1. 引言
缺血性卒中，又称脑梗死，是脑动脉血流被阻断所致，临床上主要表现神经功能障碍[1]，中风已成为全球第二大死亡原因，缺血性卒中患者约占中风患者80%，本病临床治疗原则是保护和恢复受损神经细胞[2]。目前中药治疗本病已备受学者青睐。
淫羊藿是脑缺血再灌注动物模型的神经保护剂，即具有神经保护作用，Wu CT等实验研究证实：在急性缺血性卒中小鼠模型中，淫羊藿治疗能减少皮层和海马区细胞凋亡和衰老。这些发现表明，淫羊藿可能具有改善急性缺血性卒中的治疗潜力[3]。但相关分子机制研究却较少，因此本研究采用网络药理学探讨淫羊藿治疗缺血性脑卒中的分子机制，形成整体描述，为淫羊藿治疗缺血性脑卒中提供更多的研究参考。
2. 材料与方法
2.1. 淫羊藿相关靶点的筛选
运用中药系统药理学数据库设置生物利用度(OB)、类药性(DL)，并检索淫羊藿相关靶点。
2.2. 缺血性脑卒中相关基因靶点的筛选
以“Ischemic Stroke”为搜索关键词，在OMIM、GeneCards、PharmGkb、TTD、Drugbank数据库检索，将全部数据库靶标融合，得到本疾病相关靶标。
2.3. PPI网络构建
利用R软件，获得淫羊藿靶点与缺血性脑卒中靶点的并集，得到相同靶点，再在STRING数据库检索，获得所有作用靶点的蛋白质相互作用网络，最后传入Cytoscape 3.8.0软件，分析出PPI网络。
2.4. GO富集和KEGG分析
使用R软件可视化分析淫羊藿靶点蛋白在基因功能和信号通路中作用。
2.5. 分子对接
将缺血性脑卒中靶蛋白与淫羊藿进行分子对接，将目标蛋白导入PMV1.5.6，再使用autodock vina分子对接可视化得出结果。
3. 结果
3.1. 淫羊藿活性成分获得与缺血性脑卒中的靶点获得
在TCMSP网站上根据文献说明设置生物利用度、类药性数值[4]，最终得到淫羊藿活性成分如下：24-epicampesterol、poriferast-5-en-3beta-ol、DFV、Chryseriol、8-Isopentenyl-kaempferol、sitosterol、kaempferol、olivil、Anhydroicaritin、C-Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)、Yinyanghuo A、Yinyanghuo C、Yinyanghuo E、6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno[3,4-h]isoquinolin-2-ium、8-(3-methylbut-2-eny1)-2-pheny1-chromone、Anhydroicaritin-3-O-alpha-L-rhamnoside、1,2-bis(4-hydroxy-3-methoxypheny1)propan-1,3-diol、Icariin、IcarisideA7、luteolin、Magnograndiolide、quercetin。最终取得缺血性卒中疾病靶点1845个、淫羊藿靶点511个，将结果合并并去除重复基因，得出缺血性脑卒中与淫羊藿苷共有125个共同靶点(即交集基因)。
3.2. 构建淫羊藿与缺血性脑卒中疾病靶点图
运用Cytoscape3.8.0软件分析，建立淫羊藿抗缺血性脑卒中的交互网络，如图1所示，构建药物–靶点网络图，蓝色表示共有靶点，红色表示淫羊藿，此图能清晰展示淫羊藿对应靶点调控。表示淫羊藿通过多靶点、多成分治疗缺血性脑卒中。
Figure 1. The target map between epimedium and ischemic stroke
图1. 淫羊藿与缺血性脑卒中靶点图
3.3. PPI网络构建
利用Cytoscape 3.8.0软件进行可视化处理(如图2所示)，经CytoNCA筛选，获得PPI网络图，PPI图中蛋白与蛋白作用程度取决于节点和颜色，两者呈正相关，最终得出Degree值前8个核心基因(如表1所示)：TP53 (66)、IL6 (42)、MAPK1 (34)、CASP3 (36)、TNF (44)、ESR1 (34)、BCL2 (36)、AKT1 (56)，表明淫羊藿可能通过这些蛋白以达到治疗缺血性脑卒中的作用(如表1、图3所示)。
Table 1. The most core network of common targets between Epimedium and ischemic stroke
表1. 淫羊藿与缺血性脑卒中共同靶点最核心网络
name |
Betweenness |
Closeness |
Degree |
Eigenvector |
LAC |
Network |
TP53 |
2374.65 |
0.1634 |
66 |
0.32 |
12.24 |
41.44 |
IL6 |
1060.94 |
0.1585 |
42 |
0.18 |
13.52 |
26.52 |
MAPK1 |
689.77 |
0.1613 |
34 |
0.21 |
10.59 |
15.65 |
CASP3 |
1108.94 |
0.1606 |
36 |
0.19 |
10.67 |
19.27 |
TNF |
1411.46 |
0.1601 |
44 |
0.20 |
13.45 |
27.73 |
ESR1 |
571.53 |
0.1587 |
34 |
0.21 |
12.00 |
18.76 |
BCL2 |
505.55 |
0.1554 |
36 |
0.21 |
11.78 |
19.74 |
AKT1 |
1567.31 |
0.1637 |
56 |
0.29 |
11.57 |
30.29 |
Figure 2. PPI network of common targets between Epimedium and ischemic stroke
图2. 淫羊藿与缺血性脑卒中共同靶点PPI网络
Figure 3. Core network of the same target between epimedium and ischemic stroke
图3. 淫羊藿与缺血性脑卒中相同靶点核心网络
3.4. GO富集分析和KEGG分析
通过GO富集分析，如图4、表2所示，经软件加工获得2303个生物过程(BP)内容、69个细胞组分(CC)内容、194个分子功能(MF)内容，并取P值靠前的前10名绘成柱状图，本研究可得出：BP一般与对辐射等反应相关；CC主要和细胞质囊腔等有联系；MF主要涵盖整合素结合、蛋白酶绑定等。
Table 2. Results of GO enrichment analysis on the core target of epimedium treating ischemic stroke (the first 5 items of each)
表2. 淫羊藿作用缺血性脑卒中的核心靶点GO富集分析结果(各前5条)
GO-ID |
条目名称 |
类别 |
基因比 |
P值 |
基因 |
GO:0002237 |
对细菌分子反应 |
BP |
38/125 |
6.17E−35 |
PTGS2/MAOB/NOS2/MAPK14/RELA/AKT1 |
GO:0032496 |
对脂多糖反应 |
BP |
37/125 |
1.66E−34 |
PTGS2/MAOB/NOS2/MAPK14/RELA/AKT1 |
GO:0009410 |
对生物刺激反应 |
BP |
39/125 |
3.43E−33 |
PTGS2/HSP90AA1/MAOB/SLC6A4/NOS2/KCNH2 |
GO:0000302 |
对活性氧反应 |
BP |
28/125 |
2.92E−29 |
RELA/AKT1/BCL2/CASP3/MAPK8/STAT1 |
GO:0006979 |
对氧化应激反应 |
BP |
34/125 |
2.05E−28 |
PTGS1/PTGS2/RELA/AKT1/BCL2/CASP3 |
GO:0045121 |
膜筏 |
CC |
18/125 |
2.43E−13 |
PTGS2/SLC6A4/DPP4/SCN5A/KDR/TNF |
GO:0098857 |
膜微区 |
CC |
18/125 |
2.58E−13 |
PTGS2/SLC6A4/DPP4/SCN5A/KDR/TNF |
GO:0005901 |
小窝 |
CC |
8 /125 |
4.68E−08 |
PTGS2/SCN5A/SELE/INSR/SLC6A3/MAPK1 |
GO:0031983 |
囊腔 |
CC |
13/125 |
1.43E−07 |
HSP90AA1/MAPK14/ALOX5/GSTP1/SLPI/EGFR |
GO:0044853 |
质膜筏 |
CC |
8/125 |
5.72E−07 |
PTGS2/SCN5A/SELE/INSR/SLC6A3/MAPK1 |
GO:0140297 |
DNA结合转录因子结合 |
MF |
23/125 |
1.16E−13 |
ESR1/PPARG/MAPK14/GSK3B/RELA/BCL2 |
GO:0061629 |
RNA聚合酶2特异性DNA结合 |
MF |
18/125 |
1.67E−11 |
ESR1/PPARG/MAPK14/GSK3B/RELA/STAT1 |
GO:0005126 |
细胞因子受体结合 |
MF |
16/125 |
4.74E−11 |
TNF/CASP3/STAT1/IL10/IL6/IFNG |
GO:0044389 |
泛素样蛋白连接酶结合 |
MF |
17/125 |
6.42E−11 |
HSP90AA1/GSK3B/SCN5A/KCNH2/RELA/BCL2 |
GO:0031625 |
泛素蛋白连接酶结合 |
MF |
16/125 |
2.45E−10 |
HSP90AA1/GSK3B/SCN5A/KCNH2/RELA/BCL2 |
![]()
Figure 4. GO function of the target of the epimedium’s treatment on Ischemic Stroke
图4. 淫羊藿治疗缺血性脑卒中靶点的GO功能
Table 3. Potential associated pathways for KEGG enrichment analysis of intersection genes
表3. 交集基因KEGG富集分析潜在的相关通路
KEGG |
通路名称 |
P值 |
基因比 |
基因 |
hsa04933 |
AGE-RAGE信号通路 |
6.70E−30 |
28/121 |
MAPK14/RELA/AKT1/BCL2/BAX |
hsa05417 |
脂质与动脉粥样硬化 |
6.80E−30 |
36/121 |
HSP90AA1/PPARG/MAPK14/GSK3B |
hsa05418 |
流体剪切应力动脉粥样硬化 |
2.62E−28 |
30/121 |
HSP90AA1/MAPK14/KDR/RELA/AKT1 |
hsa04657 |
IL-17信号通路 |
4.08E−23 |
23/121 |
PTGS2/HSP90AA1/MAPK14/GSK3B |
hsa04668 |
TNF信号通路 |
2.09E−22 |
24/121 |
PTGS2/MAPK14/RELA/AKT1/TNF |
hsa05161 |
乙肝 |
2.68E−22 |
27/121 |
MAPK14/RELA/AKT1/BCL2/BAX |
hsa05215 |
前列腺癌 |
5.97E−20 |
21/121 |
HSP90AA1/GSK3B/RELA/AKT1/BCL2 |
hsa05163 |
人巨细胞病毒感染 |
1.50E−19 |
28/121 |
PTGS2/MAPK14/GSK3B/RELA/AKT1 |
hsa05160 |
丙肝 |
1.10E−17 |
23/121 |
GSK3B/RELA/AKT1/BAX/TNF |
hsa05145 |
弓形虫病 |
2.33E−17 |
20/121 |
NOS2/MAPK14/RELA/AKT1/BCL2 |
hsa04210 |
细胞凋亡 |
8.12E−17 |
21/121 |
RELA/AKT1/BCL2/BAX/TNF |
hsa05219 |
膀胱癌 |
1.07E−16 |
14/121 |
MMP1/EGFR/CCND1/CDKN1A/MMP2 |
Figure 5. KEGG analysis of the target of the epimedium’s treatment on ischemic stroke
图5. 淫羊藿治疗缺血性脑卒中靶点的KEGG分析
Figure 6. KEGG analysis of the target of the epimedium’s treatment on ischemic stroke
图6. 淫羊藿治疗缺血性脑卒中靶点的KEGG分析气泡图
如图5、图6、表3所示，通过KEGG富集分析，分析出主要的信号通路，其中AGE-RAGE、PI3K-AKT、TNF、IL-17、HIF-1等信号通路为淫羊藿治疗缺血性脑卒中主要通路。
3.5. 分子对接预测淫羊藿与核心靶点的结合能力
利用autodock vina软件，分子对接分析是为了探讨核心靶标与淫羊藿结合的可能性，结果表明，核心靶标与淫羊藿主要活性成分Yinyanghuo A有较好的结合能力。文献[4]表明配体与受体结合能小于−4.25 kcal/mol才有一定的结合活性，如图7所示，结果表明疾病关键靶点TP53与淫羊藿主要活性成分Yinyanghuo A发生较好的结合效应。
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Figure 7. Molecular docking visualization
图7. 分子对接可视化
4. 讨论
本病发病后可导致神经损伤症状，其一般治疗[5]包括：吸氧、体温处理、血压管理、血糖控制，本病对症治疗方法是通畅脑血循环，最常见的有溶栓、抗血小板、阻止血液凝集及脑保护等。淫羊藿具有保护中枢神经系统的作用 [7]，但其作用机制不太明确，Cheng-Tien Wu等[8]首次证明淫羊藿通过改善小鼠脑内神经细胞凋亡、ROS/RNS诱导的脂质过氧化、ECM积聚和EndMT相关纤维化来改善急性脑缺血再灌注损伤。Zheng等[1]研究发现：淫羊藿可减轻MCAO后的神经功能缺损、脑水肿和病理损伤，其能减少小胶质细胞活化和IL-1β表达，减轻再灌注引起的炎症损伤。在一项关于脑缺血再灌注动物实验研究中，淫羊藿可通过JAK2/STAT3/NF-κB通路抑制NF-κB激活，并对亚低温诱导的神经具有保护效果。且有文献[9]指出淫羊藿在体外模型中通过抗氧化活性、维持细胞Ca2+稳态来保护神经细胞。
本实验通过PPI网络图展示淫羊藿作用于缺血性脑卒中的靶点为：TP53 (66)、IL6 (42)、MAPK1 (34)、CASP3 (36)、TNF (44)、ESR1 (34)、BCL2 (36)、AKT1 (56)，最重要的靶点为TP53，TP53可抑制细胞内DNA损伤或基因组畸变，导致细胞周期、生长停滞，在突变时，病变组织中的变体TP53可能诱导肿瘤发生，导致人类肿瘤生长。大量证据表明[10]，激活TP53通过调节Wnt信号通路对神经损伤小鼠具有保护作用，同时，TP53为转录因子p53调节细胞凋亡的重要因子[11]，另外前三个重要靶点分别为AKT1、IL6、BCL2。AKT1激活可减轻组织的缺血性再灌注损伤[12]。Lin HY等[13]动物实验研究证实增强肾小管线粒体AKT1信号传导可缓解肾损伤症状，Lin HY等研究亦认为线粒体AKT1抑制程度与线粒体呼吸、氧化应激增加程度呈正比。再灌注后，线粒体AKT1的丰度增加，暗示激活的AKT1易位到线粒体中，其可通过调节氧化磷酸化复合物、提高氧化磷酸化效率、减少氧化磷酸化来保护细胞不受缺血再灌注损害。IL6为调节炎症的重要炎症因子[14]。Te Winkel JP等[15]研究表明，肠道缺血后腹腔内注射较低剂量的IL6可改善灌注、减少肠道损伤，但高剂量的IL6却无治愈效果，较高剂量的IL6能诱导炎症级联反应和急性期反应。BCL2是一种关键的抗凋亡蛋白，PI3K/AKT信号通路可调节BCL2，BCL2/BAX 比率增加和抑制细胞凋亡呈正比[16]。
通过GO富集分析结果显示，生物过程主要集中于对细菌分子反应、对炎症因子反应、对氧化应激反应等；分子功能主要与DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶2特异性DNA结合等有关；核心蛋白主要集中于膜筏、膜微区、小窝、囊腔、质膜筏等位置。KEGG结果表明，淫羊藿苷可介导AGE-RAGE、PI3K-AKT、TNF、IL-17、HIF-1等信号通路对缺血性脑卒中发挥治疗作用。IL-17信号通路可以在炎症反应中发挥作用，PI3K是细胞内重要的信号转导因子[17]。PI3K参与神经细胞的存活和分化，另文献[18]证实AKT可以缩小脑梗死的体积。Zheng等[18] [19]研究认为PI3K/AKT信号通路炎症和凋亡有联系，PI3K/AKT可促进缺血神经细胞的修复，在脑室内注射LY294002 (PI3K/AKT抑制剂)可阻断PA对脑缺血的神经保护，进而暗示PA可激活PI3K/AKT信号通路保护受损神经细胞[18]。Sun等[20]研究亦认为异橙皮素通过PI3K/AKT信号通路保护神经组织。激活PI3K/AKT通路还可减少氧化应激[19]。总之，PI3K/AKT通路可能是CIRI的治疗靶点[19]。基于GO富集分析、KEGG富集分析结果，淫羊藿干预缺血性脑卒中的过程可能与炎症、免疫等通路相关。
5. 结论
综上所述，本研究通过网络药理学的方法证实淫羊藿治疗缺血性脑卒中的理论依据，并分析出其治疗此病的重要信号通路，本研究展示了淫羊藿多靶点的作用特点，对其抗脑缺血的机制探讨具有重要意义，虽然本研究为其抗脑缺血作用机制提供理论依据，但是未开展分子动力学模拟研究，也没有通过更多的实验开展来验证其作用机制。
基金项目
省属高校科研平台团队项目(黔教技[2022]022号)；贵州省高等学校重点实验室(黔教技[2023]018号)；贵州中医药大学校级研究中心(贵中医ZX合字[2024]024号)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。