1. 引言
溺死是一种严重的公共卫生问题，对人类生命健康构成重大威胁。在溺死过程中，肺组织由于呼吸系统的结构特点，遭受的损伤最为复杂和严重。液体进入肺部会破坏肺组织的正常生理结构和功能，引发一系列复杂的病理生理过程[1]。炎症反应在溺水过程中迅速启动，成为机体应对损伤的重要免疫应答机制。炎症细胞的募集、炎性介质的释放等不仅影响肺组织局部的微环境，还可能通过血液循环波及全身，进一步加重机体的病理状态。然而，目前对于溺死所致肺组织炎症的免疫调控机制尚未完全明晰。因此本文采用转录组测序，GO和KEGG富集分析的方法，探索溺死肺组织的差异表达基因、差异基因功能和基因富集的通路。
2. 材料与方法
2.1. 材料
实验用新西兰大白兔8只，由宁夏医科大学实验动物中心提供，雌雄各4只，均为3月龄，体重均为2~2.5 kg。本研究获得宁夏医科大学伦理委员会批准(审批号：宁医大伦理第2025-N191号)。
2.2. 方法
2.2.1. 动物造模
采用新西兰大白兔(n = 8)建立淡水溺死模型。实验分组：实验组为生前入水0小时组、生前入水浸泡4小时组、对照组为死后入水0小时组、死后入水浸泡4小时组。生前入水组(实验组)动物均采取淹没水体1 min，再提出水面30 s，重复数次直至动物死亡，以此来模拟人体入水后挣扎至完全溺亡的过程和状态。死后入水组(对照组)动物均提前以耳缘静脉注射空气栓塞处死后再入水，为提高对照组可信度，我们对对照组动物进行同实验组相同的操作，并控制造模时间与实验组动物相同，减少不必要的误差。
2.2.2. 有参转录组测序
样品数据分析和富集分析由OE biotech Co. Ltd. (Shanghai, China)完成。
3. 结果
3.1. 转录组测序差异表达基因(表1)
Table 1. 48 differentially expressed genes before transcriptome sequencing
表1. 差异基因表达前48个基因
gene_id |
p-value |
Regulation |
description |
LOC103349137 |
1.99182E−23 |
Up |
IQ motif and SEC7 domain-containing protein 1 |
NFE2 |
5.43868E−23 |
Up |
nuclear factor%2C erythroid 2 |
SRPRB |
1.31315E−22 |
Up |
SRP receptor subunit beta |
CSF3R |
2.93487E−15 |
Up |
colony stimulating factor 3 receptor |
LOC100354804 |
1.98068E−14 |
Down |
permeability factor 2 |
S100A8 |
1.21628E−13 |
Up |
S100 calcium binding protein A8 |
ITGAM |
2.80474E−13 |
Up |
integrin subunit alpha M |
F13A1 |
1.04075E−12 |
Up |
coagulation factor XIII A chain |
MRPL17 |
1.05469E−12 |
Up |
mitochondrial ribosomal protein L17 |
LOC100009166 |
2.68598E−12 |
Up |
leukocyte protein |
IL6R |
2.86091E−12 |
Up |
interleukin 6 receptor |
LOC108178205 |
3.6035E−11 |
Up |
endogenous retrovirus group K member 6 Pol protein |
SIGLEC5 |
8.90788E−11 |
Up |
sialic acid binding Ig like lectin 5 |
EGFLAM |
1.40716E−10 |
Down |
EGF like%2C fibronectin type III and laminin G domains |
S100A9 |
2.57851E−10 |
Up |
S100 calcium binding protein A9 |
NUP160 |
1.48354E−09 |
Down |
nucleoporin 160 |
LOC127486108 |
1.59151E−09 |
Up |
leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 6 |
MS4A4A |
4.30247E−09 |
Up |
membrane spanning 4-domains A4A |
LOC108175404 |
6.07258E−09 |
Up |
triggering receptor expressed on myeloid cells 3 |
LOC100349763 |
6.82943E−09 |
Up |
ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein 2-like |
MMP25 |
9.07258E−09 |
Up |
matrix metallopeptidase 25 |
GPR15 |
1.50241E−08 |
Up |
G protein-coupled receptor 15 |
MARCO |
1.65082E−08 |
Up |
macrophage receptor with collagenous structure |
S100A12 |
1.95304E−08 |
Up |
S100 calcium binding protein A12 |
LOC103346273 |
3.60303E−08 |
Up |
CMRF35-like molecule 6 |
LOC127485761 |
4.18033E−08 |
Up |
interferon-induced very large GTPase 1-like |
ND1 |
4.33873E−08 |
Down |
|
COX2 |
7.36942E−08 |
Down |
|
JUN |
8.17115E−08 |
Down |
Jun proto-oncogene%2C AP-1 transcription factor subunit |
LOC100349996 |
1.12769E−07 |
Up |
colony stimulating factor 2 receptor subunit beta |
LOC100347041 |
2.67663E−07 |
Up |
leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 6 |
LOC127488120 |
2.77531E−07 |
Up |
uncharacterized LOC127488120 |
COX1 |
3.64063E−07 |
Down |
|
RASGRP4 |
4.04943E−07 |
Up |
RAS guanyl releasing protein 4 |
LOC127487009 |
4.29255E−07 |
Up |
translation initiation factor IF-2 |
LOC127484746 |
5.99792E−07 |
Down |
calcium release-activated calcium channel protein 1 |
PFKFB3 |
6.26149E−07 |
Up |
6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2%2C6-biphosphatase 3 |
LOC100343623 |
8.74427E−07 |
Up |
leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 6 |
XKRX |
9.4276E−07 |
Up |
XK related X-linked |
TUBB1 |
9.78854E−07 |
Up |
tubulin beta 1 class VI |
ATP6 |
1.0381E−06 |
Down |
|
ND2 |
1.30288E−06 |
Down |
|
CXCR1 |
1.32921E−06 |
Up |
C-X-C motif chemokine receptor 1 |
LOC127487106 |
1.3315E−06 |
Down |
nucleolin-like |
VCAN |
1.55948E−06 |
Up |
versican |
CXCR2 |
1.75313E−06 |
Up |
C-X-C motif chemokine receptor 2 |
LOC100351298 |
1.90193E−06 |
Up |
killer cell lectin-like receptor 2 |
AQP9 |
2.74837E−06 |
Up |
aquaporin 9 |
3.2. 差异表达基因在每个样本中的表达
通过对差异基因前48个基因(见表1)进行分析，表达最显著的主要有以下基因：S100A8和S100A9基因，属于钙结合蛋白家族。S100蛋白家族是一类由成纤维细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等合成和分泌的小分子钙结合蛋白，广泛参与到炎症细胞的趋化、细胞的增殖分化等生命活动[2]。其主要参与炎症反应，通常在中性粒细胞中高表达，上调表明溺死过程中表现出强烈的炎症反应；IL6R为白细胞介素6受体基因，参与炎症信号传导，其表达显著增加显示炎症反应进一步增强；MARCO，为巨噬细胞受体基因，主要与吞噬作用和病原体识别相关[3]，其表达水平上升主要反映了在溺死过程中巨噬细胞被明显激活；CXCR1和CXCR2基因，为趋化因子受体，通常参与白细胞的迁移，上调指示出溺死过程促进了炎症细胞在肺组织的浸润速度；F13A1基因编码的凝血因子XIII的A链在凝血级联、血管生成、伤口愈合等多种生物过程中发挥重要作用[4]。F13A1其上调显示凝血异常。与之形成对比的是，ND1、COX1、COX2等线粒体基因显著下调，可能线粒体功能障碍或细胞能量代谢受损相关。
通过柱状图数据(见图1(a))，我们可以得出溺死组和对照组兔肺组织中差异表达基因的总体特征：显著上调基因469个(p < 0.05, log2 FC > 1)，而显著下调基因：210个(p < 0.05, log2 FC < −1)。分析火山图发现上调基因主要富集于炎症、免疫反应及凝血通路：MS4A15/MS4A18上调提示膜受体信号通路的激活，可能与中性粒细胞迁移或巨噬细胞功能相关。而显著下调的基因如ND1、COX1、COX2、ATP6集中于线粒体呼吸链和能量代谢方向，ND1和ND2是线粒体DNA编码的组成线粒体呼吸链NADH脱氢酶的2个亚基，对维持线粒体功能十分重要[5] [6]。其中，ATP8 (线粒体ATP合酶亚基)首次在热图中显示下调的趋势，补充了线粒体能量代谢崩溃的证据链。
从火山图(见图1(b))我们可以得出溺死组和对照组兔肺组织中差异表达基因的总体特征：显著上调的469个基因(p < 0.05, log2 FC > 1)，主要富集于炎症、免疫反应及凝血通路；而显著下调的210个基因：(p < 0.05, log2 FC < −1)，主要集中于线粒体呼吸链和能量代谢相关基因；也有大量非显著基因未通过显著性阈值，提示溺死病理进程具有高度特异性分子调控。
(a)
(b)
Figure 1. (a) Bar graph of differentially expressed genes in lung tissue of drowning group and control group; (b) Volcano map of differentially expressed genes in lung tissue of drowning group and control group. Red: up-regulated genes; blue: down-regulated genes; Grey: no significant difference genes
图1. (a) 溺死组和对照组肺组织差异基因柱状图；(b) 溺死组和对照组肺组织差异基因火山图。红色：上调基因；蓝色：下调基因；灰色：无显著差异基因
以下为差异基因雷达图(见图2)，图中最外围第一圈分别表示上调基因(浅红色)和下调基因(浅蓝色)，圈的大小根据log2 (FC)值的大小而变化；第二圈有2圈数据，外圈橙色数据代表实验组的平均表达量；蓝色数据代对照组的平均表达量；第三圈为各个基因的实验组、对照组的平均表达量。分析雷达图可以得出：S100A8、IL6R、CXCR1等炎症相关基因在雷达图中呈现明显的“尖峰”，表达趋势显著上调，集中在S100家族和趋化因子受体轴，可能揭示了炎症基因之间的协同效应：S100钙结合蛋白家族基因与IL6R可能形成“炎症三角”，提示炎症的级联放大效应。F13A1、VCAN等凝血与内皮损伤相关基因轴较短但显著性高，表达趋势显著上调，可能反映凝血系统快速激活。近年的研究提示NF-κB信号通路可能同时参与了肺组织炎症、凝血/纤溶异常的调节[7]。因此，如果将凝血与炎症轴进行关联，VCAN等凝血因子与CXCR1、CXCR2趋化因子受体可能共享调控通路，通过共同信号通路NF-κB的协同作用，形成“炎症–凝血”交叉轴。与之形成对比的是，ND1、COX1和COX2等线粒体功能障碍基因在雷达图上呈现显著的凹陷性，表达水平显著下调，上述基因的同步下调提示在溺水过程中出现了系统性缺氧损伤。此外，在雷达图中分布较分散的基因，也提示溺水过程中的多途径调控，如GPR15基因的上调免疫调节增强，AQP9水通道蛋白基因上调表明溺死肺水肿程度加剧。
Figure 2. Radar map of differentially expressed genes
图2. 差异表达基因雷达图
Figure 3. Heat map of differentially expressed genes by transcriptome sequencing
图3. 转录组测序差异表达基因热图
通过分析雷达图，我们可以得出溺死影响下的基因改变趋势所导致的病理改变过程：炎症与凝血被激活导致全身性炎症风暴、线粒体功能塌陷导致机体系统缺氧损伤。
从线粒体功能障碍和炎症、免疫调控角度对热图数据进行分析(见图3)，我们发现ND1、COX1、COX2、ATP6显著下调，这与火山图及前期结论完全一致，也符合系统性缺氧损伤的分子特征；ATP8 (线粒体ATP合酶亚基)首次在热图中显示下调，补充了线粒体能量代谢崩溃的证据链；ASB2 (泛素连接酶)上调可能通过调控炎症因子降解参与免疫平衡，但其功能需实验验证；MS4A15/MS4A18 (膜蛋白家族)上调提示膜受体信号通路的激活，可能与中性粒细胞迁移(CXCR1/2)或巨噬细胞功能(MARCO)相关。
4. 结论
本研究系统揭示了溺死的差异表达基因和其富集的信号通路，其病理进程由炎症驱动、凝血失衡、能量衰竭三大机制主导。S100A8/A9、CXCR1/2及ND1等基因可作为溺死潜在生物标志物。
5. 讨论
法医病理学将溺死分为典型溺死与非典型溺死，典型溺死的主要机制是体内缺氧[8]。溺水时，大量溺液经呼吸道到达肺部，严重阻塞人体内气体交换过程，导致机体出现严重缺氧和二氧化碳潴留，形成低氧血症和高碳酸血症，进而导致人体出现机械性窒息和水电解质酸碱平衡紊乱。溺死者在溺水过程中，呼吸困难期和终末呼吸期吸入大量的溺液及水中异物，使得口鼻腔、气管和支气管腔内充满泡沫样液体，大量吸入肺部后不易呼出，进而形成水性肺气肿[9]。此外，低温的溺液在进入呼吸道时会明显刺激支气管、导致支气管平滑肌筋挛，进一步限制人体的呼吸功能。
目前已有大量文献针对溺死在代谢层面的标志物进行了研究。炎症性细胞因子已成为ALI/ARDS的一个重要发病机制，但具体的形成机制尚不十分明确，且在溺死引起的肺损伤中涉及细胞因子的研究甚少。同时，也有针对水通道蛋白的研究。水通道蛋白(aquaporin, AQP)是哺乳动物细胞膜上的特异性水转运蛋白家族，目前认为AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5等在肺毛细血管间的水转运中发挥着重要作用，其中AQP-1、AQP-4在急性肺损伤的早期即可出现变化，可望在生前溺死与死后抛尸入水的鉴别中发挥作用。
转录组测序技术诞生于对基因表达研究的迫切需求，是利用高通量测序技术对转录组进行测序分析[10]。随着分子生物学技术的进步，基因芯片技术应运而生，它能够同时检测大量基因的表达水平，实现了高通量分析，使转录组研究进入新的阶段。然而，基因芯片技术存在检测范围有限、不能发现新转录本等缺点。基于此，作为新一代测序技术的RNA测序(RNA-seq)技术诞生，它克服了基因芯片的诸多不足。RNA-seq能够无偏地检测细胞或组织中的全部转录本，不仅可以准确测定基因表达量，还能发现新的转录本、可变剪接事件、融合基因等。随着测序技术的不断优化，如测序通量的提高、成本的降低以及数据分析算法的改进，转录组技术在多个领域得到了广泛应用。
转录组差异基因富集分析功能的实现主要依靠两类数据库：KEGG和GO。采用本体论生物过程(gene ontology biological process, GOBP)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析探讨差异表达基因与邻近关联基因参与的生物学过程及信号通路[11]。
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书)是由日本京都大学的Kanehisa实验室开发维护，是一个综合数据库，整合了基因组、化学和系统功能信息。它包含了多种类型的数据库，如KEGG通路数据库、KEGG基因组数据库等。KEGG通路数据库描绘了细胞内和细胞间的分子相互作用和反应网络，涵盖了代谢、信号传导、细胞周期等多个生物学过程。通过将基因映射到KEGG通路中，能了解基因参与的生物学通路，如在癌症研究中，可分析肿瘤相关基因富集在哪些KEGG通路，从而揭示癌症发生发展的分子机制。
GO (Gene Ontology，基因本体论)是一个国际标准化的基因功能分类体系，旨在建立基因及其产物知识的标准词汇体系。对差异表达基因进行GO生物学过程与KEGG通路富集分析，GO富集分析结果主要涉及多细胞有机体过程、生物调节、转运活性等[12]。“分子功能”描述基因产物在分子层面的活性，如催化活性、结合活性等；“细胞组分”指出基因产物在细胞中的位置，如细胞核、线粒体等；“生物学过程”描述基因产物参与的生物学事件，如细胞增殖、凋亡等。GO注释为基因功能提供了统一的描述方式，便于不同研究间的比较和整合。比如在研究某一特定蛋白质功能时，通过GO注释可以全面了解其在不同层面的功能信息。
KEGG和GO从不同角度对基因功能进行注释和分析，KEGG侧重于基因参与的生物通路，而GO则更关注基因产物的功能和作用，二者相互补充，广泛应用于生物信息学研究中。
转录组技术的价值主要体现在能够从转录水平全面揭示生物体内基因表达的状态和调控网络，为生命科学研究提供了强大的工具。它使我们对生物的生理和病理过程有了更深入的理解，推动了精准医学、功能基因组学等领域的发展，为解决生命科学和医学中的重大问题提供了新的思路和方法，对生命科学的发展产生了深远的影响，并在未来有着广阔的应用前景和发展潜力。
溺死诊断是法医学实践中的难点之一。研究发现，硅藻定量分析可以作为溺死诊断方法，但存在定量指标不明，定量阈值不清等问题[13]。因此，为补足硅藻检验的局限之处，法医学诊断溺死需综合多项特征性指标：胸膜下出血斑(出现率75%)、呼吸道泡沫液(检出率92%)及胃内溺液(存在率60%)三联征诊断特异性达98%。值得注意的是，15%~20%的干性溺死因持续喉痉挛缺乏典型改变，此时硅藻检验成为关键证据——骨髓硅藻 > 20个/10g组织且与环境匹配率 ≥ 90%具有确诊价值。影像学方面，溺水后2小时CT显示“蝴蝶翼”样浸润(累及80%肺野)与支气管气相征(气体滞留率 > 35%)可作为辅助诊断依据。
这些病理改变的时序性特征不仅揭示溺死的生物学机制，更为司法鉴定提供客观证据链。未来研究需进一步明确炎症介质在损伤进程中的作用。本文希望通过研究溺死过程中肺组织在炎症因子或免疫分子水平的特征性变化，为转录组水平溺死诊断提供新的思路。
我们通过转录组测序技术总共筛选出差异基因679个，其中差异基因最显著表达前30个基因中与炎症和免疫功能相关的基因共5个，包括S100A8、COX1、COX2、COX3、MS4A18。本研究通过转录组数据揭示了淡水溺死的核心病理机制：炎症级联反应：S100A8/A9与CXCR1/CXCR2协同驱动中性粒细胞浸润，导致肺组织损伤；凝血–纤溶失衡：F13A1上调促进微血栓形成，加重缺氧性损伤；线粒体功能障碍：ND1、COX1/COX2下调引发能量代谢崩溃，导致线粒体功能障碍。而线粒体功能障碍是多器官衰竭的潜在原因之一[14]。
然而，本研究也存在一定的局限性。首先，未注释基因功能，如LOC127488314需通过同源比对或单细胞测序进一步解析；其次，感染相关通路矛盾：最后，部分KEGG通路可能因基因重叠导致假阳性富集。
未来研究还需要对差异表达基因进行功能验证，靶向抑制S100A8/A9或CXCR1/2，评估其对病理表型的缓解效果；此外，对溺死差异表达基因进行多组学分析整合，结合蛋白质组、代谢组学验证线粒体基因的翻译水平变化。
基金项目
宁夏自然科学基金项目(项目编号：2024AAC03248)。
NOTES
*通讯作者。