1. 引言
流行病学统计，全球超过15%的人受到不孕不育的困扰，其中由于男性因素约为50% [1]。男性不育症(MI)指的是在不避孕的情况下，由于男性原因导致女方在1年内无法自然受孕。对于MI的病因，目前尚未完全阐明，因为男性的生育功能是人体五脏六腑和气血经络协调运转的结果。中医对MI的认识可以追溯至2000年前的《周易》一书。但是，MI在《内经》中第一次有了系统性旳阐释，即“天癸尽、精气竭”。《金匮要略》[2]记载：“男子脉浮弱而涩，为无子，精气清冷”。其描述肾阳不足导致的“精气清冷”是男性不育病机。在临床，MI表现为性交障碍、精索静脉曲张、男性附属性腺感染等16个方面，给患者的心理和生理带来巨大的痛苦，是影响生活幸福感的主要原因之一。目前的治疗方法主要是使用雌激素受体调节剂、抗生素、精子调节剂等，无法彻底解决男性问题[3]。
女贞子(Ligustrum lucidum Ait.)为菊科植物女贞的干燥成熟果实，性平，味甘，归肝经和肾经。《本草再新》记载，女贞子具有“养阴益肾，补气舒肝。治腰腿疼，通经和血”的功效。菟丝子(Cuscuta chinensis Lam.)为旋花科菟丝子属一年生寄生草本植物的干燥成熟种子。菟丝子归肝经、肾经、脾经，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻之功效[4]。临床主要应用于肾虚腰痛、阳痿遗精、尿频、宫冷不孕、便溏等肾阴阳虚症[5]。女贞子和菟丝子都具有滋补肝肾的作用，两种药物合用，可以增强滋补肝肾的作用，治疗肝肾阴虚所致的精气清冷，从而治疗MI。
网络药理学是一种新兴的研究方法，它结合了计算机技术、系统生物学和多项药理学等多学科的知识，以网络靶标为核心，探讨药物成分与疾病之间的分子网络关系[6]。通过构建中药复方成分–靶点–疾病的网络与分析，有助于揭示中药复方多组分多靶点的作用机制，并且这一方法已经广泛应用于中药领域[7]。本研究利用网络药理学方法，探究女贞子与菟丝子合用治疗MI的作用机制，为临床用药提供理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 中药有效成分筛选与靶点获取
通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，网址：http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(Drug-like, DL) ≥ 0.18”为条件，对女贞子、菟丝子两类药物的活性成分进行检索，整理出两类药物的潜在治疗靶点分布状况。在UniProt数据库(https://www.uniprot.org)进行基因注释，并得到相应靶点基因的名称。汇总来源TCMSP数据库的活性成分和靶点基因，从而建立起对应中药名称、活性成分与靶点基因的相关数据集。
2.2. 核心处方与疾病的交集靶点获取
应用GeneCards数据库GeneCards (https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)、NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)，选择“Male infertility”作为检索关键词对相关数据库进行检索，获得MI疾病的典型靶点，构建相关靶点数据库。导入到Venny2.1.0软件分析，得到相应的交集靶点。
2.3. “中药–活性成分–靶点基因”网络的构建与核心成分的分析
将收集的潜在治疗靶点数据与药物及成分对应，建立“Network”和“Type”文件，导入Cytoscape3.9.1 (https://cytoscape.org/)，构建“中药–活性成分–靶点基因”网络，并通过可视化的手段将疾病和药物有效成分作用关系展现出来。用CytoNCA插件进行网络的拓扑分析，测算出每个节点对应的度中心性(Degree centrality, DC)、中介中心性(Betweenness centrality, BC)和近中心性(Closeness centrality, CC)。如果测得某个节点数值越大且互作关系越多，该节点就可以被当做网络关键节点。
2.4. 蛋白互作网络的构建与核心靶点的分析
将药物与MI疾病交集靶点导入至STRING数据库(https://string-db.org/)，选择“人”(生物种类参数)进行蛋白互作(protein-proteininteraction, PPI)网络的构建。利用Cytoscape3.9.1软件进行网络拓扑分析，绘制图PPI网络图。最后，使用CytoNCA插件计算得到每个节点BC、CC、DC值和拓扑分析结果，选择节点值超出中位数的靶点当做研究的核心靶点。
2.5. GO富集分析与KEGG通路富集分析
将药物与疾病的相同靶点蛋白导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，通过微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)对KEGG和GO进行可视化，KEGG气泡图中通路为显著性最强的前20条，GO柱状图中功能为BP、CC、MF中显著性最强的前10条。
2.6. 分子对接验证
在Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中获取关键化学成分的3D结构并转化为pdb格式，随后导入autodock (https://autodock.scripps.edu/)软件对关键化学成分的3D结构进行加氢处理。通过RCSBPDB数据库(http://www.rcsb.org/)获取核心靶点的蛋白晶体结构，同时下载对应的3D结构。运用PyMOL2.5软件(https://pymol.org/)对蛋白3D结构进行去除水分子、配体、金属离子等处理后另存为pdb格式文件，运用Autodock软件加氢等处理后保存。最后将处理好的有效成分及蛋白文件导入AutodockTools软件(https://autodock.scripps.edu/)中，执行分子对接分析。
3. 研究结果
3.1. 药物有效化学成分
通过TCMSP数据库检索共收集活性成分19种，其中包括菟丝子的活性成分10种，女贞子的活性成分9，见表1。共得到预测靶点399个，包含菟丝子靶点210个，女贞子靶点189个。对活性成分的作用靶点进行汇总并删除重复项，得到药对的作用靶点219个。
Table 1. Active ingredients of Cuscuta chinensis-Ligustrum lucidum herbal pair
表1. 菟丝子–女贞子药对活性成分
序列号 |
成分名 |
OB (%) |
DL |
MOL001558 |
sesamin |
56.54 |
0.82 |
MOL000184 |
NSC63551 |
39.25 |
0.75 |
MOL000354 |
isorhamnetin |
49.6 |
0.3 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
MOL000422 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
MOL005043 |
campest-5-en-3beta-ol |
37.57 |
0.71 |
MOL005440 |
Isofucosterol |
43.77 |
0.75 |
MOL005944 |
matrine |
63.77 |
0.24 |
MOL006649 |
sophranol |
55.41 |
0.28 |
MOL000953 |
CLR |
37.87 |
0.67 |
MOL000098 |
quercetin |
46.43 |
0.27 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
MOL000422 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
MOL004576 |
taxifolin |
57.84 |
0.27 |
MOL005146 |
Lucidumoside D |
48.86 |
0.7 |
MOL005147 |
Lucidumoside D_qt |
54.4 |
0.47 |
MOL005169 |
(20S)-24-ene-3尾，20-diol-3-acetate |
40.22 |
0.81 |
MOL005190 |
eriodictyol |
71.79 |
0.24 |
MOL005195 |
syringaresinol diglucoside_qt |
83.12 |
0.79 |
MOL005209 |
Lucidusculine |
30.1 |
0.74 |
MOL005211 |
Olitoriside |
65.45 |
0.22 |
MOL005212 |
Olitoriside_qt |
103.23 |
0.77 |
MOL000006 |
luteolin |
36.16 |
0.24 |
MOL000098 |
quercetin |
46.43 |
0.27 |
3.2. 药物、疾病靶点及韦恩图
通过对疾病数据库检索与整理，共获得MI相关2811个药物作用靶标，其中GeneCards数据库617个、OMIM数据库12个、NCBI数据库345个。经过剔重后共得到疾病相关靶点6178个。分别把药物靶点、疾病靶点导入Venny在线平台后，将疾病与药物靶点进行比对，选取潜在作用靶标168个，靶点交集韦恩图详见图1。
Figure 1. Venn diagram screening for potential therapeutic targets
图1. 韦恩图筛选潜在治疗靶点
3.3. 药物–化学成分–靶点网络
利用Cytoscape构建“中药–成分–靶点–疾病”网络，将其作为CytoNCA插件的网络拓扑分析对象，计算得到DC、BC和CC的中位数值分别为3、24.703573和0.38445807。符合DC值大于中位数即DC > 3，同时BC > 24.703573，CC > 0.38445807的节点被认为是该网络的关键节点。按Degree值进行排序得到排名前5的成分分别是quercetin、luteolin、kaempferol、isorhamnetin、beta-sitosterol，见表2。利用关键节点活性成分等相关数据构建研究的“中药–成分–靶点”网络，深入了解成分与靶点关系，见图2，该网络有189个节点，560条边，网络中蓝色矩形节点代表疾病靶点，菱形绿色节点代表女贞子有效成分，菱形橙色节点代表菟丝子有效成分，每条边代表活性成分与疾病靶点间的互作关系。
Table 2. Core target information
表2. 核心靶点信息
Ingredients |
Degree |
Betweenness |
Closeness |
quercetin |
121 |
11482.63 |
0.606452 |
isorhamnetin |
53 |
4833.076 |
0.423423 |
luteolin |
49 |
2058.623 |
0.419643 |
kaempferol |
49 |
2129.185 |
0.417778 |
beta-sitosterol |
32 |
3829.144 |
0.38843 |
Figure 2. Network diagram of “Traditional Chinese Medicine-Components-Targets”
图2. “中药–成分–靶点”网络图
3.4. 核心基因互作网络
将MI疾病靶点基因与药物作用靶点的交集基因文件导入STRING数据库中，将“Homosapiens”作为研究物种，并将交互因子设定为0.4，游离靶点选择隐藏，其余参数默认。对所有靶点基因信息进行集中性分析和评估，得出蛋白互作网络，见图3，PPI网络图显示有167个节点和3954条边，节点越大，颜色越深，表示关联度越强。通过MCODE插件筛选到核心靶点并构建核心靶点子网络，见图4，结果显示核心靶点子网络得分最高的为53.851，得分最高的核心靶点网络图有68个节点和1804条边，其中有9个靶点的degree并列第一，分别为TP53、IL6、JUN、CASP3、AKT1、TNF、BCL2、MMP9、HIF1A，degree值为67，进行展示，选取作为核心基因进一步研究靶点间的功能，见图5、表3。
Figure 3. Diagram of the potential therapeutic target-protein interaction network 1
图3. 潜在治疗靶点蛋白互做网络图1
Figure 4. Diagram of the potential therapeutic target-protein interaction network 2
图4. 潜在治疗靶点蛋白互做网络图2
Figure 5. PPI network diagram
图5. PPI网络图
Table 3. Key target information
表3. 关键靶点信息
Name |
Description |
Degree |
TP53 |
肿瘤蛋白p53 (TumorProteinp53) |
67 |
IL6 |
白细胞介素6 (Interleukin6) |
67 |
JUN |
Jun原癌基因(JunProto-Oncogene) |
67 |
CASP3 |
半胱天冬酶3 (Caspase3) |
67 |
AKT1 |
AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1 (AKTSerine/ThreonineKinase1) |
67 |
TNF |
肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor) |
67 |
BCL2 |
B细胞淋巴瘤2 (B-celllymphoma2) |
67 |
MMP9 |
基质金属蛋白酶9 (MatrixMetalloproteinase9) |
67 |
HIF1A |
缺氧诱导因子1α亚单位(Hypoxia-InducibleFactor1AlphaSubunit) |
67 |
3.5. 富集分析结果
David数据库富集分析结果显示，KEGG通路富集分析得到174条信号通路，对前20条通路进行可视化，见图6。MI相关基因显著富集在多个与癌症相关的通路中，包括“癌症通路”、“前列腺癌”、“乙型肝炎”、“膀胱癌”、“小细胞肺癌”、“Epstein-Barr病毒感染”等。这些通路表明，MI与癌症的某些分子机制存在交叉，尤其是在细胞增殖、凋亡和信号转导方面。其他显著富集的通路还包括“细胞凋亡”、“IL-17信号通路”、“内分泌耐药性”、“肝炎C”、“人类细胞巨病毒感染”等。这些结果揭示了MI的基因和分子机制与癌症、免疫反应、代谢紊乱和病毒感染等多种生理过程相关，提示MI可能与这些疾病有一定的分子机制交集。GO富集分析得到1043个功能，其中生物过程(BP) 756条、细胞组分(CC) 96条、分子功能(MF) 191条，对三个类目显著性分别排名前10的功能进行可视化，见图7。GO分析表明，这些基因与基因表达调控、免疫反应和凋亡调控密切相关，特别是在“基因表达的正调控”、“对外源刺激的反应”、“RNA聚合酶II转录的正调控”和“DNA模板转录的正调控”等生物过程中表现突出。在分子功能方面，这些基因富集在“酶结合”、“蛋白质同源二聚体化活性”、“蛋白质结合”和“核受体活性”等功能中，表明它们参与重要的细胞信号传导和调控。
Figure 6. KEGG enrichment analysis of potential targets
图6. 潜在靶点KEGG富集分析
3.6. 分子对接
筛选后发现槲皮素(quercetin)、异鼠李素(isorhamnetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)为主要活性成分。将槲皮素、异鼠李素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇与具有显著的表达水平基因TP53、IL6、JUN、CASP3、AKT1等进行分子模拟对接。见图7。通常认为结合能小于−5 kcal/mol的情况下，配体与受体具有较好结合活性[8]，见图8~10，表4~8。
Figure 7. GO enrichment analysis of potential targets
图7. 潜在靶点GO富集分析
Figure 8. Thermal map of the binding energy of core targets and components
图8. 核心靶点和成分对接结合能热图
Figure 9. 2D result diagram of molecular docking
图9. 分子对接2D结果图
山柰酚与AKT1 异鼠李素与AKT1
Figure 10. 3D result diagram of molecular docking
图10. 分子对接3D结果图
Table 4. Molecular docking results 1
表4. 分子对接结果1
作用活性成分 |
作用活性靶点 |
结合能 |
槲皮素 |
TP53 |
−5.9 |
IL6 |
−8.7 |
JUN |
−7.1 |
CASP3 |
−7.6 |
AKT1 |
−9.1 |
Table 5. Molecular docking results 2
表5. 分子对接结果2
作用活性成分 |
作用活性靶点 |
结合能 |
异鼠李素 |
TP53 |
−6 |
IL6 |
−7.9 |
JUN |
−6.8 |
CASP3 |
−7.5 |
AKT1 |
−9 |
Table 6. Molecular docking results 3
表6. 分子对接结果3
作用活性成分 |
作用活性靶点 |
结合能 |
木犀草素 |
TP53 |
−6.2 |
IL6 |
−6.5 |
JUN |
−7.4 |
CASP3 |
−7.5 |
AKT1 |
−8.8 |
Table 7. Molecular docking results 4
表7. 分子对接结果4
作用活性成分 |
作用活性靶点 |
结合能 |
山柰酚 |
TP53 |
−6.1 |
IL6 |
−6.8 |
JUN |
−8.2 |
CASP3 |
−7.3 |
AKT1 |
−9 |
Table 8. Molecular docking results 5
表8. 分子对接结果5
作用活性成分 |
作用活性靶点 |
结合能 |
β-谷甾醇 |
TP53 |
−6.6 |
IL6 |
−6.7 |
JUN |
−7 |
CASP3 |
−7.9 |
AKT1 |
−6.1 |
4. 讨论
网络药理学与分子对接实验结合可以从整体角度对中药进行系统分析，构建多层次网络模型，预测中药的潜在活性成分、作用靶点和信号通路。并且，分子对接技术可以预测中药化合物与靶标蛋白的结合亲和力，为进一步的实验研究提供线索。本实验也存在不足之处，未来可以利用细胞实验和动物实验验证“女贞子–菟丝子”药对治疗MI的药效和机制。
女贞子的现代药理学研究表明，其在抗肿瘤、抗炎、抗骨质疏松症、抗帕金森、阳痿等领域具有明确的作用[9] [10]。菟丝子的现代药理学研究表明，其在抗氧化、抗衰老、保肝明目、增强性功能、降血糖、调节免疫等方面具有明确的作用[11]。研究表明，女贞子与菟丝子合用治疗卵泡质量低下[12]，说明其合用可以增强对性功能的作用。在本研究中，其可能发挥改善MI的作用也验证了这一点。
本研究最终筛选出9个“女贞子–菟丝子”治疗MI的核心靶点，分别是TP53、IL6、JUN、CASP3、AKT1、TNF、BCL2、MMP9。其中例如TP53蛋白，它是人体重要的肿瘤抑制蛋白，广泛地参与细胞的正常代谢，如生长抑制、细胞周期进程抑制等[13]。IL-6是一种炎性细胞因子，由巨噬细胞分泌，广泛地参与体内各种炎症反应，与正常人相比，MI患者精液中的IL-6等炎症因子的水平明显更高[14]。JUN [15]所对应的转录因子AP-1涉及广泛的生物反应，研究表明AP-1在睾丸中具有多种功能，表现出年龄特异性缺损，精子头部和鞭毛结构异常，不仅如此，AP-1在生殖细胞的凋亡中扮演着非常重要的角色。CASP3是一种蛋白酶，对人类生精上皮细胞进行凋亡调节，参与响应促凋亡信号而触发的级联反应，与精子发生受损、活力降低、DNA碎片化、免疫性MI和睾丸扭转等多种男科疾病存在密切关联[16]。BCL2主要是与细胞的凋亡有关[17]。MMP9参与突触可塑性的调节[18]，在神经元突起的结构性改变中起重要作用，参与大脑功能、心血管疾病、免疫反应等多个生理过程，是一个多功能的蛋白酶[19]。AKT1是调节细胞凋亡的主要AKT亚型。AKT1可以通过抑制Bim和Bad等凋亡相关蛋白，从而延长细胞存活[20]。TNF-α是机体较为常见的、有促炎反应作用的免疫调节剂。相关研究报道，白细胞精子症的患者体内的TNF-α水平要显著超出正常人，而且患者的精子数量要显著低于正常人[21]。因此，“女贞子–菟丝子”通过调节细胞凋亡、生殖系统的功能、神经系统的功能和免疫反应等发挥改善MI的作用。
除此之外，根据分子对接结果，“女贞子–菟丝子”的5个主要活性成分对上述核心靶点具有较强的对接活性。这5个成分分别是槲皮素(quercetin)、异鼠李素(isorhamnetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。据文献报道，isorhamnetin能够从内源性线粒体途径促进细胞凋亡，其通过抑制Bcl-2的表达，增加凋亡相关蛋白Bax的表达，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路[22]。Kaempferol通过促进Nrf2的表达，能够抑制内质网应激，增加抗氧化能力[23]。Luteolin通过增加Max ICP/MAP和AUC/MAP比值，来改善阴茎勃起功能障碍大鼠的勃起功能[24]。Quercetin通过抑制由TR2和TLR4介导的NF-κB通路，降低炎症相关蛋白COX、5-LOX、CRP和IL-6，从而减轻炎症反应[25]。
5. 结论
综上，本研究基于网络药理学与分子对接实验，初步探索了“女贞子–菟丝子”药对治疗MI的机制，为今后MI的治疗奠定基础。“女贞子–菟丝子”药对可能对MI具有改善作用，这一发现可能改善当前临床对MI的困境，即手术治疗、激素治疗、机械治疗、辅助生殖等男性带来的生理和心理的伤害。