1. 引言
肝癌可分为原发性和继发性两大类，原发性肝癌起源于肝脏的上皮或间叶组织。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。全球超过一半的肝癌新发病例和死亡病例发生在东亚，而世界上45.3%的肝癌新发病例和47.1%的肝癌死亡病例发生在中国[1]。原发性肝癌是常见的恶性实体肿瘤，每年新发的肝癌病例达到39.3万例，占全球肝癌50%以上，死亡病例36.92万例，仅次于肺癌和胃癌[2]。早期肝癌症状无特异性，中晚期肝癌的症状则较多，常见的临床表现有肝区疼痛、腹胀、纳差、乏力、消瘦，进行性肝大或上腹部包块等；部分患者有低热、黄疸、腹泻、上消化道出血；肝癌破裂后出现急腹症表现等。也有症状不明显或仅表现为转移灶的症状。
索拉非尼(sorafenib)是首个口服多激酶抑制剂，靶向作用于肿瘤细胞和肿瘤血管上的丝氨酸/苏氨酸和受体酪氨酸激酶，是一种多靶点抗肿瘤药，主要用于肝细胞癌的治疗[2]。索拉非尼作为多激酶抑制剂，具有双重抗肿瘤作用。一方面通过抑制Raf/MEK/ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长，另一方面通过抑制几种与新生血管生成和肿瘤发展有关的酪氨酸激酶受体的活性，包括血管内皮生长因子受体VEGFR、血小板衍生的生长因子受体PDGFR和c-KIT原癌基因，阻断肿瘤新生血管生成，间接抑制肿瘤细胞的生长。索拉非尼作为晚期肝癌的一线治疗药物，长期使用会引起患者产生耐药性，所以国内外众多学者致力于寻找抑制索拉非尼耐药的物质。俞清江等学者发现大黄素联合低浓度索拉非尼抑制人肝癌Huh7SR细胞的增殖，并促进其凋亡，可能与抑制PI3k/Akt信号通路有关[3]。秦骥伟等学者发现AMD3100可能通过下调CA9、CXCR4表达降低人肝癌细胞对索拉非尼耐药性，增强索拉非尼对人肝癌细胞的增殖和侵袭抑制[4]。
目前，瑞戈非尼(拜万戈)是应用较为广泛的抗肝癌细胞索拉非尼耐药性药物之一。2016年，Bruix等学者完成了一项随机双盲平行组III期临床试验，探讨了瑞戈非尼在既往接受过索拉非尼治疗后出现肿瘤进展患者中的临床疗效。结果显示，瑞戈非尼组的死亡风险降低了37% [5]。卡博替尼是另一个进入临床用以克服索拉非尼耐药的药物，在3期CELESTIAL试验中，与安慰剂相比，卡博替尼提高了晚期肝癌患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)。研究人员评估了卡博替尼在先前仅接受索拉非尼系统治疗的患者中的作用。研究表明，与安慰剂相比，卡博替尼在之前只接受索拉非尼治疗的人群中改善了OS (中位数11.3 vs 7.2个月；HR = 0.70，95% CI：0.55~0.88) [6]。
虽然瑞戈非尼和卡博替尼在治疗肝癌索拉非尼耐药中展现出一定的疗效，但副作用不容忽视。瑞戈非尼的常见副作用包括疼痛、手足皮肤反应、疲乏、腹泻、食欲下降和高血压等。更严重的反应包括重度肝损伤、出血、胃肠道穿孔和感染。卡博替尼常见不良反应包括腹泻、疲劳、食欲下降、高血压、手足皮肤反应、体质量减轻、呕吐、味觉障碍和口腔炎等。以上研究表明，虽然索拉非尼耐药相关研究取得了一定的进展，但目前仍缺乏疗效好、副作用小的药物。探索索拉非尼耐药潜在靶点及寻找小分子化合物具有重要的研究意义。
去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes, DUBs)通过移除底物蛋白上的泛素链，调控其稳定性、定位和功能，进而参与多种细胞生命活动。研究表明，蛋白泛素化过程的异常与肿瘤的发生发展密切相关，影响包括细胞增殖、转移和血管生成等关键过程。DUBs自身的蛋白质丰度、亚细胞定位及催化活性均受到严格调控。在肿瘤中，许多关键的促癌或抑癌蛋白都受到DUBs的调控。同时，DUBs的表达异常或功能突变会干扰细胞的DNA损伤修复、凋亡、自噬、信号转导和染色质重塑等核心通路，最终促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。鉴于DUBs在肿瘤调控网络中的核心作用及其功能失调对肿瘤进程的驱动，它们已成为重要的抗肿瘤药物靶点。目前，已有多个靶向DUBs的小分子抑制剂正处于抗肿瘤治疗的研发阶段[7]。
近年来，去泛素化酶(DUBs)在疾病，特别是癌症治疗中的重要作用日益受到学界关注，多项研究揭示了其关键调控机制和治疗潜力。在肿瘤研究中，罗霞等综述了DUBs的分类、功能及其在肾细胞癌(RCC)中的作用机制，并探讨了靶向DUBs的癌症治疗策略[8]。蒋良君等发现含OTU结构域的泛素醛结合蛋白2 (OTUB2)通过影响RNA解螺旋酶54 (RIG-I)活性，调控中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成以及结直肠癌(CRC)细胞的活力和侵袭能力[9]。Liu Xiangxiang等揭示了精氨酸甲基化调控cGAS稳定性的新机制，并证明PRMT1-cGAS-USP7轴是非小细胞肺癌(NSCLC)的潜在治疗靶点[10]。Wang Wenpeng等证实去泛素化酶JOSD2在食管鳞癌(ESCC)的发生发展中起至关重要的作用[11]。Chen Yourong等通过筛选发现OTUD1蛋白对维持卵巢癌干细胞(OCSC)特性至关重要[12]。Wu Liang等揭示了OTUD3-YY1通路在CRC中的治疗潜力，并明确OTUD3在调节YY1中的关键作用[13]。综合以上研究，DUBs通过调控关键促癌或抑癌蛋白的泛素化水平，深刻影响肿瘤细胞的生长、侵袭、转移以及耐药性，凸显了其作为克服肿瘤耐药性重要靶点的巨大潜力。
2. 方法
2.1. 去泛素化酶基因的差异表达分析
下载肝癌索拉非尼耐药数据集GSE109211 (21例敏感、46例耐药样本)。运行R软件“limma”包，以|Fold Change| ≥ 1.5且p < 0.05为条件，筛选在耐药样本中显著上调和下调的差异表达基因。随后，将差异表达基因与108个去泛素化酶基因取交集，确定肝癌索拉非尼耐药相关差异表达去泛素化酶(sorafenib resistance associated DUBs in liver cancer, SRADUB-LC)。进一步利用GEPIA数据库分析SRADUB-LC在肝癌组织(TCGA-LIHC)与癌旁正常组织中的表达水平，筛选标准：|Fold Change| ≥ 1.5且p < 0.05。
2.2. SRADUB-LC在肝癌中的预后分析
利用Kaplan-Meier Plotter数据库(https://kmplot.com/analysis/)对SRADUB-LC进行生存分析，预后指标分别是总生存期OS和疾病特异性生存期DSS。具体操作如下：在“mRNA RNA-seq”模块选择“Start KM Plotter for liver cancer”，在“Gene Symbol”框内输入相应的基因名称，在“Split patients by”模块选择“Auto select best cutoff”，在“Survival”模块选择“OS”时，其他参数保持默认不变；在“Survival”模块选择“DSS”时，“Patient”模块的“Sorafenib treatment”选项选择“treated (n = 30)”，其他参数保持默认不变。
2.3. 关键基因的临床与分子特征解析
1) 临床分期关联：通过GEPIA数据库分析关键基因表达与肝癌患者TNM分期的相关性；
2) 蛋白表达验证：基于The Human Protein Atlas及UALCAN数据库，检测关键基因在肝癌组织与癌旁组织中的表达水平；
3) 临床生存分析：回顾性分析29例接受索拉非尼治疗的肝癌患者生存数据，评估关键基因的预后价值；
4) 甲基化水平检测：利用UALCAN数据库分析关键基因在肝癌及癌旁组织中的启动子甲基化程度，并比较其在不同肿瘤分期及组织学亚型中的差异。
2.4. 靶向关键基因的化合物筛选
将关键基因输入Comparative Toxicogenomics Database (CTD)数据库，筛选下调该基因表达的化合物。
2.5. 分子对接
选取关键基因的10个靶向预测化合物，开展其与核心基因蛋白的分子对接。具体步骤如下：
1) 蛋白结构处理：从RCSB PDB数据库获取关键蛋白晶体结构，使用PyMOL 2.5移除水分子及原配体；
2) 配体结构优化：通过PubChem获取化合物3D结构，利用Open Babel 3.1.1将SDF格式转换为mol2格式并优化电荷；
3) 对接参数设置：采用AutoDock Tools 1.5.6对蛋白受体及配体进行加氢、设定扭转键，并转换为PDBQT格式；
4) 对接与可视化：运用AutoDock Vina进行分子对接，选取结合自由能(ΔG)最低的复合物模型，通过PyMOL进行结构可视化分析。
2.6. 实时聚合酶链反应(real-time PCR)
使用TRIzol试剂(康为世纪，CW0580S)从培养细胞中提取总RNA，并使用HiFiScript gDNA (康为世纪，CW2020M)进行逆转录反应。在CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad)上使用MagicSYBR预混液(康为世纪，CW3008M)进行定量PCR (qPCR)分析。以GAPDH作为内参基因。使用2^−ΔΔCt法计算相对mRNA表达量。引物序列如下：OTUB1-F：5'-GCAGAACCCTCTGGTGTCAG-3'；OTUB1-R：5'-TGGTCTTGCGGATGTACGAG-3'；GAPDH-F：5'-TTTTGCGTCGCCAGCC-3'；GAPDH-R：
5'-ATGGAATTTGCCATGGGTGGA-3'。
3. 结果
3.1. 肝癌索拉非尼耐药相关去泛素化酶基因的筛选
基于肝癌索拉非尼耐药组与敏感组的转录组数据，对108个去泛素化酶基因进行差异表达分析。结果显示，共鉴定出20个SRADUB-LC，包括：USP2、USP17、USP8、USP10、USP32、USP33、USP34、USP42、USP48、USP49、USP54、OTUD7A、OTUB1、JOSD1、ZC3H12D、COPS5、PRPF8、UCHL1、UCHL3、MPND (图1)。
Figure 1. Volcano plot of differentially expressed genes in sorafenib-resistant/sensitive liver cancer samples
图1. 肝癌索拉非尼耐药/敏感样本差异表达基因火山图
3.2. SRADUB-LC中核心基因的筛选与验证
肝癌与癌旁差异分析显示，SRADUB-LCSRADUB-LC中仅6个基因：USP10、USP32、USP33、USP48、OTUB1、UCHL1在肝癌组织中显著差异表达(图2)。
Figure 2. Differential expression of deubiquitinating enzyme genes in liver cancer and adjacent tissues
图2. 去泛素化酶基因在肝癌及癌旁中差异表达
3.3. 核心基因的预后分析
通过Kaplan-Meier Plotter数据库对USP10、USP32、USP33、USP48、OTUB1、UCHL1进行总生存分析(OS)。结果显示，USP48、OTUB1及UCHL1高表达的肝癌病人其OS显著降低(logrank P < 0.05)，而其余三个基因表达与肝癌病人OS无显著相关性(图3)。DSS分析结果显示，在接受索拉非尼治疗的肝癌病人中，OTUB1高表达的肝癌病人其DSS显著缩短(logrank P < 0.05)，而USP48及UCHL1则与DSS无显著相关性(图4)。OTUB1高表达与肝癌病人生存期显著负相关。以上结果提示，OTUB1的表达与肝癌病人对索拉非尼的敏感性降低相关，OTUB1可能是肝癌索拉非尼耐药的潜在靶点。因此，我们选择OTUB1作为后续分析的重点。
Figure 3. Prognostic analysis (Overall Survival, OS) of deubiquitinating enzyme genes in liver cancer patients
图3. 去泛素化酶基因在肝癌病人中的预后(OS)分析
Figure 4. Prognostic analysis (Disease-Specific Survival, DSS) of deubiquitinating enzyme genes in liver cancer patients
图4. 去泛素化酶基因在肝癌病人中的预后(DSS)分析
3.4. OTUB1的临床相关性分析
首先，我们利用GEPIA数据库分析了OTUB1表达与肝癌患者临床分期的相关性。结果表明，OTUB1的表达水平与肝癌分期显著相关(图5(a))。进一步，通过THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库和UALCAN数据库对OTUB1蛋白表达的分析显示，该蛋白在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织(图5(b)，图5(c))，与其mRNA表达趋势一致。随后，为探究OTUB1在肝癌中高表达的原因，我们进行了基因启动子甲基化分析。结果显示，与癌旁组织相比，肝癌组织中OTUB1启动子甲基化水平显著降低(图6(a))，且甲基化程度与肿瘤分期呈显著负相关(图6(b))，提示启动子低甲基化可能是OTUB1在肝癌组织中表达上调的原因之一。
Figure 5. Correlation between OTUB1 expression and liver cancer progression. (a) Correlation between OTUB1 expression and pathological staging of HCC; (b), (c) Expression of OTUB1 protein in liver cancer and adjacent tissues
图5. OTUB1表达与肝癌进展相关性分析。(a) OTUB1表达与肝癌病理分期的相关性；(b), (c) OTUB1蛋白在肝癌及癌旁组织中的表达
Figure 6. Analysis of OTUB1 gene promoter methylation. (a) Methylation analysis of OTUB1 in liver cancer and adjacent tissues; (b) Methylation analysis of OTUB1 at different stages of liver cancer
图6. OTUB1基因启动子甲基化分析。(a) OTUB1在肝癌及癌旁的甲基化分析；(b) OTUB1在肝癌不同分期的甲基化分析
3.5. OTUB1在肝癌索拉非尼耐药与敏感细胞中的表达验证
为了进一步揭示OTUB1与肝癌索拉非尼耐药的关系，我们通过RT-PCR检测了其在敏感细胞(HepG2)及索拉非尼耐药细胞(HepG2-SR)中的表达。结果显示，OTUB1在索拉非尼耐药肝癌细胞中的表达显著高于敏感细胞(图7)。
Figure 7. OTUB1 is significantly highly expressed in sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cells
图7. OTUB1显著高表达于肝癌索拉非尼耐药细胞
3.6. OTUB1相互作用的化合物筛选
随后我们通过CTD数据库预测下调OTUB1的化合物，如表1所示。
Table 1. Ten compounds that downregulate OTUB1
表1. 下调OTUB1的10个化合物
Compound |
Interaction |
2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether |
results in decreased expression of OTUB1 protein |
4-(5-benzo(1,3)dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)benzamide |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
Amitrole |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
beta-lapachone |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
Curcumin |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
Diquat |
results in decreased expression of OTUB1 protein |
Diuron |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
epoxiconazole |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
Isoproterenol |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
Methimazole |
results in decreased expression of OTUB1 mRNA |
3.7. 分子对接
我们随后通过分子对接进一步分析了10个化合物与OTUB1蛋白的相互作用(图8)。结果显示：4-(5-benzo(1,3)dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)benzamide、beta-lapachone和epoxiconazole均与OTUB1蛋白具有良好的对接活性，其中4-(5-benzo(1,3)dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)benzamide与OTUB1蛋白的结合能最低，对接活性最好(图9)。
Figure 8. Molecular docking results of 10 compounds with OTUB1
图8. 10个化合物与OTUB1分子对接结果
Figure 9. Schematic diagram of molecular docking between the top 3 compounds and OTUB1
图9. 前3名化合物与OTUB1的分子对接示意图
4. 讨论
泛素–蛋白酶体系统是真核细胞内蛋白质稳态调控的核心机制，通过泛素化修饰介导底物蛋白降解，参与细胞周期、凋亡等关键生命进程。去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes, DUBs)则通过逆转泛素化过程维持靶蛋白稳定性。研究表明，DUBs的异常活化可促进肿瘤发生、发展及耐药[14]。目前，DUBs在肝癌索拉非尼耐药中的作用还未完全揭示。本研究整合生物信息学与分子对接技术，筛选出索拉非尼耐药相关的20个差异表达DUBs基因、6个核心基因及1个关键基因(OTUB1)，并筛选出10种可下调OTUB1的潜在化合物。
本研究发现的去泛素化酶基因OTUB1在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。彭丽群等发现其在肝细胞癌(HCC)中表达升高，与肿瘤恶性程度及不良预后相关，并通过稳定RACK1蛋白激活PI3K/AKT及FAK/ERK信号通路促进HCC细胞增殖与转移[15]。聂登云等证实青蒿琥酯(ART)通过抑制IL-6/STAT3信号减少OTUB1转录及其介导的SLC7A11去泛素化，从而诱导卵巢癌细胞铁死亡[16]。Lin G等将OTUB1鉴定为结直肠癌(CRC)铁死亡的新型调节因子，其通过稳定GPX4发挥作用，靶向OTUB1-GPX4轴有望克服耐药[17]。Zhu Y等则发现姜黄醇通过下调OTUB1表达促进TGFB1降解，抑制TGFB1/VEGF轴驱动的细胞侵袭和血管生成，从而抑制结肠癌[18]。然而，目前尚未报道OTUB1在肝癌索拉非尼耐药中的作用及抑制其作用的有效化合物。本研究揭示OTUB1在肝癌索拉非尼耐药样本中的表达显著高于敏感样本；其表达与肝癌病人分期显著正相关；低表达OTUB1的肝癌病人其接受索拉非尼治疗后OS及DSS显著优于OTUB1高表达肝癌病人。这些结果提示OTUB1是肝癌索拉非尼耐药新靶点。但Kaplan-Meier Plotter数据库中仅收录了29例接受索拉非尼治疗的肝癌病人，小样本的生存分析存在一定的局限性，未来需要更大临床样本量的研究来进一步验证。
基于CTD数据库分析，我们筛选出10个候选化合物，多项独立研究报道了它们对OTUB1表达的下调作用。Sheller-Miller S等发现，使用PBDE处理足月胎盘外植体24小时后，蛋白质组学分析显示OTUB1蛋白显著下调[19]。Vaibhav S等研究表明，NOG蛋白与丙戊酸、多索吗啡或SB431542共处理可降低OTUB1 mRNA表达[20]。Ramhøj L等将孕哺期大鼠暴露于甲状腺过氧化物酶抑制剂甲巯咪唑或氨碘苯丙酸16天，RNA测序显示OTUB1表达下调[21]。Zhao L等用β-拉帕醌处理人结肠癌细胞，RNA-seq分析表明其诱导铁死亡并下调OTUB1 mRNA [22]。Erzurumlu Y等用姜黄素处理前列腺癌细胞48小时后，qRT-PCR检测显示OTUB1 mRNA水平显著降低[23]。Zhang等用敌草快处理小鼠，肾组织蛋白质组学分析显示OTUB1蛋白明显下调[24]。Pierre A等发现敌草隆以剂量依赖性方式调节miRNA表达并降低CD8 + T细胞毒性，伴随OTUB1 mRNA下调[25]。Ludovic C L等使孕鼠及其后代长期暴露于环氧菌唑，转录组学分析显示后代OTUB1 mRNA下调[26]。Cristi G等通过渗透泵给予小鼠异丙肾上腺素10天，发现左心室OTUB1 mRNA表达下调[27]。
特别值得注意的是，在上述筛选的化合物中，SB431542被预测为靶向OTUB1的强效候选者。Vaibhav S等的研究已表明其能显著下调OTUB1 mRNA [20]。分子对接结果进一步显示，SB431542与OTUB1蛋白具有最佳的对接活性(但其对OTUB1蛋白活性的直接影响尚需实验验证)。SB431542是一种有效且选择性的ALK5 (IC50 = 94 nM)及TGF-β受体抑制剂。鉴于TGF-β信号通路在肝脏稳态和肝癌发生发展中的重要作用，其异常与肝癌密切相关：章越等研究显示LHPP缺乏可通过激活TGF-β/Smad3信号增加肝细胞凋亡并加重肝纤维化[28]。琚书光等发现TGF-βR抑制剂可协同增强多纳非尼对抗HCC消融术后残余肿瘤的作用[29]。张成等则揭示TGF-β信号和Hippo信号协同诱导CYR61表达，进而抑制肝星状细胞(HSC)活化和HSC诱导的肿瘤生长、迁移与侵袭[30]。这些发现为深入研究SB431542通过调控TGF-β信号通路及OTUB1表达在肝癌等疾病中的作用提供了理论基础。
5. 结论
综上所述，本研究通过整合生物信息学筛选与分子对接技术，初步揭示去泛素化酶OTUB1是肝癌索拉非尼耐药的关键调控基因；同时筛选出化合物SB431542能显著下调OTUB1 mRNA表达并抑制TGF-β信号通路，上述发现提示SB431542或可通过靶向该通路，为克服索拉非尼耐药提供一种潜在的治疗策略，值得进一步探索。
基金项目
广西大学大学生创新创业训练计划项目(S202410593459)。
NOTES
*通讯作者。