基于网络药理学探讨熟地黄治疗溃疡性结肠炎的作用机制

Discussion on the Mechanism of Action of Radix Rehmanniae Praeparata in Treating Ulcerative Colitis Using Network Pharmacology

摘要: 目的：利用网络药理学研究策略，结合中药对机体代谢的调控作用，探讨熟地黄防治溃疡性结肠炎的直接作用及间接调控机制。方法：通过网络数据库，筛选得到熟地黄中活性成分可直接作用的病理靶点，构建“活性成分–蛋白靶点–病理机制”直接交互网络；同时，从中药影响内源性物质代谢的角度，筛选出熟地黄参与代谢调控的通路及相关代谢酶。利用分子对接模拟实验，验证所筛选关键靶蛋白与熟地黄中有效成分的结合活性。结果：从数据库中共筛选得到熟地黄中20个潜在活性成分和25个核心靶点，主要涉及细胞表面离子通道等信号通路；分子对接及代谢通路富集分析显示，所筛选关键靶蛋白与熟地黄中有效成分具有良好的结合活性，熟地黄对脂质代谢具有调控作用，亦可作为防治溃疡性结肠炎的间接调控机制。结论：熟地黄防治溃疡性结肠炎有多成分、多靶点、多效性的作用特点，并可能通过调控机体代谢进而发挥防治功效。本研究为后续道地药材资源的开发、熟地黄防治溃疡性结肠炎的药效物质基础及作用机制研究提供了理论支撑。

Abstract: Objective: To explore the direct and indirect mechanisms of Radix Rehmanniae Praeparata (RRP) in preventing and treating ulcerative colitis by using the research strategy of network pharmacology, and by combining with the metabolic regulation of traditional Chinese medicines. Methods: Through the network database, we screened the pathological targets of the active ingredients in RRP, and constructed a direct interaction network of “active ingredient-protein target-pathological mechanism”. Meanwhile, we analyzed its metabolic regulation by evaluating the effects on endogenous substance metabolism. Additionally, endogenous substances and related metabolic enzymes involved in its regulatory effects were screened. The molecular docking simulation experiment was used to verify the binding activities of the screened target proteins with the active ingredients. Results: A total of 20 potential active ingredients and 25 core targets were identified from the database, which were mainly involved in cell surface ion channels and other signaling pathways; the molecular docking results and metabolic pathway enrichment analyses showed that the screened key target proteins had good binding activities with the active ingredients in RRP, and RRP had a regulatory effect on lipid metabolism. It can also be used as an indirect regulatory mechanism to prevent ulcerative colitis. Conclusion: The prevention and treatment of ulcerative colitis by RRP is characterized by multi-components, multi-targets, wide range of efficacy outputs, and it may exert preventive and curative effects through the modulation of organismal metabolism. The present study provides theoretical support for the development of local medicinal resources and the study of the pharmacological basis and mechanism of action of RRP in the prevention and treatment of ulcerative colitis.

1. 引言

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病，以直肠和结肠黏膜持续、弥漫性炎症改变为特征[1]。UC具有病程长、复发率高、治疗费用大等特点，随着对UC发病机制的研究不断深入，医学界愈发明确其是一种由多因素引发的疾病，涉及遗传、免疫、肠道菌群和环境等方面[2]-[4]。临床中，UC治疗旨在控发作、缓症状、减复发，常用氨基水杨酸类、皮质类固醇、免疫抑制剂等。然而上述药物不良反应多，整体疗效欠佳[5] [6]。中医药有多靶点、多环节防治优势，具有调节免疫、改善肠道微生态、修复肠黏膜等功效，且不良反应少，患者耐受性好[7]-[9]。鉴于此，中医药防治UC必然成为临床共同关注和研究的重点，有望带来更优治疗方案。

地黄，为玄参科地黄属植物Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根[10]。其药用历史源远流长，最早在《神农本草经》中便有记载，并被列为“上品”，堪称补虚损之良药。从性味归经来看，地黄性寒，味甘苦，归心、肝、肾经，具备滋阴补肾、填精益髓之功效[11]。在临床应用中，对于肝肾阴虚以及血虚等各类病症，地黄往往能发挥显著疗效。

UC在中医理论体系里，隶属于“痢疾”“肠风”“洞泄”等范畴[12]。明代医家李中梓在《医宗必读·痢疾》中明确指出：“痢之为证，多本脾肾。在脾者病浅，在肾者病深，未有久痢而肾不损者”。由此可见，本病的基本病机为脾肾阳虚，同时兼夹气滞血瘀、痰湿阻滞、湿热蕴结等标实证候，呈现出本虚表实的特征[13]。目前，以地黄为代表的滋补类中药已广泛应用于临床，为缓解UC病情提供了新的思路与方法[14] [15]。

2. 材料与方法

2.1. 网络数据库及软件

TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/molecule.php/)；PUBCHEM (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；SWISSTARGETPREDICTION (https://www.swisstargetprediction.ch)；DISGENET (https://disgenet.com)；GENECARDS (https://www.genecard.org)；UniProt (http://www.uniprot.org/)；STRING (https://cn.string-db.org/)；微生信–在线生物信息学分析、可视化云平台(https://www.bioinformatics.com.cn)；Cytoscape 3.10.2、AutoDock Vina 1.5.7、pymol等软件。

2.2. 熟地黄活性成分及作用靶点筛选

通过中药系统药理学数据库TCMSP、PUBCHEM，以“熟地黄”为关键检索词，获取熟地黄所含化学成分，以五倍率法则(Lipinski’s rule)为标准[16]，设置类药性参数，以口服生物利用度(OB) ≥ 30%、类药相似度(DL) ≥ 0.18为条件遴选熟地黄的主要活性成分[17]。随后，借助TCMSP数据库，检索并汇总得到潜在活性成分的作用靶点。

2.3. 溃疡性结肠炎病理靶点的筛选

利用DISGENET、GENECARDS数据库，以“ulcerative colitis”为关键词，检索并汇总得到与UC相关的靶点基因数据。为进一步确保数据准确性及统一性，通过查询UniProt数据库，将以上所得靶点均校正为人类蛋白UniProt ID。将数据库中获取的基因列表进行合并、整合、去重等处理，最终获得UC关联靶标集合。

2.4. “活性成分–蛋白靶点–病理机制”直接交互网络的构建与分析

将熟地黄活性成分作用靶基因与UC疾病基因进行匹配，得到熟地黄活性成分防治UC的潜在作用靶点，建立“药物–活性成分–疾病–靶点”网络图。将熟地黄活性成分及其相应靶点导入Cytoscope version 3.10.2软件，构建“活性成分–蛋白靶点–病理机制”交互网络并进行拓扑分析。以节点(Node)间的拓扑参数“连接度(Degree)”、“近中心性(Closeness Centrality, CC)”和“介中心性(Betweenness Centrality, BC)”为指标，进一步筛选核心靶点，并利用STRING将物种设定为“Human”，分析建立核心靶点蛋白的相互作用网络。

2.5. 核心靶点的富集分析

借助微生信–在线生物信息学分析、可视化云平台，将筛选所得靶点映射至GO (Gene Ontology)和 KEGG数据库，筛选差异显著的生物过程，识别主要靶点通路，并以柱状图，气泡图进行可视化呈现。从分子功能(Molecular Function, MF)、生物学过程(Biological Process, BP)、细胞位点(Cellular Component, CC)及KEGG代谢通路四个维度深入探讨熟地黄防治UC的直接作用机制。

2.6. 熟地黄对内源性代谢通路的影响

基于KEGG数据库，系统检索并整合熟地黄中的活性成分对机体内源性代谢通路的干预信息。通过对比分析UC病理进程中异常激活的代谢通路，结合内源性代谢物的生物学功能，深度解析熟地黄活性成分与代谢通路关键节点的相互作用关系。从代谢角度揭示熟地黄通过调节内源性物质代谢网络发挥防治功效的间接药效机制。

2.7. 分子对接模拟验证

基于RCSB PDB数据库检索与脂质代谢通路密切相关的核心靶点蛋白三维晶体结构，同步从TCMSP数据库筛选并下载熟地黄中关键活性成分的化学结构。利用Autodock1.5.7分子对接软件，对靶点蛋白进行加氢、去水及电荷分配等预处理，对活性成分进行构象优化，精确计算二者间的最低结合能。通过PyMOL等可视化工具直观呈现氢键、疏水作用等分子间相互作用模式，从分子层面探讨熟地黄活性成分对脂质代谢水平的潜在调控机制，以此验证熟地黄活性成分与脂质代谢靶点的结合活性，为熟地黄通过调控脂质代谢防治UC提供直接证据。

3. 结果

3.1. 药物靶点及疾病靶点的筛选

依照1.2项下方法，分别对熟地黄中的潜在活性成分及其作用靶点进行筛选。从熟地黄中共筛选得到20种活性成分，包括地黄苷、梓醇等代表性成分，共关联到341个靶点。

采用1.3项下方法，于疾病数据库中进行全面检索，共计获取5460个UC相关靶点。随后，将熟地黄的靶点与UC疾病靶点进行详细比对(图1)，经比对分析，发现重叠靶点达143个，可作为熟地黄直接发挥防治功效的潜在作用靶点。

Figure 1. Venn diagram of drug targets and disease targets

图1. 药物靶点与疾病靶点韦恩图

3.2. “活性成分–蛋白靶点–病理机制”直接交互网络的建立

为深入探究熟地黄活性成分与UC相关蛋白靶点的相互作用机制，将筛选所得的熟地黄活性成分(以PubChem CID标识)及UC相关靶点(以UniProt Gene Names标注)，导入Cytoscape软件进行可视化分析，构建“活性成分–蛋白靶点–病理机制”直接交互网络(图2)。在该网络中，黄色节点代表熟地黄活性成分，粉色节点代表UC相关靶点。通过“Degree”参数量化各节点间连接强度，分析发现每个UC相关靶点均至少受熟地黄中两种活性成分调控，直观呈现中药“多成分、多靶点、多效性”的作用特性。

Figure 2. Interaction network of active ingredients, targets and ulcerative colitis

图2. “活性成分–蛋白靶点–溃疡性结肠炎”直接交互网络

为精准筛选熟地黄防治UC的核心蛋白靶点，对交互网络开展拓扑学分析，获得Degree、介数中心性(BC)和聚类系数(CC)三个关键拓扑参数，其统计中位数分别为15.09、175.39和0.017。基于Degree值大于其中位数的2倍、BC值和CC值大于各自中位数的筛选标准[18]，筛选确定25个核心蛋白靶点(表1)，为后续机制研究提供关键靶标。

Table 1. The core targets of Rehmannia glutinosa for ulcerative colitis

表1. 熟地黄防治溃疡性结肠炎核心靶点

序号	靶点基因	蛋白名称	Degree	BC	CC	UniProt ID
1	PPARG	Peroxisome proliferator-activated receptor gamma	63	2316.59	0.0046	P37231
2	STAT3	Signal transducer and activator of transcription 3	59	1521.18	0.0044	P40763
3	CASP3	Caspase-3	56	1313.16	0.0044	P42574
4	PTGS2	Prostaglandin-endoperoxide synthase 2	54	1700.08	0.0044	P35354
5	BCL2	Apoptosis regulator Bcl-2	51	854.43	0.0043	P10415
6	HSP90A1	Heat shock protein 90 alpha family class A member 1	50	788.77	0.0042	P07900
7	ESR1	Estrogen receptor 1	49	992.78	0.0043	P03372
8	MDM2	Mouse double minute 2 homolog	38	193.95	0.0039	Q00987
9	MAPK1	Mitogen-activated protein kinase 1	37	293.09	0.0039	P28482
10	PPARA	Peroxisome proliferator-activated receptor alpha	37	785.34	0.0040	Q07869
11	GSK3B	Glycogen synthase kinase-3 beta	63	250.18	0.0040	P49841

3.3. 核心靶点的GO富集分析

利用DAVID数据库对核心蛋白靶点基因进行GO富集分析，以错误发现率(FDR)校正后P < 0.04为筛选阈值，结果如图3所示。GO功能注释显示，熟地黄防治UC的核心靶点在细胞组分(CC)层面主要富集于细胞质(Cytosol)、染色质(Chromatin)和细胞核(Nucleus)；分子功能(MF)层面主要涉及外来刺激响应(Response to xenobiotic stimulus)、炎症反应调控(Inflammatory response)及转录因子活性等；生物学过程(BP)层面则显著富集于PPAR信号通路相关调控(RNA polymerase II transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding)、DNA序列特异性结合(sequence-specific DNA binding)和细胞质锌离子结合(zinc ion binding)等生物学过程。

Figure 3. Geno ontology enrichment analysis of core targets

图3. 核心靶点GO富集分析

3.4. 核心靶点的KEGG富集分析

利用微生信–在线生物信息学分析、可视化云平台对熟地黄防治UC的核心靶点进行KEGG富集分析(图4)。结果显示，熟地黄防治UC的潜在作用通路多样。其中，PPAR信号通路(hsa03320)相关性最高，涉及PPARG、BCL2、STAT3等核心靶点。进一步观察发现，脂质代谢(Lipid metabolismm)作为重要的生理过程，与PPAR信号通路的激活及炎症反应调控密切相关[19] [20]。

Figure 4. KEGG enrichment analysis of core targets

图4. 核心靶点KEGG富集分析

3.5. 分子对接模拟验证

在KEGG富集分析的基础上，为进一步明确熟地黄活性成分与UC相关靶点的作用关系，本研究选取熟地黄中地黄苷A (Rehmannioside A)、棕榈油酸甲酯(METHYL PALMITOLEATE)及梓醇(Catalpol)等代表性活性成分作为配体分子，针对直接作用相关靶点及脂质代谢核心靶点开展分子对接研究。运用Autodock Vina 1.5.7软件计算靶点蛋白与活性分子间的最低结合能(表2、表3)，结果显示，所有配体–靶点对的最低结合能均低于−4.6 kcal/mol，提示熟地黄活性成分与直接作用相关靶点及脂质代谢靶点之间均具有较强的结合活性，靶点蛋白与活性分子之间能够通过氢键等分子间作用力形成稳定构象。并且，梓醇与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)这一脂质代谢核心靶点的结合能最低，可达−8.4 kcal/mol。通过对分子对接结果进行可视化分析(图5)发现，梓醇通过G137、G203、T140等多个氨基酸残基与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3形成6个氢键，进一步证实了二者结合模式的稳定性。

Table 2. The molecular docking binding energy between the main active components of Radix Rehmanniae Praeparata and its directly-acting core target proteins (units: kcal/mol)

表2. 熟地黄主要活性成分与直接作用核心靶点分子对接结合能(单位：kcal/mol)

活性成分名称	蛋白靶点名称
	PPARG过氧化物酶体增殖物激活受体	信号转导和 转录激活因子3	细胞凋亡调节 蛋白Bcl-2	半胱氨酸天冬氨酸 蛋白酶-3
地黄苷A	−7.5	−6.3	−6.0	−7.6
棕榈油酸甲酯	−7.4	−6.9	−6.0	−7.9
梓醇	−8.3	−5.3	−6.2	−8.4
豆甾醇	−5.9	−4.6	−5.1	−6.6
环稀醚萜	−6.2	−5.2	−4.9	−5.3

Table 3. The molecular docking binding energy between the main active components of Radix Rehmanniae Praeparata and the targets related to lipids metabolism (units: kcal/mol)

表3. 熟地黄主要活性成分与脂质代谢相关靶点分子对接结合能(单位：kcal/mol)

活性成分名称	蛋白靶点名称
	3-羟基丁酸 脱氢酶	乙酰乙酸 脱羧酶	乙酰辅酶A C-乙酰基转移酶	羟甲基谷氨酸辅酶A裂解酶	羟甲基戊二酰辅酶A合酶	钠–葡萄糖协同转运蛋白2
地黄苷A	−9.2	−7.4	−6.2	−8.6	−7.6	−5.9
棕榈油酸甲酯	−8.2	−7.2	−8.3	−6.8	−7.5	−7.6
梓醇	−5.1	−5.0	−8.2	−5.8	−7.2	−6.9
豆甾醇	−5.7	−5.5	−5.9	−6.0	−5.2	−5.6
环稀醚萜	−5.3	−4.7	−6.0	−4.6	−4.6	−5.4

Figure 5. Molecular docking diagram of the active components of Radix Rehmanniae Praeparata and the related targets of lipids metabolism: Catalpol and CASP3 (−8.4 kcal/mol)

图5. 熟地黄活性成分和脂质代谢相关靶点的分子对接图：梓醇与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (−8.4 kcal/mol)

4. 讨论

中药复方“多成分、多靶点、多途径协同”的作用模式，使其在复杂疾病治疗中展现独特优势。其活性成分不仅能通过直接靶向疾病相关蛋白发挥治疗效应，还可通过调节内源性代谢网络实现间接干预。网络药理学通过构建疾病相关分子网络揭示病理机制，而代谢通路网络则聚焦内源性代谢物与代谢酶的功能关联。二者的整合分析，为中药活性成分挖掘、药效机制解析及组方优化提供了系统化研究策略。

目前，熟地黄在UC等疾病治疗中的网络药理学研究已取得一定进展。然而，UC的发病机制涉及遗传、免疫、肠道菌群与环境等多因素的复杂交互作用，且中药通过调控机体代谢发挥防治作用的潜在机制尚未完全阐明[21] [22]。本研究基于网络药理学与代谢通路整合分析，从直接作用与间接调控两个层面系统探究熟地黄防治UC的分子机制，以期深化对其药效机制的理解并拓展潜在靶点。

本研究通过网络药理学方法，构建“活性成分–靶点–疾病”交互网络，筛选出熟地黄中20个潜在活性成分(如地黄苷、梓醇等)及其关联的341个靶点，其中143个靶点与UC病理机制重叠。经拓扑分析进一步明确25个核心靶点，这些靶点在细胞内主要分布于细胞质、染色质及细胞核，功能上富集于离子通道与激酶活性相关的分子过程。该结果揭示了熟地黄通过多维度调控细胞内信号转导网络发挥抗UC作用的分子机制。KEGG通路富集分析显示，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路显著富集，提示该通路可能是熟地黄调控UC炎症与代谢失衡的关键路径。结合分子对接结果，地黄苷A、棕榈油酸甲酯等成分与PPARG的结合能均低于−5 kcal/mol (表2)，具有较强结合活性。PPAR信号通路已被证实在能量代谢和炎症调节中起关键作用[23] [24]，通过影响脂质代谢等途径，调节炎症因子表达[25]-[27]，从而有效缓解肠道炎症，最终实现对UC的防治效果，印证了熟地黄通过PPAR通路直接干预UC的分子机制。

内源性代谢物作为机体生理病理状态的关键调控因子，在药物作用机制中发挥重要作用[28] [29]。脂质在肝脏线粒体中进行β氧化，在能量供应、细胞代谢调节以及炎症微环境塑造等方面均发挥作用[30]。本研究发现，熟地黄可通过调节脂质代谢途径中的关键代谢酶活性，调控机体脂质代谢。分子对接结果表明，熟地黄代表性成分地黄苷A与3-羟基丁酸脱氢酶(脂质代谢关键酶)具有较强结合活性(结合能9.2 kcal/mol)，提示熟地黄可能通过调节脂质代谢，减轻氧化应激与炎症反应，进而发挥UC治疗作用。

5. 结论

综上所述，本研究证实熟地黄通过多成分协同作用，从直接靶向关键蛋白(如PPARG)调控炎症代谢通路，及间接调节脂质代谢两个维度，实现对UC的综合干预。从直接作用来看，其众多活性成分作用于多个关键靶点，通过调控如PPAR信号通路，参与炎症免疫调节和能量代谢过程，进而缓解肠道炎症。从间接调控方面，熟地黄可通过调节脂肪酸降解等代谢途径中的代谢酶，调控机体脂质水平，降低氧化应激，这为其防治溃疡性结肠炎提供了新的潜在机制。本研究初步揭示了熟地黄在防治溃疡性结肠炎方面的潜在价值，为后续道地药材资源的开发、深入探究熟地黄防治溃疡性结肠炎的药效物质基础及作用机制研究提供了理论依据。然而，本研究仅基于网络药理学和分子对接模拟，后续仍需通过体内外实验进一步验证这些机制，以推动熟地黄在溃疡性结肠炎治疗中的临床应用。

基金项目

河南省自然科学基金资助项目(252300421139)，河南省大学生创新创业训练计划项目(202410472018)。

NOTES

^*通讯作者。