库中下载化合物quercetin、beta-sitosterol、kaempferol、stigmasterol、leucine的3D结构mol2文件，在PDB数据库下载TNF、IL-1β、IL-6、AKT1、ALB、TP53的3D结构PDB文件。利用Chem 3D软件计算化合物的最小结合能；利用PyMOL软件对蛋白受体PDB文件进行预处理，去除水分子和不必要的结构。利用AutoDockTools软件进行分子对接，首先以蛋白质的活性位点为中心，在AutoDockTools中设置盒子和参数，并保存为GPF文件。运行自动对接网格后，得到结果文件，最后通过PyMOL软件对接结果进行修饰美化。一般情况下，结合能小于−5.0 kcal/mol说明配体和蛋白受体有良好的结合活性，结合能小于−8.0 kcal/mol可证明配体和蛋白受体有较强的结合活性。分子对接的结果显示(见图7)，药物小分子配体与靶点均有较好的结合活性，其中槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)与TNF、ALB的结合更为紧密；豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)与ALB的结合更为紧密。挑选部分结果进行可视化展示(见图8)。
Figure 7. Heat map of molecular docking binding energy
图7. 分子对接结合能热图
Figure 8. (A) ALB-quercetin docking result; (B) TNF-quercetin result; (C) TNF-kaempferol docking result; (D) AKT1-quercetin docking result; (E) IL-1β-quercetin docking result; (F) IL-6-quercetin docking result; (G) TP53-quercetin docking result; (H) ATK1-kaempferol docking result
图8. (A) ALB-quercetin对接结果；(B) TNF-quercetin对接结果；(C) TNF-kaempferol对接结果；(D) AKT1-quercetin对接结果；(E) IL-1β-quercetin对接结果；(F) IL-6-quercetin对接结果；(G) TP53-quercetin对接结果；(H) ATK1-kaempferol对接结果
4. 讨论
骨稳态是骨骼对机械应力的反应，由破骨细胞和成骨细胞的协调活动来维持，骨稳态失衡会诱发过度的骨吸收，导致原发性或继发性的骨质疏松症(osteoporosis, OP) [7]。左归丸、右归丸出自《景岳全书·新方八阵》，均具有滋补肾阴、填精补髓的功效[8]，基于中医学“肾主骨，骨生髓”的理论，在临床上常用于OP的治疗。研究表明，左归丸可通过调节骨代谢来促进骨形成，进而治疗OP [9]；右归丸可提高骨密度，缓解患者疼痛症状，达到治疗OP的目的[10]。然而，左、右归丸用于治疗OP的有效成分及核心蛋白的异同点尚不明确，阻碍了两种经典药物的进一步开发与利用。为了从整体层面上理清并区分左、右归丸治疗OP的作用机制，本研究采用网络药理学方法预测左、右归丸治疗OP的主要活性成分和核心靶点，接着通过分子对接技术验证其结果，从多组分、多靶点的角度去对比左、右归丸治疗OP的异同。
网络药理学的分析结果显示，筛选出的左、右归丸的药物活性成分主要包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇和亮氨酸等。槲皮素可通过激活Wnt/β-catenin通路促进成骨的分化[11]，从而缓解OP的症状；还可通过刺激OPG表达，同时抑制RANKL表达的双重作用，间接提高OPG/RANKL比值，重建RANKL/OPG系统的平衡，恢复OP状态下损伤骨的修复能力[12]。山奈酚可上调BMP-2，进而激活SMAD1/5/8通路来刺激成骨细胞增值，达到抗OP的效果[13]。左归丸的特有成分亮氨酸在调节细胞骨架组织和破骨细胞活性方面起到了关键的作用，实验证明，亮氨酸的缺乏会导致小鼠的长骨和脊椎的骨矿物质密度降低，进而导致OP [14]。右归丸的特有成分豆甾醇属于植物类固醇，可通过抑制COX-2酶的表现出抗炎作用[15]，还可刺激相关靶点提高胰岛素分泌雌激素的水平并促进血管生成[16]，从而达到治疗OP的效果。左、右归丸均可调节TNF、IL-1β、IL-6和AKT1来治疗OP，TNF可维持成骨细胞和破骨细胞间的平衡、介导炎症反应、促进血管生成和加剧滑膜增生，进而达到治疗OP的目的[17]；IL-1β具有诱导成骨细胞或破骨细胞分化的能力[18]；抑制脂肪细胞中IL-6的产生可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化[19]；PI3K/AKT1信号通路上调可促进破骨细胞分化的主要转录因子表达[20]；左归丸还可通过抑制TP53来治疗OP，TP53Arg72Pro多态性(Pro72-p53)的脯氨酸变体可降低OPG/RANK比值，进而导致骨组织恶化[21]。右归丸还可通过调节ALB进而抑制骨密度逆转骨量低和骨组织退化[22]。GO分析的结果显示，左、右归丸治疗OP主要涉及转录的调控、雌激素反应、类固醇结合等生物学过程，表明左、右归丸治疗OP的过程涉及多靶点和多种生物功能。KEGG通路富集的结果表明，左归丸的相关通路154条；右归丸的相关通路156条，其中IL-17信号通路可通过谷氨酰胺的介导来促进破骨细胞分化和调节能量代谢[23]；Th17/Treg的比例提高，AMPK/mTOR通路中上调LC3B和p-AMPK的表达，下调p-mTOR的表达，均可调节自噬进而维持骨稳态代谢平衡，有益于骨骼重塑[24] [25]。分子对接的结果显示，左、右归丸的活性小分子配体与核心靶点间均有较好的结合活性，其中槲皮素、山奈酚与TNF、ALB的结合更为紧密；豆甾醇、β-谷甾醇与ALB的结合更为紧密。此外，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇与TP53，豆甾醇、亮氨酸与TNF也具备良好的结合活性；Notch、JAK/STAT、NF-κB和TGF-β等细胞信号通路，也均在骨重塑中发挥着至关重要的作用[26]，以上的成分与靶点在经过进一步验证后也可作为左、右归丸治疗OP的新理论依据。
5. 结论
综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接的方法整体分析和阐述了左、右归丸治疗OP的异同。左、右归丸治疗OP的主要活性成分包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇；亮氨酸可作为左归丸的特有成分；豆甾醇可作为右归丸特有成分。左、右归丸均可调节TNF、IL-1β、IL-6和AKT1来治疗OP；左归丸还可通过调节TP53来治疗OP；右归丸还可通过调节ALB达到治疗OP的效果。左、右归丸均可通过IL-17信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化起到治疗OP的作用；此外，左归丸还可影响精氨酸和脯氨酸代谢，右归丸还可作用于Hippo信号通路、AMPK信号通路。这为后续OP治疗药物的开发以及机制的研究提供了理论基础。
致 谢
感谢广东省中医药局、云浮市卫生健康局的基金支持。
基金项目
广东省中医药局科研基金面上项目(20231200)、广东省中医药局中医药专项基金(20223026)、云浮市医学科学技术研究项目(云浮市卫生健康局科研项目) (2021B042)。
NOTES
*通讯作者。