1. 引言
小球藻(Chlorella vulgaris)是一类单细胞绿藻，隶属于绿藻门、绿藻纲、绿藻目、小球藻科。目前世界上已知有十几种小球藻，加上变异种有几百种[1]。小球藻富含多种蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、叶绿素及微量元素等，常作为水产动物饲料的重要植物蛋白来源和水产动物幼体的开口饵料，在促进动物生长与增强免疫力方面具有重要价值[2] [3]，因此被人们进行广泛培养。有研究表明，向草鱼饲料中添加1.0%或1.5%的小球藻可以显著提高其免疫力[4]。同时，在饲料中添加小球藻除了可以提高养殖动物的采食量和增重率，还能增强其消化酶含量[5] [6]。小球藻作为饲料中重要的蛋白质来源，具有较好的诱食效果且在动物体内易于消化吸收，在必需氨基酸的组成及含量方面，又与鱼粉极其相似，因此可作为营养强化剂提高饲料中的蛋白营养[7]。
维生素E又称为生育酚，是一种脂溶性维生素，对鱼类生长和繁殖起重要作用[8]。研究发现，如果长期摄入缺乏维生素E的饲料，会表现出鱼体消瘦、性腺发育迟缓等症状，严重则影响养殖生产[9]。例如，在鲻鱼幼苗饲料中添加适量维生素E能够有效促进其生长[10]。此外，维生素E能促进动物性腺发育成熟及胚胎发育，改善机体的繁殖机能[11]。
随着我国水产养殖行业的发展，养殖人员对小球藻这类高效饲料的营养需求量迅速增加，但如何促使培养的小球藻快速生长并增加其营养性能仍存在大量考究。
本试验通过向小球藻培养液中添加不同浓度维生素E，分析小球藻生物量与营养物质含量的变化，优化适宜小球藻生长及营养物质合成积累的维生素E浓度，为小球藻的高效生产提供数据支持。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
本试验所用的藻种来自天津农学院天津市水产生态及养殖重点实验室分离纯化后的海水小球藻。二甲基亚砜(DMSO)分析纯来自实验室药品柜。维生素E粉剂购自长信生物科技有限公司。
2.2. 微藻的扩培
本试验海水小球藻培养方法采用f/2培养基，盐度为30‰。将小球藻液与配置好的培养基按体积比1:4混合均匀后，放入恒温光照培养箱中进行培养，具体培养条件如下：温度为25℃，光照强度70 μmol/(m2∙s)，光照周期为12h:12h，相对湿度为38%。每天早中晚摇瓶各3~4次，防止小球藻贴壁或沉底。每天取样测定并记录相应藻密度及吸光度(OD)值，及时绘制生长曲线，当藻密度达到对数期时进行二次扩培。此次将藻液与培养基按体积比1:1进行扩培，在其生长曲线处于对数期时即可作为试验用藻，开始正式进行营养强化试验。
2.3. 试验设计
通过预实验确定无效应浓度后，将维生素E粉末分别精确称量后溶解于适量DMSO中，经充分搅拌与超声处理，制备成不同浓度的维生素E母液，并在超净工作台内将维生素E母液与已加入灭菌培养基藻液混合，其中试验组中加不同浓度母液，对照组加等量的DMSO，配制成维生素E浓度0 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L，接种密度6.5 × 106 cells/ml，接种总体积250 ml。置于恒温培养箱中培养，培养条件同1.2。以接种第一天为第0天，共培养8天。每日取样测定藻密度和吸光度，并在培养的第0、3、5、7天测定叶绿素含量、叶绿素荧光参数及维生素E含量。
2.4. 指标检测
每日从各培养基中取体系为5 ml藻液作为指标检测样本。
藻细胞生长测定：将样本藻液摇晃均匀，用移液枪吸取20 μL藻液于血球计数板，在显微镜下读数并记录。另取3 ml置于石英比色皿内，在波长为680 nm的紫外分光光度计内测定吸光度并记录数据。
维生素E含量的测定：在试验的第0、3、5、7天将样本以6000 r/min离心10 min。离心结束后，保留管底的一小部分上清液和管底的藻泥，用移液枪多次吹打成均匀的藻液。吸取50 μl的藻液于新离心管内，放入分析天平称重记录50 μl藻液质量，采用南京建成的维生素E (Vitamin E)测定试剂盒(比色法)进行VE含量的测定。
(1)
注：C标准=3 μg/ml；W为组织鲜重，g；V样总为加入的提取液总体积，ml。
色素含量的测定：采用乙醇法测定小球藻中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜的含量。在试验的第0、3、5、7天，将样本于离心机6000r/min，离心10 min，弃上清，加入95%乙醇5 ml，混匀并包上锡纸，置于4℃冰箱避光保存24小时后，离心机以6000 r/min离心10 min，取上清液放入紫外分光光度计中分别测量在波长665 nm、649 nm、470 nm处的吸光度。
(2)
(3)
(4)
注：Ca、Cb、Cc分别为小球藻中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量；A665、A649和A470分别为叶绿体色素提取液在波长665 nm、649 nm和470 nm下的吸光度。
叶绿素荧光参数的测定：在试验的第0、3、5、7天，将样本放入黑暗环境下进行暗处理15 min，避光结束后将摇晃均匀的藻液放入叶绿素荧光仪中测定小球藻的初始荧光产量(F0)，最大荧光产量(Fm)参数。根据以上参数并计算出最大光能转化效率(Fv/Fm)的荧光参数，具体计算公式如下：
(5)
2.5. 数据处理与分析
所有数据均为“平均值 ± 标准差”。使用Excel 2021进行数据整理与统计，IBM SPSS Statistics 27进行数据分析，显著水平设置为P < 0.05。使用Origin 2021及Prism 10软件进行作图。
3. 结果与分析
3.1. 维生素E对小球藻生长的影响
维生素E对小球藻藻密度的影响如图1所示。随着试验时间的推移，各试验组小球藻藻密度均有增加，最终维生素E浓度为25 mg/L的试验组藻密度最高，其次是50 mg/L和100 mg/L的试验组藻密度最低且低于对照组。在试验0~2天和5~7天，维生素E浓度为25 mg/L试验组的藻密度增长速度明显高于其他组。结果表明，在0~100 mg/L的维生素添加范围内，培养液中添加浓度为25 mg/L维生素E的小球藻生长效果最佳。
Figure 1. Growth rate of Chlorella vulgaris at different vitamin E concentrations
图1. 不同维生素E浓度下小球藻生长趋势
3.2. 维生素E对小球藻VE积累量的影响
维生素E在小球藻中的积累量如图2和图3所示，随着时间的推移，各组小球藻内部的VE含量逐渐增加，且试验最后一天所测得浓度为25 mg/L的试验组VE含量最高，最低的为10 mg/L和50 mg/L，故在此实验水平内，浓度为25 mg/L的维生素E对小球藻内部VE含量的积累效果最好。在试验第3~7天浓度为25 mg/L试验组VE含量积累速度最快。在试验第0天和第3天，五组间的VE含量无显著性差异(P > 0.05)，在第5天50 mg/L的试验组与对照组之间存在显著性差异(P < 0.05)，且该组积累量低于所有试验组，在第7天维生素E浓度为25 mg/L的试验组的VE含量显著高于其余四组(P < 0.05)。
Figure 2. Differential analysis of VE content under the same incubation time
图2. 相同培养时间下VE含量差异性分析
Figure 3. Trend of VE content in Chlorella vulgaris
图3. 小球藻中VE含量变化趋势
3.3. 维生素E对小球藻色素含量的影响
维生素E对小球藻光合色素含量产生不同的影响(图4)，四种色素含量均随时间的推移呈不断上升趋势，且增长速度逐渐趋于平缓。对于类胡萝卜素，在第0~3天内各试验组间均无显著性差异(P > 0.05)，而在第5~7天10 mg/L的试验组类胡萝卜素含量显著低于其余四组(P < 0.05)，且第7天时10 mg/L的试验组类胡萝卜素含量最低，其余四组含量差异不大，但25 mg/L的试验组类胡萝卜素含量最高。在0~3天各组间的叶绿素a含量无显著性差异(P > 0.05)，第5天维生素E浓度为25 mg/L、50 mg/L的试验组叶绿素a的含量显著高于其余三组(P < 0.05)，在第7天浓度为25 mg/L的试验组的叶绿素a的含量显著
Figure 4. Trends in photosynthetic pigment content of Chlorella vulgaris
图4. 小球藻光合色素含量变化趋势
高于其余四组(P < 0.05)。对于叶绿素b，在第3天时，各试验组含量出现了不同程度的变化，且差异性随着时间增加逐渐增大，且在试验第7天时浓度为25 mg/L的试验组叶绿素b含量最高。综上所述，在该维生素E浓度范围内，添加10 mg/L的维生素E对小球藻色素积累存在抑制效果，而25 mg/L的浓度对小球藻细胞内色素有促进作用。
3.4. 维生素E对小球藻光合效率的影响
维生素E对小球藻光合效率的影响如图5所示，在培养过程中，五组小球藻的最大光化学效率(Fv/Fm)都随着时间的增加逐渐上升，其中维生素E浓度为25 mg/L的试验组增长速度明显高于其余四组，10 mg/L和100 mg/L试验组Fv/Fm增长速度最平缓。试验第7天时维生素E浓度为25 mg/L试验组的最大光化学效率最高，显著高于其余四组(P < 0.05)。
Figure 5. Differential analysis of maximum photochemical efficiency of Chlorella vulgaris
图5. 小球藻最大光化学效率差异性分析
4. 讨论
4.1. 维生素E对小球藻生长及沉积量的响应
在不同的营养环境条件下，不同藻类可能具有某一特定的维生素吸收机制，这与微藻代谢的多种途径选择有关。有研究表明，维生素参与机体代谢的过程并影响代谢产物[12]。
本研究通过细胞密度，直观评估了维生素E添加量对小球藻生长的影响。结果表明，在本试验浓度范围内，25 mg/L的维生素E对小球藻生长的促进效果最为明显。与对照组相比，添加25 mg/L和50 mg/L维生素E显著增加了生物量，而10 mg/L和100 mg/L试验组则表现出抑制作用。关于维生素E在小球藻内的积累情况，在培养末期25 mg/L组的维生素E含量达到最高。维生素E作为藻类代谢中重要的抗氧化剂之一，其主要生理功能在于维持叶绿体的氧化还原平衡，保护光合器官的结构性及完整性，从而保障细胞膜的正常功能[13]-[15]。当机体内产生活性氧(ROS)时，便开始攻击蛋白质、脂质等大分子物质，形成具有破坏性的自由基。而此时维生素E便利用其自身的还原性清除ROS，防止膜系统中多不饱和脂肪酸的氧化[16]。基于上述机制，我们推测添加25 mg/L的维生素E可能通过增强小球藻细胞内的抗氧化酶的活性，提高抗氧化能力，从而促进细胞生长和分裂。
4.2. 维生素E对小球藻光合作用的响应
小球藻中一项重要的生理功能便是光合作用，它可以直观的体现出藻类生物产生有机物的能力[17]，若物质积累丰富通常表现为较高的光合效率，这一过程是维持机体正常生长代谢的关键因素之一[18]。试验结果表明，尽管培养期间各处理组色素总量均呈上升趋势，但具体影响与其浓度呈相关性。相比于对照组，25 mg/L组对叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的积累均表现显著促进作用；50 mg/L组对叶绿素a和类胡萝卜素积累有促进作用，但对叶绿素b积累存在抑制；而10 mg/L和100 mg/L组则抑制了叶绿素b的积累。通过先前学者的大量研究，可能有以下方面影响小球藻内光合色素的积累。一方面，维生素E作为抗氧化剂降低了ROS水平，保护了如谷氨酰-tRNA还原酶等叶绿素合成关键酶的活性，进而促进叶绿体色素前体的积累[19]；另一方面，可能通过协同作用增强类胡萝卜素合成，后者作为非酶促抗氧化剂消除叶绿体中的单线态氧[20]。然而，过高浓度(如100 mg/L)的维生素E可能干扰正常代谢过程，抑制色素合成相关酶及相关基因的表达[19]。
叶绿素荧光技术是在光合作用理论的基础上，对植物光合生理状态进行检测以及评估外部因素对其产生的影响，是一种研究光合作用尤其是光系统II (photosystem II, PSII)功能的天然探针[21]。本试验利用该技术评估了维生素E对小球藻光合作用的影响。结果表明，维生素E的添加影响了光合效率。最大光化学效率(Fv/Fm)是衡量藻细胞的光合效率及其受胁迫程度的重要指标[22]。在培养期间，所有组的Fv/Fm均呈上升趋势，但25 mg/L组的增长速率显著高于其他组。这表明添加25 mg/L的维生素E有效提升了小球藻的光合效率。这可能由于色素的积累增强了光能的吸收与转化效率[23]或保护叶绿体结构的完整性，维持光合酶活性[24]。相反，高浓度维生素E (如100 mg/L)可能破坏叶绿体结构，抑制关键酶活性，阻碍光合电子传递链效率[24] [25]，最终抑制光合作用，使其无法进行正常的生理活动。
5. 不足与展望
本研究提出了一种新的微藻营养强化培养策略，旨在促进其生态可持续发展，并充分利用其在生态技术方面的应用，如作为水产生物幼虫的喂养、人类保健品中的添加剂等，以便更好地发挥其潜在优势。关于维生素E对小球藻生长的影响，本次试验只是得到了一个初步的结果，且本实验存在许多不可避免的误差，限于试验条件等客观因素，无法深入探究小球藻吸收的动力学机制以及生理生化代谢反应机理；营养强化后的小球藻缺乏对养殖生物效果实践，无法得知营养强化效果的持久性以及对养殖生物长期生长发育的潜在影响，限制了对营养强化技术实际应用价值的全面性评估。待后来学者在此基础上更加深入探索相关的领域，推动水产养殖的进一步发展。
6. 结论
试验结果表明，在培养液中加入适量的维生素E，可对小球藻的生长起到促进作用，试验组浓度为25 mg/L的维生素E生长效果最好，明显高于对照组。相同的培养条件下，在0~100 mg/L维生素E浓度范围内，10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L试验组与对照组相比其促生长效果较微弱或对小球藻的生长及光合色素产生抑制作用。综合试验及生产成本的计量，培养基中添加25 mg/L的维生素E对小球藻生长效果最佳。
NOTES
*通讯作者。