1. 引言
盆腔炎性疾病(Pelvic Inflammatory Disease, PID)是女性上生殖道的一组感染性疾病，主要包括子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、盆腔腹膜炎。临床常见表现为下腹部疼痛难忍，或伴高热，白带量多臭秽，甚至如脓血。近年来，盆腔炎的患病率呈增长趋势。Deng He等[1]的研究表明，2019年全球有105万育龄妇女持有活跃的PID。1990~2019年间PID患病率增加到36.66%。国内尚无大样本的流行病学报道，仅2011~2016年间安徽省合肥市女性盆腔炎检出率高达9.5% [2]。调查研究发现[3] [4]，因PID接受过治疗的患者中约有24.2%合并不孕症，PID患者发生妊娠早产的风险较普通人群高1.864倍，发生异位妊娠的风险升高2.121倍。由此可见，盆腔炎性疾病对育龄期女性的生殖健康和生活质量产生了非常大的影响。
中医类古籍中没有关于“盆腔炎性疾病”的记载，根据疾病的临床表现可归属于中医学“妇人腹痛”、“癥瘕”、“带下病”、“热入血室”、“产后发热”的范畴[5]。临床常见证候有热毒炽盛证、湿毒壅盛证、湿热蕴结证、瘀热内结证，其中以湿热蕴结证最为常见。《盆腔炎症性疾病诊治规范》(2019修订版) 明确提出中医中药在抗生素治疗的基础上发挥减少盆腔痛后遗症发生的作用。临床研究表明，中医药干预可以有效治疗PID，并能显著提高疗效、缩短疗程、预防复发和慢性盆腔痛的发生[7] [8]。
银甲片是在成都中医药大学附属医院妇科名家王渭川老先生的自制方“银甲丸”基础上形成的院内制剂，主要针对湿热蕴结下焦的盆腔炎性疾病。临床运用60余年，疗效确切。但是具体的生物过程和分子机制尚不清楚。本研究使用网络药理学的方法、工具和分子对接技术，对银甲片的有效化合物和基因进行筛选，分析其主要作用基因和作用通路，进而探究其作用机制，以期为银甲片治疗PID提供更多的依据。
2. 材料与方法
2.1. 筛选银甲片有效化合物及预测基因
于TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph)、ETCM (http://www.tcmip.cn/ETCM/)和HERB (http://herb.ac.cn/)数据库中检索各药物所含化合物及其对应靶标。TCMSP数据库中根据化合物的生物利用度(OB) ≥ 20%，类药性(DL) ≥ 0.1，进行ADME筛选。ETCM数据库中则根据预测分 ≥ 0.8且Drug likeness Grading为Moderate、Good进行筛选。HERB数据库中利用其SMILES结构式在Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)中进行筛选。
2.2. 获取盆腔炎性疾病基因
以“Pelvic Inflammatory Disease”为关键词在DisGeNET疾病数据库(https://www.disgenet.org/)获取疾病基因。从高质量蛋白组学数据库HINT (High-quality Interactomes)下载物种为“人”的所有高质量二元蛋白–蛋白相互作用[9]，用Cytoscape_3.6.0软件构建人的全基因组蛋白–蛋白相互作用网络(HINT网络)。将PID的所有基因映射到此网络，获取所有靶标节点以及它们之间的边，得到PID基因网络。
2.3. 筛选银甲片基因与PID基因的交集
将基因录入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)与UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)规范格式，利用在线作图网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)构建银甲片基因与PID基因Venn图，获取银甲片与PID的交集基因。
2.4. 构建蛋白质–蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络
使用1.2中的方法，将1.3所获得的银甲片与PID的交集基因映入HINT网络中，得到交集基因PPI网络。利用Cytoscape_3.6.0对交集基因网络进行拓扑分析。根据拓扑分析结果选取核心基因，用于分子对接。
2.5. 构建化合物–交集基因网络
将化合物–基因对应信息导入Cytoscape_3.6.0软件中，获得化合物–基因网络。将交集基因映射到此网络中，获取化合物–交集基因网络，后对其进行拓扑分析，根据节点连接度(Degree)、介数中心性节点拓扑指标(Betweenness Centrality)与接近中心性(Closeness Centrality)筛选出关键化合物。
2.6. 进行交集基因GO富集与KEGG通路分析
利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对1.3所获得的交集基因进行GO生物功能分析，包括生物过程(Biological process, BP)、细胞组分(Cell component, CC)和分子功能(Molecular function, MF)与KEGG通路富集分析，后利用微生信在线生物信息学分析、可视化云平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)对GO与KEGG通路富集结果进行可视化。
2.7. 重要化合物及核心基因的分子对接
利用PubChem数据库获取关键化合物结构的SDF文件，并使用OpenBabel-2.4.1将其转换为PDBQT格式。使用UniProt数据库获得核心基因的蛋白结构。将以上两种文件导入SailVina分子对接平台，进行分子对接。
3. 结果
3.1. 银甲片中的有效成分及其基因
整合各个中药的有效化合物及靶标共获得有效化合物211个，基因3023个(如表1)。其中草红藤在各数据库中均无信息，故查询相关文献[10]-[12]，获得其有效化合物为杨梅素(Myricetin)和白蔹素(Ampeloptin)，利用Pubchem数据库获取其对应靶标，后使用Swiss Target Prediction进行ADME筛选，获得有效化合物。
Table 1. Number of compounds contained in Yinjia tablet and the corresponding potential targets
表1. 银甲片包含的有效化合物和对应的潜在基因个数
银甲片组方中药 |
Tcmsp数据库 |
Etcm数据库 |
Herb数据库 |
化合物总数 |
靶点 总数 |
化合物数 |
靶点数 |
化合物数 |
靶点数 |
化合物数 |
靶点数 |
川楝子 |
10 |
247 |
1 |
1 |
|
|
35 |
2078 |
大青叶 |
10 |
65 |
9 |
177 |
|
|
17 |
233 |
姜黄 |
11 |
58 |
21 |
43 |
|
|
19 |
257 |
蒲黄 |
9 |
215 |
7 |
114 |
|
|
47 |
612 |
夏枯草 |
17 |
240 |
6 |
100 |
|
|
23 |
314 |
茵陈 |
15 |
191 |
4 |
7 |
|
|
38 |
336 |
紫花地丁 |
6 |
38 |
3 |
41 |
|
|
9 |
77 |
败酱草 |
16 |
238 |
|
111 |
562 |
43 |
504 |
忍冬藤 |
|
2 |
9 |
37 |
234 |
9 |
240 |
鳖甲 |
|
|
16 |
34 |
3 |
34 |
琥珀 |
|
|
50 |
52 |
4 |
23 |
蒲公英 |
|
|
72 |
361 |
18 |
315 |
草红藤* |
|
|
|
2 |
267 |
*为川药，其化合物由搜索文献获得，靶点经Swiss Target Prediction数据库筛选。
3.2. 盆腔炎性疾病的基因
在DisGeNET疾病数据库获得疾病基因共74个。因基因过少，影响结果，故构建HINT网络。获取疾病基因1128个(如图1)。
3.3. 银甲片与PID交集基因
将银甲片基因规范格式后，获得交集基因共290个(如图2)。
Figure 1. PID target network. In the left panel, the yellow and green-purple regions represent disease-associated genes obtained from the DisGeNET database (totaling 74 genes). The middle panel illustrates disease genes mapped through the HINT database (totaling 1,128 genes) within the green region
图1. PID基因网络。左图中黄色为绿紫色区域为DisGeNET疾病数据库获得疾病基因(共74个)，中图中绿色区域为HINT数据库映射到的疾病基因(共1128个)
Figure 2. Venn diagram of Yinjia Tablet-PID target
图2. 银甲片-PID基因Venn图
Figure 3. PPI network of PID-Yinjia tablet intersection target. The target color depth and size represent the size of the Degree value
图3. PID-银甲片交集基因PPI网络。基因颜色深浅及大小代表Degree值的大小
Figure 4. Biological function analysis bar chart of PID-Yinjia tablet intersection target gene ontology (GO)
图4. PID-银甲片交集基因基因本体(GO)生物功能分析条形图
Figure 5. PID-Yinjia tablet intersection target bubble map of Genomic Encyclopedia (KEGG) pathway analysis
图5. PID-银甲片交集基因基因组百科全书(KEGG)通路分析气泡图
3.4. 交集基因PPI网络及GO富集与KEGG通路分析
将290个交集基因映射到HINT网络中，得到交集基因PPI网络，根据Degree值 > 30，选取核心基因：TP53、PIK3R1、APP、HSP90AA1 (图3)。利用DAVID数据库对交集基因进行GO功能富集，共获得生物功能(BP) 725条，涉及对细胞周期、增殖、分化的调控、蛋白质磷酸化、炎症反应和免疫反应等；分子功能(MF) 177条，涉及蛋白结合、蛋白激酶激活、ATP结合与DNA结合等过程。根据P Value < 0.05、查阅相关资料选取BP、CC、MF中排名在前20的通路，进行可视化分析，制作富集条形图(图4)。交集基因共映射到172条KEGG信号通路，包括FoxO信号通路、TH17细胞分化通路、T细胞受体信号通路、IL-17信号通路等通路。同法选取排名在前20的通路，制作气泡图(图5)。
3.5. 化合物–交集基因网络
将211个化合物与3023个基因的数据信息导入Cytoscape_3.6.0软件中，得到化合物–基因网络。之后，将290个交集基因映射到此网络中，获取化合物–交集基因网络(图6)。并对其进行拓扑分析，以Degree ≥ 20、Betweenness Centrality ≥ 0.05、Closeness Centrality ≥ 0.3筛选出关键化合物腺苷(Adenosine)、芹菜素(Apigenin)、香豆雌酚(Coumestrol)、姜黄素(Curcumin)，用于后续分子对接。
Figure 6. Compound-intersection target network. The pink nodes represent compounds, and the red nodes are important compounds. Blue nodes represent intersection targets
图6. 化合物–交集基因网络。粉色节点代表化合物，其中，红色节点重要化合物。蓝色节点代表交集基因
3.6. 重要化合物及核心基因的分子对接
将2.4筛选的核心基因使用UniProt数据库获得分辨率高(<2 A)、连接有配体的蛋白结构，TP53 (PDB ID: 3LW1)、PIK3R1 (PDB ID: 5GJI)、APP (PDB ID: 2G47)、HSP90AA1 (PDB ID: 5J27)保存为PDB格式文件。之后与2.5筛选出的关键化合物的PDBQT格式文件在SailVina分子对接平台，进行两两分子对接，每次对接进行100次，获取对接分数。对接分数表示对接结合能力的大小。由图7可知，对接结合能的绝对值均大于5.0 kcal/mol，证明化合物与基因之间具有高结合亲和力[13]。选取对接结合能绝对值大于10 kcal/mol的对接结果，进行可视化(图8、图9)。
Figure 7. Absolute value heat map of bonding energy. The darker the color, the stronger the bonding energy
图7. 对接结合能的绝对值热图。颜色越深，代表对接结合能力越强
Figure 8. Molecular diagram of Apigenin and PIK3R1. The blue line represents hydrogen bonds, and the more hydrogen bonds, the stronger the binding force. The dotted line is the hydrophobic bond. The same below
图8. 芹菜素与PIK3R1对接分子图。其中，蓝色线条代表氢键，氢键越多，结合力越强。虚线为疏水键。下同
Figure 9. Molecular diagram of Coumestrol docking with PIK3R1
图9. 香豆雌酚与PIK3R1对接分子图
4. 讨论
PID常由内源性和外源性病原体混合感染所致，外源性病原体主要为性传播疾病的病原体，如淋病奈瑟菌、沙眼衣原体；内源性病原体则为包括需氧菌、厌氧菌在内的原寄居于阴道内的微生物群[14]。中医认为PID主要的致病因素可归为“湿、热、毒”，故中医治疗PID的治疗原则为清热解毒利湿，凉血化瘀止痛[15]。川派中医妇科则结合四川盆地湿热交争、人们喜食辛辣的特点，对于盆腔炎性疾病多责之湿热之邪，以“清热、化湿、渗湿”为治疗方法[16]。2017年发表的《中医药单用/联合抗生素治疗盆腔炎性疾病临床实践指南》[17]中指出对于盆腔炎性疾病湿热蕴结证的亚临床期和亚急性期可单用中医药银甲丸加减治疗。银甲片为川派名家王渭川之经验方银甲丸研制而成的院内制剂，包括草红藤、蒲公英、紫花地丁、茵陈、大青叶、蒲黄、鳖甲、琥珀、败酱草、忍冬藤、姜黄、夏枯草、川楝子13味药，方中草红藤、蒲公英、紫花地丁、大青叶、败酱草、忍冬藤、夏枯草等药重在清热解毒，茵陈清热利湿，蒲黄、鳖甲、琥珀活血化瘀散结，川楝子行气止痛。全方合用，共奏清热利湿、化瘀行滞之效[7]。
从银甲片化合物–交集基因网络分析中可以推测腺苷、芹菜素、香豆雌酚、姜黄素等化学成分是与PID相关基因作用最强的化合物。腺苷是一种内源性核苷，可以通过腺苷受体与Gs蛋白偶联，刺激细胞内第二信使环磷酸腺苷(cAMP)的产生，调节抗炎和促炎介质，cAMP数量的增加，平滑肌松弛，有效防止炎症、纤维化[18]。芹菜素是一种黄酮类化合物，具有多重功效，可抑制炎症反应、减少氧自由基产生、减轻水肿等[19]，发挥抗炎抗氧化的作用[20]。王冬敬等[21]研究发现芹菜素通过抑制核因子κB (NF-κB)的激活，下调髓样分化因子(MyD88)蛋白表达，从而降低炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。香豆雌酚是一种植物衍生化合物，通过与内源性雌激素竞争受体抑制高水平雌激素的作用，诱导细胞凋亡[22]。姜黄素具有多种生物活性，可间接或直接调节炎症分子，参与体内抗炎、抗氧化等多种生物过程。在炎症状态下，环氧化物水化酶1 (COX-1)和环氧化物水化酶2 (COX-2)表达增加。姜黄素可直接抑制COX-1和COX-2活性，发挥其抗炎和免疫调节作用[23] [24]。芹菜素也可抑制COX-2活性，减少Toll样受体-4的表达和NF-κB的激活达到抑制炎症的目的[25]。综上，可推测银甲片可降低炎症因子的表达，调节炎症反应，从而抑制PID的发生发展。
交集基因PPI网络中可知TP53、PIK3R1、APP、HSP90AA1等基因可能为银甲片的关键作用基因。p53蛋白是TP53基因编码的一种重要的肿瘤抑制蛋白，可通过调节炎症介质如反应性氧化物和氮化物、细胞因子、感染因子以及主要的免疫调节途径如NF-κB等，多途径调控炎症反应[26]。PIK3R1为磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶(Akt)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的关键靶点。Luyendyk等人[27]通过敲除PIK3R1基因发现PI3K-Akt通路活动被抑制，LPS诱导的TNF-α、IL-6等炎症因子的表达增强。银甲片中的活性成分可能与PIK3R1结合通过PI3K-Akt-mTOR通路抑制炎症反应的发展。APP是一种在细胞表面广泛表达的蛋白质，参与调节细胞间或细胞与基质间的相互作用，与单核细胞向巨噬细胞的分化有关。在炎症反应下，单核细胞跨内皮迁移增加，此过程中可刺激单核细胞中APP依赖性促炎信号传导、分泌促炎分子进而持续炎症状态，且NF-κB可刺激APP的表达，进一步激化炎症反应[28]。HSP90AA1为热休克蛋白90 (HSP90)家族的一个亚型，可诱导抗原呈递细胞(APC)的成熟和活化，刺激其分泌促炎因子和共刺激因子。HSP可促进主要组织相容性复合体I类(MHC-I)和MHC-II表位的交叉呈现，启动CD8+和CD4+T细胞效应反应，以及B细胞的增殖[29]。当组织受到侵害时，HSP会阻止异常蛋白质聚集和介导未成熟或错误折叠的蛋白质运输到细胞器进行修复、包装或降解，从而阻止组织病变。此外，其还参与调节其他炎症相关信号通路，如NF-κB和MAPK通路等[30] [31]。故银甲片中的活性成分可能与以上基因结合，激活相关通路，调节炎症细胞的活性和功能，抑制其分泌促炎信号及促炎因子，从而抑制炎症反应，改善PID患者的临床症状。
对交集基因进行GO功能富集，发现交集基因主要参与细胞增殖和分化的调控、炎症反应和免疫反应等过程。KEGG信号通路分析表明，交集基因主要参与FoxO信号通路、TH17细胞分化通路、IL-17信号通路等通路。FoxO是一个功能多样的转录因子大家族。FoxO可通过细胞表面CD28+T细胞的共刺激，阻断无变应性T细胞的诱导。CD28+T细胞的连接反应也被证明可以激活PI3K-PKB信号通路(已知可以调节FoxOs)并降低细胞周期抑制剂p27 (KIP1)的表达水平，以维持无反应性T细胞的静止状态，降低炎症反应[32]。CD4+T辅助细胞是整个炎症与免疫功能的核心，可分化为具有促炎作用的TH17细胞与抗炎作用的Treg细胞。Th17和Treg细胞平衡的改变可导致炎症、癌症或自身免疫性疾病的发生。CD4+T的分化方向取决于Fxop3和RORγt的活性，TGF-β诱导Fxop3驱动Treg细胞谱系分化，还可结合IL-6诱导转录因子RORγt的表达，驱动Th17细胞的产生。因此，Fxop3和RORγt之间的平衡对于Th17和Treg细胞之间的平衡至关重要[33] [34]。此外，TAZ是RORγt的重要共激活因子，可通过降低Foxp3的乙酰化作用，靶向Foxp3进行蛋白酶体降解，从而促进TH17细胞分化，减少Treg细胞分化。Th17细胞在被转录因子RORγt和RORα激活后，可产生IL-17A、IL-17F和IL-22等因子。IL-17可激活NF-κB、MAPK和C/EBP级联反应，诱导趋化因子、细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPs)等促炎基因的表达；通过与TNF-α协同作用，促进趋化因子基因表达以及抗菌肽的产生；还可激活JAK-PI3K和JAK-STAT通路促进炎症反应，下调炎症组织中microRNA-23b的表达来促进NF-κB的激活，发挥其促炎作用[36]。另外，IL-17还可增加成纤维细胞的血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞化学引诱剂(KC)、巨噬细胞炎症蛋白2 (MIP-2)、前列腺素和一氧化氮(NO)的产生，参与炎症血管生成。因此，Th17/Treg细胞比例失衡致炎症微环境持续存在可能是PID发病的重要机制之一。
5. 结论
综上，在盆腔炎发展过程中可产生基因毒性物质、激活细胞的氧化应激反应，激活TP53、PIK3R1、HSP90AA1所介导的信号通路，产生炎症因子，促进炎症发生发展。银甲片中的腺苷、芹菜素、香豆雌酚、姜黄素等化合物可能作用以上核心基因，通过调节FoxO信号通路、TH17细胞分化通路、IL-17信号通路抑制炎症反应，促进局部防御功能的恢复，改善局部组织损伤与组织纤维化的状态，防止盆腔炎性疾病的不良结局。本研究结果有待进一步进行体内外实验验证，为以后临床以及基础实验提供更多参考。
NOTES
*通讯作者。