1. 引言
地贫又称海洋性贫血，是一种因珠蛋白基因缺失或突变而抑制珠蛋白链合成的遗传性溶血性贫血，多见于我国南方各省，是一种具有较大的危害性的遗传病[1] [2]。在临床上根据抑制的珠蛋白肽链类型不同，地中海贫血分为α型、β型、γ型和δ型，其中以α型地中海贫血和β型地中海贫血较常见[3] [4]。调查显示，我国南方地区，如云南、广东、广西、贵州等地，是地中海贫血的高发地区，特别是广西和广东地区，广西地区有20%左右的人群携带地中海贫血基因[5]，广东地区有10%左右的人群携带地中海贫血基因[6] [7]。在中国，地中海贫血的携带和发病具有很明显的地域特征，主要表现为南高北低的分布特点，不同地区的基因突变类型不同。为了解本地区地贫基因突变情况及各基因型的组成比例，本研究对2022年1月~2023年12月在我院生殖医学部门门诊及妇产科门诊对育龄人群地贫基因检测结果进行回顾性分析。
2. 地中海贫血的概况及分子机制
2.1. 地中海贫血的概况
地中海贫血症最早由美国Cooley于1925年报道，因其在地中海地区发现早期报告病例而得名。目前，我国约有30万名中重型地中海贫血患者，该病是一种遗传性疾病，在我国长江以南地区影响最大，发病率最高[8]。世界卫生组织报告指出，全球人口中携带α型地中海贫血基因或β型地中海贫血基因的比例约为1.7%，其中携带α型或β型或其他血红蛋白基因的孕妇约为2.6亿。β地贫基因携带者约为8000万~9000多万人，这对患者自身健康、心理及社会等方面均有显著影响。因此，地中海贫血的防控已成为地中海贫血流行国家和地区的一项重要公共卫生挑战。
2.2. 地中海贫血的分子机制
2.2.1. α-地中海贫血的分子机制
α-地中海贫血，源于α珠蛋白基因的突变或缺失导致α珠蛋白肽链的数量减少或缺失。α珠蛋白基因簇位于16号染色体末端，其基因排列顺序为5′-ζ-ψζ-ψα1-α2-α1-θ-3′，整个基因片段全长约30 kb。各染色体均含有2个α珠蛋白基因，按相邻2个α珠蛋白在同一染色体上的基因缺失或突变，将α-地中海贫血分为：α0地中海贫血和α + 地中海贫血[9]。α0-地贫是由于2个α-珠蛋白基因全部突变或缺失，α + -地贫是指1个α-珠蛋白基因发生点变或缺失[10]。根据α-珠蛋白基因突变或缺失的数量，将其分为静止型、标准型、中间型和重型地中海贫血4种。
2.2.2. β-地中海贫血的分子机制
β-地中海贫血，源于β珠蛋白基因发生点突变，从而导致β珠蛋白肽链的合成不足或缺失。β-珠蛋白基因簇位于11号染色体末端，每条染色体上含有1个β-珠蛋白基因，其基因排列顺序为5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′，整个基因片段全长约40 kb。临床上将其分为β0-地贫和β+-地贫两种，其中β0-地贫是由于β链突变导致无法合成；β+-地贫可以合成少量的β链，因为β珠蛋白基因的突变。
3. 研究对象与方法
3.1. 研究对象
选取2022年1月~2023年12月在我院生殖医学部门门诊和妇产科门诊开展地中海贫血基因筛查的孕前检查中夫妻及孕妇及其配偶共2734例为研究对象，平均年龄34.27 + 5.52 (20~58)岁。受检者均在采血前签署了《知情同意书》。
3.2. 试剂与仪器
地中海贫血核酸提取试剂和基因检测试剂盒(深圳亚能生物科技股份有限公司提供)；PCR扩增仪(杭州浪奇MG96+)、离心机、电泳仪、恒温浴箱、电炉、移液枪等。
3.3. 方法
3.3.1. 外周血标本采集及全血DNA提取
使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管，抽取受检者的外周血2 ml，轻轻颠倒混匀，放入4℃~8℃的冰箱中保存备用。本研究中全血DNA的提取流程严格按照亚能生物技术有限公司提供的核酸提取试剂说明书进行提取。
3.3.2. PCR扩增
分别取出缺失型α-地中海贫血PCR扩增反应液、非缺失型α-地中海贫血PCR扩增反应液、β-地中海贫血PCR扩增反应液，并做好标记，于5000 rpm离心10秒，然后分别加入4 uL，按25 uL反应体系进行以下扩增(图1)。
Figure 1. Amplification flowchart of 25 uL reaction system
图1. 25 uL反应体系扩增流程图
3.3.3. 缺失型α-地中海贫血PCR扩增产物凝胶电泳检测
取出PCR扩增产物5 uL，加入6×溴酚蓝上样缓冲液1 uL，经1.2%琼脂糖凝胶(内加适量核酸染料)进行电泳(90 V, 40 min)。电泳结束后，通过凝胶成像系统观察结果。
3.3.4. 非缺失型α和β-地中海贫血PCR扩增产物杂交
① 取15 ml离心管，放入标有样本号的膜条，加入A液5~6 ml；② 取相应样本编号的PCR扩增产物(16 uL)加到A液中并盖好管盖；③ 离心管沸水浴加10 min后取出；③ 放入杂交箱43℃杂交1.5 h以上(不超过4 h)；④ 取50 ml离心管加入B液40 ml，置于杂交箱或水浴箱预热至43℃，空白对照同步处理。
3.3.5. 非缺失型α和β-地中海贫血PCR扩增产物杂交后洗膜及显色
取出混合好的膜条，转移到离心管，离心管里，预热B液，43℃轻摇15 min。按A液：POD = 2000:1配制孵育液，温室摇床孵育30 min，弃去孵育液。A液温室摇洗2次，每次4 min。用C液室温洗膜1~2 min，同时配制显色液(显色液需新鲜配制)。将膜条浸泡于显色液中避光显色10 min后观察结果。
3.4. 结果判断
3.4.1. 缺失型α-地中海贫血PCR扩增产物凝胶电泳结果判断
根据缺失型α-地中海贫血PCR扩增产物凝胶电泳后通过成像系统读取电泳结果如下：
1) 电泳条带与基因型的对应关系如表1。
Table 1. Correspondence between electrophoretic bands and genotypes of alpha thalassemia with deletion type
表1. 缺失型α-地中海贫血电泳条带与基因型对应关系表
基因型 |
条带大小 |
-α3.7 |
2051 bp |
αα |
1826 bp |
-α4.2 |
1645 bp |
--SEA |
1306 bp |
2) 正常：检测样本只有一条1826 bp的正常条带。
3) 缺失杂合子：如果结果显示检测样品有两条带，一条为正常的1826 bp带，另一条为一定缺失型带，则结果为与此相对应的缺失型杂合子。
4) 缺失纯合子：若结果显示检测样本只有一条缺失型带，无正常带，则结果为此缺失型的纯合子。
5) 双重缺失杂合子：若结果显示检测样本有两个带，分别为两种缺失型，无正常带；则结果为这两种缺失型的双重杂合子。
3.4.2. 非缺失型α地中海贫血PCR扩增产物膜条显色结果判断
膜条上探针排列顺序如表2。
Table 2. Sequence of probe arrangement on membrane strips of non delegated alpha thalassemia
表2. 非缺失型α地中海贫血膜条上探针排列顺序表
QSN |
CSN |
WSN |
编号 αT |
QSM |
CSM |
WSM |
根据膜条上蓝斑显色的位置读取相应位置标注的基因型信息。
3.4.3. β-地中海贫血PCR扩增产物膜条显色结果判断
膜条上探针排列顺序如表3。
Table 3. Sequence of probe arrangement on β-thalassemia membrane strip
表3. β-地中海贫血膜条上探针排列顺序表
41~42N |
654N |
−28N |
71~72N |
17N |
βEN |
31N |
27/28M |
编号 β地贫 |
41~42M |
654M |
−28M |
71~72M |
17M |
βEM |
31M |
IVS-I-IM |
43M |
−32M |
−29M |
−30M |
14~15M |
CAPM |
IntM |
IVS-I-5M |
注：以上位点最后一个字母：N为正常，M为突变。
根据膜条上蓝斑显色的位置读取相应位置标注的基因型信息。
3.5. 统计学分析
统计学数据处理采用Excel软件和SPSS 26.0软件进行统计分析。
4. 结果
4.1. 地中海贫血基因突变阳性率
本次研究共对2734名育龄群众进行了检测，结果显示，共有433名育龄群众携带了地中海贫血突变基因，总检出率为15.84% (433/2734)；其中检测出α-地贫患者317例，检出率为11.59% (317/2734)；检测出β-地贫患者100例，检出率3.66% (100/2734)；α并发β-地贫16例，检出率0.59% (16/2734)。
4.2. α-地中海贫血基因型及分布情况
在检测出的433例存在地贫基因的样本中，α-地贫有317例，占73.21%，包括12种基因突变类型，其中缺陷型α-地贫基因类型以--SEA为主(占44.79%)，其次是α-3.7 (占27.13%)；非缺失型α-地贫突变基因型以αCSα为主(占6.94%)，其次为αWSα (占6.62%)，见表4。
Table 4. Distribution and composition ratio of genotypes of 317 cases of alpha thalassemia
表4. 317例α-地中海贫血基因型分布及其构成比
基因型 |
数量(n) |
构成比 |
--SEA/αα |
142 |
44.79 |
-α3.7/αα |
86 |
27.13 |
-α4.2/αα |
30 |
9.46 |
αα/αCSα |
22 |
6.94 |
αα/αWSα |
21 |
6.62 |
αα/αQSα |
7 |
2.21 |
-α3.7/-α3.7 |
3 |
0.95 |
--SEA/-α3.7 |
2 |
0.63 |
--SEA/αWSα |
1 |
0.32 |
-α3.7/-α4.2 |
1 |
0.32 |
-α3.7/αCSα |
1 |
0.32 |
-α4.2/αWSα |
1 |
0.32 |
4.3. β-地中海贫血基因型及分布情况
这项研究共检出100例携带β-地贫突变基因的样本，主要包括8种基因突变类型，其中在所有β-地贫突变类型中，基因突变比例最高的是CD41-42，达到41.00%，其次是CD17，达到24.00%，见表5。
Table 5. Distribution and composition ratio of genotypes of 100 cases of β-thalassemia
表5. 100例β-地中海贫血基因型分布及其构成比
基因型 |
数量(n) |
构成比 |
CD41-42 |
41 |
41.00 |
CD17 |
24 |
24.00 |
IVS-II-654 |
12 |
12.00 |
-28 |
7 |
7.00 |
βE |
6 |
6.00 |
CD71-72 |
5 |
5.00 |
-29 |
4 |
4.00 |
CAP |
1 |
1.00 |
4.4. α合并β-地中海贫血基因型及分布情况
α合并β-地中海贫血基因阳性标本有16例，包括9种复合突变类型，主要以--SEA/ααβCD17 (25.00%)、--SEA/ααβCD17 (18.75%)、--SEA/ααβ654 (12.50%)和-α3.7/ααβCD17 (12.50%) 4个基因突变类型较为常见，它们占所有α合并β-地中海贫血基因阳性患者的68.75%。见表6。
Table 6. Distribution and composition ratio of genotypes in 16 cases of alpha complex beta thalassemia
表6. 16例α复合β-地中海贫血基因型分布及其构成比
基因型 |
数量(n) |
构成比 |
--SEA/ααβCD17 |
4 |
25.00 |
--SEA/ααβCD41-42 |
3 |
18.75 |
--SEA/ααβIVS-II-654 |
2 |
12.50 |
-α3.7/ααβCD17 |
2 |
12.50 |
--SEA/ααβE |
1 |
6.25 |
-α3.7/ααβCD41-42 |
1 |
6.25 |
-α3.7/ααβE |
1 |
6.25 |
-α4.2/ααβCD41-42 |
1 |
6.25 |
αα/αCSαβ-28 |
1 |
6.25 |
5. 讨论
地中海贫血简称“地贫”，是一种常染色体隐性遗传的单基因遗传病，广泛分布于非洲、东南亚地区和地中海沿岸等地区，主要是以α、β-地中海贫血较常见，具有一定的地域性分布特点，在我国主要是以两广地区发病率最高。根据临床特征α-地中海贫血可分为静止型、轻型、中间型和重型，β-地中海贫血分为轻型、中间型和重型，不同类型地中海贫血存在一定的个体差异。因此可通过加强对育龄夫妇进行地贫筛查来避免重型地贫患儿的出生，在减少家庭和社会的经济负担的同时有效提高出生人口的素质。目前对于地中海贫血的治疗还未有有效的治愈方法，因此产前诊断对于预防中重型地贫患儿出生显得尤为重要，特别是在地中海贫血高发区开展地中海贫血筛查及诊断对提高该地方人口素质及降低地贫中重型患儿的出生率具有重要意义。本研究初步分析了广西桂林地区地中海贫血的基因突变类型及发生频率，为本地区开展遗传咨询、婚育指导及产前诊断提供了有力的参考依据。
本研究对2734例育龄人群外周血地中海贫血基因检测结果显示，携带地中海贫血突变基因有433例(15.84%)，其中α-地中海贫血有317例(11.59%)，β-地中海贫血100例(3.66%)，α复合β-地中海贫血16例(0.59%)，提示本地区α-地中海贫血的携带率较β-地中海贫血高，且以α-地中海贫血为主，与Lai等[11]报道的α-地中海贫血检出率高于β-地中海贫血类似。α-地中海贫血共检出12种基因突变类型，以--SEA基因类型最为常见，占α-地中海贫血患者的44.79%，其次为-α3.7 (27.13%)、-α4.2/αα (9.46%)，这与百色、广东、云南和湖南报道的α-地中海贫血基因突变类型及分布一致[12] [13]。β-地中海贫血基因检测结果分析显示，共检测出8种基因突变类型，主要以CD41-42 (41.00%)、CD17 (24.00%)和IVS-II-654 (12.00%)为主，这与叶丽花等[5]报道的广西来宾、吴文钦等[14]报道的深圳龙华区人群分布情况相似。而与卢恒、杜伟等[12] [15]报道的广西百色及重庆地区有一定的差别，可见地中海贫血基因突变类型和频率存在一定的地域差异。α复合β-地中海贫血患者共有16例，共检测出9种复合突变类型。以--SEA复合CD17和CD41-42基因比较多，且复合型地中海贫血患者遗传给下一代的概率比单纯α或者β-地中海贫血患者更高。
由于中重型地中海贫血不但会影响患者个人的生活质量，还会给家庭和社会带来严重的负担，且目前对于地中海贫血的治疗还未有有效的治愈方法，因此预防中重型地贫患儿出生显得尤为重要。本研究初步分析了广西桂林地区地中海贫血的基因突变类型及发生频率，为本地区开展遗传咨询、婚育指导及产前诊断提供了有力的参考依据。
NOTES
*通讯作者。