1. 引言
中成药生产过程中将产生中药渣。目前对中药渣的处理主要包括堆肥处理、作为饲料添加剂、沼气发酵、生物质燃料、焚烧、填埋等方式。中药渣主要以植物类中药渣为主，其中木质素是中药渣最常见的成分。木质素(Lignin)是一种具有三维网状结构的高分子，包含3类苯丙烷单元，通过醚键和碳碳键相互连接，并与纤维素和半纤维素存在连接，共同构成植物骨架[1]。
在产量上木质素是仅次于植物纤维素的可再生资源，其降解产物如苯丙醇、苯丙酮、芳香酸类、酚类化合物等可替代石油基原料。不同植物木质素的含量和结构单元具有差异性，采用不同的方法降解木质素可得到不同的低分子片段或小分子化合物，因此木质素降解产物本身就是一个丰富的化合物库。木质素低分子片段可以研发得到新型生物功能材料，比如声波吸收涂层、抗氧化膜、混泥土强化剂，木质素降解得到的小分子将为有机合成提供丰富的砌块[2]。可见研发高效、低成本、绿色环保的降解方法对利用中药渣木质素资源具有重要意义[3]。
当前木质素解聚技术主要包括物理法、化学法及生物法三大类。物理法(如机械粉碎、蒸汽爆破)通过破坏木质纤维素超分子结构提升后续处理效率，但无法直接获得降解产物。化学法(如碱性氧化法、低共熔溶剂法)虽能实现木质素的高效解聚，却面临催化剂失活、有毒副产物生成及设备腐蚀等技术经济瓶颈。生物法则依赖真菌、细菌等微生物或其分泌酶系(如漆酶、过氧化物酶)催化木质素降解，具有反应条件温和、环境兼容性好的优势，但普遍存在降解周期长、底物适应性差等局限[4]-[6]。我们从土壤中分离到一株细菌，经发酵优化与共培养体系构建，成功实现对黄芪、甘草等典型中药渣木质素的有效降解，为中药渣的精细化资源利用提供了理论依据与技术支撑。
2. 材料与方法
2.1. 十五种中草药渣木质素的制备
枇杷叶、淡竹叶、大青叶、淫羊藿、黑骨藤、滇白珠、桂枝、桑白皮、黄柏、板蓝根、丹参、半夏、菊花、金银花、辛夷共十五种药材均购买自贵阳市同仁堂药店，每个品种均为100 g。上述药材，采用80%的乙醇热回流提取三次，再用水热回流提取2次，弃去提取液，得到药渣，60℃烘干备用。
称取80克的药渣，用粉碎机打碎后，过100目筛，得到细粉。取细粉50 g，加入3%的NaOH溶液500 mL进行预处理，于55℃下恒温水浴锅中搅拌反应7 h，反应液经两层纱布反复过滤即得药渣黑液，然后向其中滴加2 mol/L的HCl溶液至pH值为2~3，置于55℃恒温水浴锅中保温，直至析出大量沉淀，将反应液于8000 r/min的离心机中处理15 min，弃去上清液，沉淀物烘干后研磨过筛(200目)即得纯化的药渣木质素，置棕色瓶中保存备用[7]。
2.2. 分解木质素微生物的筛选
苯胺蓝-PDA (Potato Dextrose Agar，马铃薯培养基)平板的制备：马铃薯去皮后切成颗粒(20 g)，加入纯水(100 mL)，煮沸后过滤，得到滤液(加水补充至100 mL)，100 mL滤液加2 g葡萄糖和2 g琼脂，溶解后高压灭菌，冷却至50℃后，加入无菌苯胺蓝溶液(终浓度0.2%)，倒入平板，平板置30℃培养箱过夜，无菌生长的平板用于筛选试验。
包含微生物的样本分别采集自：腐木、林下土壤、湖底污泥、牛瘤胃内容物、羊瘤胃内容物、鸡肠道内容物、白蚁、蚯蚓、蜣螂、蚂蚱、甲虫。
上述样本置无菌碾钵中，加入无菌水碾磨，取上清液，涂布接种在苯胺蓝-PDA平板上，置30℃培养箱中，培养过程中，每天观察，凡是在菌落周围出现褪色圈的菌被视为木质素降解菌，并立即分离菌株进行纯培养，编号保持。
2.3. 木质素降解菌对15种中药渣木质素的降解试验
采用pH = 5.5的磷酸盐缓冲液(PBS)将15种中药渣木质素分别配制成10 mg/mL的母液，巴氏灭菌后备用。
真菌采用马铃薯葡萄糖培养液(100 mL水)中加入20 g去皮马铃薯颗粒，煮沸后过滤，滤液加水恢复到100 mL后，加入2 g葡萄糖，高压灭菌后备用)进行木质素降解试验。细菌采用普通肉汤(100 mL水)中加入蛋白胨2 g、牛肉浸膏1 g、氯化钠0.5 g，高压灭菌后备用。
在培养液中加入木质素母液，使木质素终浓度为1 mg/mL，总体积50 mL，然后接种木质素降解菌1 mL (每mL含新鲜培养物20 mg)，置30℃摇床中(50 r/min)培养，分别于培养后4、8、12日取样，测定木质素含量。同时设培养液对照组和阴性组(含木质素的无菌培养液)。
采集样本培养液2 mL，离心后取上清液，用纯培养液调零，在280 nm分别测定样本培养组和阴性组的OD值，木质素降解率按下列公式计算：
降解率(%) = [(阴性组OD280值 − 培养组OD280值) ÷ 阴性组OD280值] × 100%
2.4. 对15种混合中药渣的木质素降解试验
将前述的十五种中药渣细粉等量混合，高压灭菌后，加入适量灭菌液体培养基(100 mL水加入葡萄糖2 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏2 g、氯化钠0.5 g)，使药渣充分吸水膨胀。
有氧发酵方案：分细菌GBF01单独发酵、霉菌GFF01单独发酵、细菌GBF01和霉菌GFF01混合发酵(两种菌接种量相同)、无菌对照四个组，在培养(30℃)过程中向培养瓶供给空气。
厌氧发酵方案：分细菌GBF01单独发酵、霉菌GFF01单独发酵、细菌GBF01和霉菌GFF01混合发酵(两种菌接种量相同)、无菌对照四个组，在培养(30℃)过程中培养瓶密闭。
上述培养试验每组平行做5份，在保湿条件下，连续培养60 d，药渣经滤纸过滤，滤渣加入70%乙醇洗涤，再用纯水洗涤，目的是除去药渣中木质素的降解产物，再次过滤除水后，药渣置烘箱(70℃)烘至恒重，测定药渣中的木质素。
采用Klason法测定木质素。将2 g样品放入适量浓硫酸(72%)中，在室温下搅拌1小时。然后稀释酸解液至3%硫酸，并在95℃下水解2小时。过滤水解液，用热水洗涤残渣至中性，将残渣烘干至恒重并称量。药渣木质素含量(%) = (药渣酸解后残渣质量 ÷ 药渣酸解前质量) × 100%。
2.5. 细菌GBF01的鉴定
采用16S rDNA序列测序的方法对细菌GBF01进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。引物序列为：27F: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG/1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT。采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。DNA电泳采用1.5%琼脂糖，在1X TAE电泳缓冲液中进行。PCR扩增条件见表1。送样测序，利用NCBI数据库比对测序结果。
Table 1. PCR reaction conditions
表1. PCR反应条件
温度(℃) |
时间 |
循环 |
95 |
5 min |
|
94 |
30 s |
|
57 |
30 s |
30 cycle |
72 |
90 s |
|
72 |
10 min |
|
2.6. 细菌GBF01降解木质素的产物分析
将15中药渣木质素等量混合，用PBS缓冲液(pH = 5.5)配置成10 mg/mL的母液，巴氏灭菌后备用。普通肉汤培养液灭菌、冷却后，接种细菌GBF01，30℃培养过夜后，在细菌培养液中加入上述木质素母液，使终浓度为1 mg/mL，继续培养12 d。将培养液在60℃中蒸干，加入适量甲醇，用玻棒不断搅拌，尽量使残留物溶解，冷却后离心，取上清液，直接进样，采用液质联用仪(BioAccord LC-MS系统)进行分析。
3. 结果与讨论
3.1. 十五种中草药渣木质素的含量
Figure 1. Lignin content in fifteen types of Chinese medicine residues
图1. 十五种中药渣的木质素含量
木质素是地球上可再生的第二丰富的碳源，可转化为多种化学品和有价值的工业产品。不同的植物其木质素的含量存在差异，比如针叶木材中木质素含量为25%~30%，在阔叶木材中为19%~28%，在非木质原料中为11%~27% [8]。从图1看出，十五种中药渣都含木质素，含量在11%~24%之间，其中黄柏中药渣的木质素含量最高(24%)，菊花中药渣木质素的含量最低(11%)。可见，中药在药效物质被提取后，仍然含有丰富的木质素，这些木质素如果能被充分降解，可以获得多种有机合成砌块。
3.2. 具有分解木质素功能的微生物
从腐木、林下土壤、湖底污泥、牛瘤胃内容物、羊瘤胃内容物、鸡肠道内容物、白蚁、蚯蚓、蜣螂、蚂蚱、甲虫等样本都能发现分解木质素的微生物，主要为真菌(霉菌居多)和细菌，根据在苯胺蓝-PDA平板中形成褪色圈的大小，可以初步判断微生物对木质素的降解能力。表2列举了褪色圈直径净值(褪色圈直径减去菌落直径)大于或等于2 mm的微生物种类。可以看出，细菌GBF01、02和真菌GFF01、02具有较强的木质素降解功能。
Table 2. Microbial species exhibiting ligninolytic activity
表2. 具有降解木质素功能的微生物
微生物类型 |
编号 |
褪色圈直径净值(mm)* |
来源 |
细菌 |
GBF01 |
12 ± 2.2 |
林下土壤 |
细菌 |
GBF02 |
8 ± 1.4 |
湖底污泥 |
细菌 |
GBF03 |
2 ± 0.2 |
羊瘤胃内容物 |
真菌 |
GFF01 |
5 ± 0.4 |
林下土壤 |
真菌 |
GFF02 |
4 ± 0.2 |
腐木 |
真菌 |
GFF03 |
2 ± 0.1 |
白蚁 |
*：平均值 ± 标准差。
3.3. 细菌GBF01、02和真菌GFF01、02对15种中药渣木质素的降解
Table 3. Degradation effects of four microbial species on lignin from 15 types of Chinese Herbal Medicine residues at different time intervals
表3. 四种微生物在不同时间内对15种中药渣木质素的降解效果
木质素 |
|
GBF01降解率(%) |
|
|
GBF02降解率(%) |
|
|
GFF01降解率(%) |
|
|
GFF02降解率(%) |
|
|
4 d |
8 d |
12 d |
4 d |
8 d |
12 d |
4 d |
8 d |
12 d |
4 d |
8 d |
12 d |
枇杷叶 |
12 ± 2* |
40 ± 6 |
62 ± 8 |
10 ± 1 |
22 ± 3 |
32 ± 4 |
8 ± 1 |
12 ± 1 |
32 ± 4 |
0 |
0 |
5 ± 1 |
淡竹叶 |
10 ± 1 |
36 ± 2 |
56 ± 4 |
0 |
8 ± 1 |
18 ± 2 |
10 ± 1 |
16 ± 2 |
22 ± 2 |
0 |
5 ± 1 |
5 ± 1 |
大青叶 |
16 ± 1 |
28 ± 2 |
64 ± 5 |
0 |
5 ± 1 |
10 ± 2 |
6 ± 1 |
12 ± 2 |
16 ± 1 |
4 ± 1 |
8 ± 1 |
16 ± 1 |
淫羊藿 |
5 ± 1 |
24 ± 2 |
32 ± 4 |
0 |
0 |
0 |
14 ± 2 |
22 ± 2 |
28 ± 3 |
10 ± 1 |
16 ± 2 |
20 ± 3 |
黑骨藤 |
20 ± 2 |
32 ± 2 |
68 ± 4 |
10 ± 2 |
18 ± 1 |
24 ± 2 |
5 ± 1 |
10 ± 2 |
12 ± 1 |
5 ± 1 |
5 ± 1 |
5 ± 1 |
滇白珠 |
5 ± 1 |
16 ± 1 |
30 ± 2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
桂枝 |
5 ± 1 |
12 ± 1 |
18 ± 1 |
5 ± 1 |
10 ± 1 |
10 ± 1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
桑白皮 |
18 ± 1 |
36 ± 2 |
64 ± 4 |
5 ± 1 |
10 ± 1 |
20 ± 1 |
10 ± 2 |
20 ± 2 |
26 ± 2 |
5 ± 1 |
12 ± 1 |
18 ± 2 |
黄柏 |
5 ± 1 |
10 ± 1 |
30 ± 2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 ± 1 |
10 ± 1 |
10 ± 1 |
板蓝根 |
14 ± 1 |
28 ± 1 |
62 ± 5 |
5 ± 1 |
14 ± 2 |
22 ± 1 |
10 ± 1 |
18 ± 2 |
34 ± 1 |
0 |
0 |
0 |
丹参 |
20 ± 2 |
30 ± 1 |
48 ± 3 |
0 |
0 |
0 |
5 ± 1 |
10 ± 2 |
10 ± 1 |
0 |
0 |
0 |
半夏 |
16 ± 2 |
28 ± 2 |
42 ± 6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
菊花 |
12 ± 2 |
26 ± 1 |
38 ± 2 |
0 |
0 |
0 |
5 ± 1 |
10 ± 1 |
16 ± 2 |
0 |
0 |
0 |
金银花 |
10 ± 1 |
22 ± 1 |
32 ± 1 |
5 ± 1 |
10 ± 1 |
20 ± 3 |
5 ± 1 |
16 ± 2 |
32 ± 4 |
0 |
0 |
0 |
辛夷 |
14 ± 1 |
28 ± 1 |
52 ± 4 |
5 ± 1 |
12 ± 3 |
22 ± 2 |
0 |
0 |
0 |
5 ± 1 |
12 ± 3 |
16 ± 1 |
*：平均值 ± 标准差。
木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，苯丙烷是其基本的结构单元，来源于三种芳香醇前体，不同植物的木质素其单体构成存在差异。为了获得对不同木质素具有广泛降解功能的微生物，测试了细菌GBF01、02和真菌GFF01、02对15种中药渣木质素的降解率(表3)。GBF01菌株展现出对15种中草药渣中木质素成分的显著降解效能，经过为期12天的发酵过程，其木质素降解率稳定维持在30%~68%的区间。相对而言，GBF02菌株对9种药渣的木质素具有降解能力，其降解效率在10%~30%之间(发酵周期同样为12天)，但对于6种特定药渣的木质素成分则表现出降解功能的缺失。真菌GFF01则能针对10种药渣的木质素实施降解，其降解率波动于10%~34%的范围内(发酵12天)，且对5种药渣的木质素缺乏有效的降解机制。真菌GFF02的降解谱则覆盖了8种药渣的木质素，其降解效率在5%~20%之间(发酵12天)，但对7种药渣的木质素表现出降解能力的不足。综上所述，细菌GBF01对中草药渣木质素展现出广泛且高效的降解潜能，而真菌GFF01则对约70%的中草药渣木质素具有显著的降解活性。基于此，我们推测GBF01菌株可能编码了丰富的木质素降解酶系，包括但不限于漆酶(laccases)、锰过氧化物酶(manganese peroxidases)和木质素过氧化物酶(lignin peroxidases)，这些酶共同作用以实现木质素的高效分解。
3.4. 不同发酵方式对15种混合药渣木质素的降解
Figure 2. The degradation effect of bacterial GBF01 and fungal GFF01 on lignin in traditional Chinese medicine residues under aerobic and anaerobic conditions, both individually and in co-fermentation
图2. 在有氧和厌氧状态下，细菌GBF01和真菌GFF01单独发酵和混合发酵对中药渣木质素的降解效果
中成药厂产生的药渣主要为混合药渣，在前期试验中，已经明确细菌GBF01具有广泛降解中药渣木质素的作用，而真菌GFF01对大部分中药渣木质素具有降解作用。本试验的混合中药渣直接模拟药厂中药渣，未做碱水处理，即中药渣经干燥、粉碎后，直接发酵。发酵分有氧、厌氧两种方式，并考察GBF01和GFF01单菌种发酵和混合菌种发酵的降解效果。从图2看出，经细菌GBF01有氧发酵后混合中药渣中残留的木质素为7%，而经厌氧发酵后残留的木质素为9%，在统计学上存在差异(p < 0.05)，提示GBF01在有氧发酵条件下对混合中药渣木质素具有更强的降解作用。阴性对照组混合中药渣的木质素含量在有氧和厌氧发酵状态下分别为14%和15%，差异无统计学意义。与阴性对照比，GBF01对混合中药渣木质素的降解率约为50%。真菌GFF01在有氧和厌氧发酵时，混合中药渣残留的木质素分别为12%和11%，差异无统计学意义。与阴性对照比，GFF01对混合中药渣木质素的降解率约为15%。细菌GBF01和真菌GFF01等量混合接种，不管是有氧发酵还是厌氧发酵，均未能提高对中药渣木质素的降解作用。
3.5. 细菌GBF01的鉴定
细菌GBF01在有氧时生长良好，为革兰氏阳性杆菌，其16S rDNA经特异引物PCR扩增后电泳，得到一条大约1.5 kb的条带(图3)，扩增测序结果显示细菌GBF01 16S rDNA大小为1486 bp，BLAST比对结果提示细菌GBF01与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) IM1、B268和SF334等菌株亲缘关系接近。在众多木质素降解技术中，生物方法具有环境兼容性和可持续性[9]。一些细菌已经报道具有降解木质素的功能，例如根瘤菌脂杆菌(Azospirillum lipoferum)、地中海海洋单胞菌(Marinomonas mediterranea)、埃塞俄比亚热泉菌(Aquifex aeolicus)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、特基拉芽孢杆菌SN4(Bacillus tequilensis SN4)和粪产碱菌(Alcaligenes faecalis) [10]。就我们所知，目前未见贝莱斯芽孢杆菌降解木质素的研究报道。
Figure 3. GBF01 strain 16S rDNA PCR amplification fragment
图3. GBF01菌株16S rDNA PCR扩增片段
3.6. LC-MS分析细菌GBF01降解木质素的产物
与对照相比(图4)，细菌GBF01对木质素具有明显的降解作用(图5)。对照组木质素出现14个可积分的分子/离子峰，细菌GBF01对木质素进行降解后，出现18个分子/离子峰，并且出现了新的分子/离子峰，表明细菌GBF01对木质素发酵后，产生了新的降解产物。为了排除细菌GBF01的自身代谢产物对结果的干预，对细菌GBF01单纯培养物进行了LC-MS检测，在相同色谱条件下，未检测到积分明显的峰。在实验中，所采用的木质素是15种中药渣的混合木质素，因此难以判断细菌GBF01对木质素的降解机制。
Figure 4. Molecular/ionic peaks of lignin control group (without bacterial fermentation) analyzed by LC-MS
图4. 木质素对照组(未经细菌发酵) LC-MS分析的分子/离子峰
Figure 5. Molecular/ionic peaks of lignin after fermentation treatment by bacterial GBF01 by LC-MS analysis
图5. 木质素经细菌GBF01发酵处理后LC-MS分析的分子/离子峰
4. 结论
本研究系统评估了15种中药渣中木质素的含量及其资源化利用潜力。结果显示，中药渣中木质素含量较高(11%~24%)，表明中药渣是木质素资源的重要来源。通过筛选，我们从不同环境样本中发现3株细菌、3株真菌对木质素具有降解作用。分别对15种中药渣木质素进行降解实验，发现细菌GBF01和真菌GFF01对中药渣木质素具有普适降解功能，其中GBF01对15种不同中药渣木质素的广泛且高效的降解能力，12天发酵后降解率在30%~68%之间，显著优于GFF01。在模拟中药厂混合药渣的降解实验中，单独采用GBF01进行有氧发酵展现出更强的降解效果。采用16S rDNA测序，GBF01被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。LC-MS分析证实，GBF01能够降解木质素并产生新的降解产物，但其具体的降解机制有待进一步研究。
基金项目
本研究由中药功效成分挖掘与利用全国重点实验室资助，合同编号：JBGS-FAMP202303。
NOTES
*通讯作者。