续断种子方对弱精子症模型大鼠附睾超微结构的实验性研究

Experimental Study on Ultrastructure of Epididymis of Asthenospermia Model Rats with Xuduan Zhongzi Formula

摘要: 目的：探讨续断种子方对弱精症大鼠附睾超微结构的作用机制及影响。方法：对42只健康雄性SD大鼠采取常规饲养，随机选取5只作为空白对照组。对余下的37只大鼠腹腔注射环磷酰胺建立弱精症模型，随机抽取2只进行精子质量检测，以此对造模成功进行验证。最终选取30只成模大鼠，将动物随机均分为三组：模型组、阳性对照组(左卡尼汀组)和给药组(续断种子方组)，每组数量分别为5只。对模型组大鼠实施胃内灌注的操作，把2毫升0.9%氯化钠溶液注入其中；左卡尼汀组大鼠每天均要接受100 mg (kg·d)⁻¹的左卡尼汀溶液灌胃(溶于温开水)；续断种子方组所使用的是免煎颗粒，每天剂量控制在10 g (kg·d)⁻¹，溶于温水后灌胃，每日操作一次，连续进行8周后即可取材。对大鼠精子浓度及总活力进行系统的检测，同时将显微镜和电子显微镜技术应用于其中，细致地观察睾丸与附睾的组织结构。结果：模型组的大鼠精子浓度和总活力与空白组相比较，呈现显著下降(P < 0.01)；与模型组相比较，续断种子方组和左卡尼汀组大鼠的精子浓度及总活力均显著提高(P < 0.05)；与左卡尼汀组相比较，断种子方组在精子浓度和总活力方面均表现出显著的提升(P < 0.01)；HE染色显示，续断种子方组大鼠的附睾组织相较于模型组有显著改善：上皮结构保持完好无损，细胞排列规则，退化解体现象减少，精子密度增加，仅见少量畸形精子，间质出现轻微水肿。利用电子显微镜进行观察，可以看到大鼠附睾上皮细胞的排列更为有序，具有更为丰富的游离面微绒毛和更高完整度的细胞核细胞质中粗面内质网结构，线粒体量更多且层次分明，伴随空泡样改变细胞数量相对较少，附睾管腔精子以正常结构为主。结论：续断种子方能有效改善弱精子症大鼠模型浓度、总活力，减少附睾结构损伤，稳定附睾微环境，为附睾精子发育成熟提供有利的条件。

Abstract: Objective: To study the effect and mechanism of Xuduan Zhongzi formula on ultrastructure of epididymis in asthenospermia model rats. Methods: A total of 42 male SD rats were fed daily, 5 blank rats were randomly selected, the other rats were given cyclophosphoamide injection, and 2 rats were randomly selected for sperm detection to verify the success of modeling. 30 asthenospermia model rats were randomly divided into model group, Xuduan Zhongzi formula group and L-carnitine group, with 5 rats in each group. Rats in model group were given 2 ml 0.9% sodium chloride solution by intragastric administration; L-carnitine group rats were given L-carnitine solution of 100 mg/(kg·d)⁻¹ dissolved in warm water by intragastric administration; Xuduan Zhongzi formula group was given 10 g/(kg·d)⁻¹ Xuduan Zhongzi formula decoction dissolved in open water and intragastric administration, once a day, for 8 weeks. The spermatozoa concentration and total motility of rats were measured, and the tissue structure of testis epididymis was observed by microscope and electron microscope. Result: Compared with blank group, sperm concentration and total motility of rats in model group decreased significantly (P < 0.01). Compared with model group, spermatozoa concentration and total motility of spermatozoa group and L-carnitine group were significantly increased (P < 0.05). Compared with L-carnitine group, the sperm concentration and total motility in Xuduan Zhongzi group were significantly increased (P < 0.01). HE staining microscopy showed that the epididymal epithelium of rats in the Xuduan Zhongzi formula group was more intact than that in the model group, cells were arranged neatly, and the epithelium was occasionally deformed and deformed. The sperm concentration was higher than that in the model group, some deformed sperm were present, the interstitial epididymis was mildly edema, and tiny blood vessels were dilated. Ultrastructure under electron microscope, epididymal epithelial cells in the Xuduan Zhongzi formula group were arranged neatly, and the free surface microvilli were more abundant than those in the model group. The structure of the rough endoplasmic reticulum in the nucleus cytoplasm is relatively complete, and the number of mitochondria is large and the hierarchy is clear. Compared with the model group, there were fewer cells with vacuole-like changes and more sperm with normal structure in epididymal lumen. Conclusion: Xuduan Zhongzi formula can effectively improve the concentration and total vitality of asthenospermia rat model, reduce the damage of epididymal structure, stabilize the epididymal microenvironment, and provide favorable conditions for the development and maturation of epididymal sperm.

1. 引言

2021年laboratory manual for the examination and processing of human semen, 6th ed [1]精子总数以及天下运动精子等指标与第5版相比出现了些许程度降低，这一结果提示人类的精子质量存在下降的可能。当代，弱精子症成为男性不育的关键因素，而这一病症的出现受多种影响因素的影响，如精索静脉曲张、睾丸附睾结构异常、男性生殖系感染、环境因素等[2] [3]，其中附睾结构和微环境的异常是导致弱精子症的原因之一[4]。精子的结构完整性、形态特征及功能状态在发育过程中的时空特异性异常，均可能导致质量下降，具体表现为数量减少或运动能力障碍等[6]。续断种子方的起源可追溯至明代岳甫嘉著作的《妙一斋医学正印种子篇》[5]，即“补肾健脾益气种子煎方”，岳甫嘉在该方剂中对于种子繁育机理进行系统的论述，指出精神气血均源自脾土的运化功能。该方剂的主要功效为生精迅速、壮阳效捷，特别指出，如果能做到适度控制房事，对生育有益，实为助孕的首选良策，特此记录以供广泛传播。课题组在前期实验及临床研究中发现，续断种子方对治疗少弱精子症患者有一定治疗效果[7]-[9]。

2. 材料与方法实验材料

2.1. 动物

于湖南斯莱克景达公司采购雄性SD大鼠42只，6~8周龄，200~220 g体质量，实验动物被饲养在广西中医药大学医学分子生物学重点实验室(使用许可证号：SCXK(湘)2019-0014)，环境条件控制在温度19℃~25℃、相对湿度55%~65%，每日光照10~12小时，不控制进食饮水。为保证环境卫生，笼中玉米芯垫料要每三天更换一次。在实验开展前，报备广西中医药大学动物伦理委员会审核，通过后正式实施。

2.2. 药物及试剂

由上海碧云天生物技术有限公司负责提供伊红染色试剂；经北京中杉金桥生物技术有限公司提供，TUNE试剂盒(产品编号：11684817910)；广西卓一生物技术有限公司负责提供10%中性福尔马林固定液和水合氯醛。江苏恒瑞医药股份有限公司生产负责提供环磷酰胺(国药准字：H32026196)。

① 本研究采用的是由天江药业生产的批号为1203002的免煎配方颗粒，用于配制续断种子方，其组方为：续断、骨碎补、杜仲、菟丝子、党参、牛膝、山药各15 g；枸杞子、女贞子、白术各10 g。

② 本实验所选用的左卡尼汀口服溶液系由东北制药总厂提供(规格：10 mL × 6支，国药准字H19990372)。

2.3. 主要仪器

实验设备包括：TDL-4ZB离心机(湖南星科)、MACRO精子计数板(北京伟力)、WLJY-9000精子检测系统(北京伟力)、5200Multi分析系统(上海天能)、Tecnai G2 20显微镜(美国FEI)。

3. 实验方法

3.1. 动物分组

把42只SD大鼠置于标准环境下适应性喂养，时间为7天，每日对其摄食量、饮水量及行为活动进行记录。采用双盲随机分组法，设置空白对照组10只(含2只备用样本用于精子质量分析)，模型组、左卡尼汀组，续断种子方组，各10只。

3.2. 模型制备

剩余32只大鼠均采用80 mg/(kg·d)⁻¹环磷酰胺以0.9%氯化钠溶液稀释后连续7 d腹腔注射造模[10]，随机数字表法抽取2只检测精子质量，提示弱精子症，验证造模成功。

3.3. 给药方法

造模成功后，从第8天正式开始对每组大鼠分别给药。其中，模型组大鼠采用灌胃给药，每次4 mL的0.9%氯化钠溶液；实验组(续断种子方)则将方剂溶剂[10 g/(kg·d)⁻¹]稀释、搅拌后，使用温开水灌胃；左卡尼汀组则将该溶液[100 mg//(kg·d)⁻¹]溶解于水后，使用温开水灌胃；空白组大鼠不灌胃。均持续喂养8周。

3.4. 观察指标

实验检测指标涵盖精子浓度、总活力参数，把HE染色法利用起来，对于附睾组织显微结构展开分析，并利用透射电镜对其超微结构特征进行细致的观察。

3.4.1. 精子质量检测

对各组大鼠末次给药24 h后取材前，麻醉处理，逐层剪开腹腔，迅速取出附睾置于器皿中，使用预热后0.9%氯化钠溶液冲洗。将大鼠一侧附睾置于2 mL 0.9%氯化钠溶液中，时间控制在1天，在此之后，遵循既定程序，依次进行脱水处理(梯度乙醇)、透明化处理(二甲苯)、石蜡切片包埋处理，继而进行HE染色及质量检测工作。在另一侧加入2 mL培养液，使精子在其中进行30分钟的游动，经过37℃孵育后，进行精液分析。参考WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 6th ed标准执行，检测大鼠精子浓度与总活力，并记录相应数据[1]。

3.4.2. 大鼠附睾组织标本制作

取大鼠附睾组织，Bouin’s液固定48 h后取出，采用梯度乙醇脱水法进行处理，执行标准石蜡包埋程序，并连续切片，每次切片的厚度维持在4 μm左右。完成切片后将其镊到玻片上放置，加入至40℃的温水中进行浸泡处理，盖上载玻片。二甲苯溶解石蜡切片后，将其置于75%酒精内进行浸泡，时间控制在5分钟，随后以流水冲洗两次(每次控制在5分钟)。随后滴加100 μL苏木素染液，染色时间控制在8分钟；染色完成后，先用流水冲洗去除分化液，随后用1%氨水处理30秒使组织返蓝，双蒸水冲洗后浸入伊红染液，时间控制在8分钟，再次流水冲洗。最后用二甲苯透明液处理两次，每次时间控制在4分钟；遵循规定程序，依次滴加透明中性树胶，做信息标记，观察睾丸组织形态与结构变化。

3.4.3. 大鼠附睾组织透射电镜样品制作

各组大鼠取材将摘取下的大鼠附睾于2.5%戊二醛固定液震荡洗涤，切取2 mm附睾组织，常规双重固定附睾组织块，缓冲液漂洗30 min，梯度浓度乙醇脱水，丙酮混合Epon812包埋剂均匀渗透组织，60℃包埋48 h聚合硬化成块。使用超薄切片机进行半薄切片(10 μm)，转至滴水载玻片，而后经过加温、染色等处理后转移至光学显微镜下观察和定位供电镜观察。铜制载网清洗后，Formvar膜覆盖，继续超薄切片机切片(100 nm)，加入醋酸铀–枸橼酸铅进行双染色，均为15 min，转移到室温下进行干燥过夜处理，通过电镜观察内部附睾组织超微结构发生的一系列变化情况，观察内容包括细胞核、溶酶体、线粒体等。

3.5. 统计学方法

将相关数据使用Excel软件记录后导入至SPSS 20.0软件中进行分析。数据分析结果通过GraphPad Prism 9.0软件绘图可视化。

4. 实验结果

4.1. 一般情况

造模7 d后的大鼠进食、饮水都有所减少，且精神萎靡，毛发干枯掉落、光泽变暗，活动减弱，大便质地稀烂等类似于中医学脾肾两虚证的表现；空白组大鼠外观、饮食与活动情况未见明显异常。灌胃中出现了刺破血管或食管等问题，模型组、左卡尼汀片组各出现一只死亡。

4.2. 续断种子方对模型大鼠精子浓度及总活动力的影响

浓度得分上，模型组相比于空白组显著降低；而续断种子方组与卡尼汀组相比于空白组显著上升，均通过0.01水平的显著性检验(P < 0.01)；相比于左卡尼汀组，续断种子方组显著上升，通过0.05水平的显著性检验(P < 0.05)。

总活力得分上，与空白组相比而言，模型组大鼠具有更低的精子浓度(P < 0.01)；与模型组相比，两组治疗组的精子浓度显著增加；治疗组间比较，续断种子方组大鼠精子浓度显著上升(P < 0.05)。见表1。

Table 1. Sperm concentration and total motility of epididymal sperm in each group of rats ($\overline{x}\pm s$ )

表1. 各组大鼠附睾精子浓度、总活力($\overline{x}\pm s$ )

组别	n	浓度(×10^6/mL)	总活动力(%)
空白组	10	47.36 ± 6.88^a*	63.41 ± 8.50^a
模型组	9	16.23 ± 6.33	23.39 ± 4.59
左卡尼汀片组	9	29.02 ± 4.64^a	33.15 ± 4.62^a
续断种子方组	10	34.89 ± 2.63^ab	43.68 ± 3.39^ab

注：与模型组比，P < 0.01；与左卡尼汀组比，^△P < 0.05。与模型组比，^aP < 0.01；与左卡尼汀组比，^bP < 0.05。

4.3. 对大鼠附睾物理支持结构的影响

在光学显微镜下观察，可看到模型组大鼠睾丸组织呈现出较为显著的病理变化：上皮细胞稀疏，生精小管结构紊乱，管腔内非生精细胞增多，间质区域缺损明显，同时伴有精子密度下降(图1(A))。左卡尼汀组附睾结构完整，细胞排列整齐，间质轻微水肿，有炎症细胞浸润，管腔内有大量成熟精子，也有少量不成熟或畸形精子(图1(B))。续断种子方组组织结构完整，细胞排列井然有序，精子密度较模型组显著提升，仅可见少量畸形精子，附睾间质出现轻度水肿(图1(C))。空白组则显示正常组织结构，附睾的上皮细胞和管腔内的精子都展示出良好的健康状况(图1(D))。

(A) 模型组(model group) (B) 左卡尼汀组(L-carnitine group)

(C) 续断种子方组(Xuduan Zhongzi Formula group) (D) 空白组(blank group)

Figure 1. Epididymal tissues of rats in each group (HE staining, 200×)

图1. 各组大鼠附睾组织(HE染色，200×)

(A) 模型组(model group) (B) 左卡尼汀组(L-carnitine group)

(C) 续断种子方组(Xuduan Zhongzi Formula group) (D) 空白组(blank group)

Figure 2. Epididymal tissue of rats in each group (Transmission electron microscopy, 5000×)

图2. 各组大鼠附睾组织(透射电镜，5000×)

4.4. 对大鼠附睾超微结构的影响

电镜观察显示，模型组附睾上皮呈现显著病理改变：细胞排列由规则的多层结构转变为松散的单层分布，游离面微绒毛密度明显降低，并可见特征性的空泡样变性细胞。管腔内主要存在畸形或未成熟的精子，腔面有明显的脱落胞质(图2(A)。与空白组大鼠相比，左卡尼汀组超微结构类似，未见明显的形态结构异常或排列异常；相比较于模型组，游离表面的微绒毛数量有所增加，同时细胞空泡化现象明显减少；细胞核正常定位于基底部，形态规则且大小均匀，核内染色质呈现为均匀分布状态，核膜轻度皱褶同时伴有内陷；丰富的溶酶体与圆形线粒体分布其间，高尔基体数量众多，各类细胞器结构均保持完整。发现少量畸形精子在附睾管腔内，但比例较低(图2(B))。与模型组相比较，续断种子方组中，上皮细胞排列有序，微绒毛在游离面显著增加，完整粗面内质网结构清晰，线粒体分布密集，空泡样细胞较少，以正常形态精子为主导(图2(C))；空白组大鼠的附睾上皮细胞呈现出规则的形态和整齐的排列，结构正常，且管腔内精子及上皮细胞均呈现正常生理状态，细胞核大、核仁清晰可见，染色质呈均匀分布状态，以成熟精子为主(图2(D))。

5. 讨论

弱精子症是男性不育症中最为常见类型之一，其发病机制尚未完全清楚[11]。睾丸是精子生成的起点，精子经历三个阶段：精原细胞、精子细胞、成熟精子，涉及增殖分化和减数分裂等过程，任何环节异常都可能导致精子发育异常[12] [13]。精子尾部在初入附睾时亦呈卷曲状态，在形态方面趋于完全成熟状态：进入后体积与头部变小，其原生质滴多已从尾部末端脱落，而精子尾部亦由卷曲变为平直，精子膜流动性降低[14]。附睾不同区段不同组份的生理活性物质的综合作用下，原本不成熟的精子形态和功能趋于成熟，以静息非凝状态储存于附睾尾部[15]，其中的精子的成熟与自身参与细胞运动、免疫反应、精子获能等相关的RNA的表达存在密切关联[16]。附睾为精子提供了成熟发育的核心场所[5]，而附睾管的主要组成成分是附睾上皮细胞[17]。综上，附睾上皮细胞种类多，含有丰富的内质网、高尔基体[18]。附睾具有独特的区域支撑结构，其空间分布特征显著。同时，精子在附睾发育阶段的时间分布规律已明确，共建发育、成熟的微环境[19]。

研究显示，与空白组相比，模型组大鼠的精子浓度和活力明显降低。但同时也要看到，续断种子方组和左卡尼汀组的干预有效提升了这两项指标，且前者提升更为显著。附睾管内多见不成熟和畸形精子，数量和活力均低于空白组，与国外研究结果一致。左卡尼汀组结果表明其能改善氧化损伤，提升精子数量和活力。

通过临床总结和实验研究探究，课题组将男性不育症的病机归结为“营气不从，肾精亏虚”，实验中使用的续断种子方原名“补肾健脾益气种子煎方”，源自《医学正印》，强调精神气血由脾土化生，具有快速生精和助阳的功效，建议适度节制以促进生育。

本项研究成功验证了续断种子方应用诱导的弱精子症模型实验中，大鼠附睾结构明显改善，附睾微环境恢复，可保证精子的正常发育和成熟，但其保护精子的内在作用机制有待进一步探讨。

基金项目

国家自然科学基金(82460929)；中央引导地方科技发展资金(ZY20198013)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。