1. 引言
食品真伪鉴别是强化市场监管效能、筑牢食品安全防线的关键技术支撑。三文鱼与虹鳟鱼因其外观高度趋同且价格差异显著，导致掺假问题频发。由于虹鳟鱼携带大量可寄生人体的寄生虫，生食风险高，因此，实现二者的精准鉴别至关重要。目前，针对三文鱼的真伪鉴别方法主要包括免疫学方法、分子方法、质谱法等，但各方法均存有一定局限。免疫学方法简便但灵敏度和特异性较低；分子方法(包括DNA条形码技术[2] [3]和实时荧光聚合酶链反应技术[4] [5]等)和质谱法[6]-[8]虽然存在准确性高的优点，但操作繁琐、耗时，需要专业设备和人员，限制了现场快速检测(Point-of-Care Testing, POCT)的应用。
为构建更高效、适配现场应用的三文鱼–虹鳟鱼精准鉴别技术体系，研究以样本提取与预处理的精准化优化为切入点，这是鉴别过程中最核心的环节。传统DNA提取方法涉及多步移液、离心步骤，存在耗时长，操作复杂等问题[9]-[12]，难以满足POCT对“简便、快速、便携”的核心需求，成为制约分子鉴别技术向现场场景延伸的关键因素。相较于传统方法，基于微针的DNA快速提取技术作为一种新型样本处理方法，凭借其“原位取样–高效富集–快速释放”的一体化优势，有望替代传统DNA提取试剂盒，为食品质量安全现场快速检测技术的开发提供新路径[13]。
然而，现有基于微针提取技术的检测方式多采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)进行后续分析，该技术虽具备高特异性、高灵敏度及高分辨率等优势[14]，但由于依赖复杂的实验室设备及专业操作人员且操作繁琐[15] [16]，仍难以满足POCT需求[17]。相比之下，环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)作为一种等温核酸扩增技术，不需要复杂的温度循环设备[18]，操作简单，成本低廉，在POCT领域展示出显著优势。其中LAMP比色法，向反应体系添加特异性显色剂，可实现结果可视化：阳性样本呈现特定颜色变化，阴性样本保持初始颜色，无需专业设备即可实现判读。该方法不仅继承LAMP的高灵敏度特性，还具有宽样本适用性(兼容微针提取的多种水产样本DNA)及实时可视化能力，有效解决了传统核酸检测结果判读依赖专业设备的痛点，在食品质量安全现场检测领域具有广阔的前景[19]。
基于以上讨论，本研究创新性地采用微针快速提取DNA样本并联合LAMP比色技术识别特定DNA的方法，开发了一种高效、高特异性的三文鱼与虹鳟鱼POCT鉴别体系，为鱼类物种鉴别提供了新思路。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
虹鳟鱼、三文鱼均来源于网购且拥有鉴定报告。
无水柠檬酸(CA)、碳酸钙(CaCO3)、二氯甲烷(分析纯)购自上海沪试实验室器材股份有限公司；聚乙烯醇(PVA, 31000)、壳聚糖(CS, 200-400)、聚乳酸(PLA, 60000)、N,N-二甲基甲酰胺(分析纯)购自上海麦克林生化科技股份有限公司；LAMP目视法试剂盒购自深圳易致生物科技有限公司。
2.2. 实验仪器
恒温金属浴(DB100-2P，群安科学仪器(浙江)有限公司)；离心机(TGIBWS，长沙湘智离心机仪器有限公司)；可调式混匀仪(MX-S，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司)；真空抽气泵(GM-0.33A，天津市津腾试验设备有限公司)；鼓风干燥箱(DHG-9055A，上海一恒科学仪器有限公司)；PDMS模板(中科微针(北京)科技有限公司赠送)；微针强度测试仪(DT612W，济南德天机电技术有限公司)；体视显微镜(SMZ1270，日本尼康公司)。
2.3. 实验方法
整个实验流程分为三个部分，依次为微针制备、微针性能测试、LAMP可视化检测。在微针制备中我们选用聚乳酸(Polylactic Acid, PLA)作为微针基材，并以浸涂法负载聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol, PVA)涂层，成功制备了涂层微针。针对所制备的微针，通过力学性能检测、外观表型观察和提取性能评估进行了系统的性能表征。为验证微针快速提取DNA结合LAMP可视化检测的可行性，将微针提取的鱼肉样本DNA洗脱液与LAMP pH比色法联用开展实验。整体实验流程详见图1。
Figure 1. Overall experimental flow chart
图1. 整体实验流程图
2.3.1. 微针制备
1) 针体制备
称取1.25 g的碳酸钙于烧杯，加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺和0.625 g柠檬酸，用培养皿盖住形成相对密封环境，放至150℃恒温金属浴上加热60 min。溶剂挥干后，将所得产物用蒸馏水洗涤，再置于室温下彻底干燥得到粉末状固体为mCaCO3，留存备用。
在含有0.25 g聚乳酸的烧杯中加入27 mL二氯甲烷溶液，并加入0.14 g mCaCO3形成2 wt% mCaCO3溶液以达到最佳力学强度。用培养皿盖住烧杯形成相对密封环境并将其置于恒温金属浴40℃加热搅拌90 min。随后立即用200 μL量程的移液枪将烧杯内的悬浊液加至微针PDMS模板中，并将模板放至负压抽气泵排气1 h使浊液充分填充针尖，然后将模板放至鼓风干燥箱中40℃烘干2 h并于室温下放至一夜充分晾干，留存备用。
2) 涂层制备
称取1 g PVA溶于4 mL去离子水，80℃加热溶解制备20 wt% PVA溶液作为涂层。采用浸涂法将涂层覆于微针上，并于40℃烘干30 min，重复两次，将所制得的微针留存备用。
2.3.2. 微针性能评价
1) 形貌观察
将微针放于体视显微镜下不同倍数放大以观察微针形貌，评价微针针形是否良好、是否破损、胶黏、有翘边等。
2) 力学性能测试
利用力学检测仪，测试形变程度为50%时整片针的最大承受力并计算单根针的承受力，计算见式(1)。
N单 = N总/n (1)
式中：N单为单根针在形变50%时最大承受力；N总为形变50%时整片针最大承受力；n为整片针的针数。
3) 提取能力评价
将微针刺入三文鱼与虹鳟鱼，汲取组织液10 min后取出。用移液枪吸取100 μL纯净水，反复吹打8~10次洗脱微针汲取的样本DNA，收集洗脱液留存备用。使用超微量分光光度计测定提取样本溶液中DNA的含量。
2.3.3. 引物设计
我们采取三文鱼的(MN 850430.1) COI序列并使用LAMP Primer Explor 5.0设计引物，引物序列如表1所示。
Table 1. Design primer sequences
表1. 设计引物序列
引物 |
序列 |
F3 |
CCCTTCTGGGAGATGACCAA |
B3 |
GGCTTCAACTCCAGATGAGG |
LB |
GACATAGCATTCCCCCGAATG |
FIP |
AGTTTCCAAAGCCGCCGATCAT-ATTGTTACAGCCCATGCCTT |
BIP |
TCCTCTTATAATCGGGGCCCCC-AAGGAGGGAGGGAGAAGTC |
2.3.4. 引物特异性检测及可视化LAMP可行性检测
1) 裂解法提取DNA
分别称取三文鱼和虹鳟鱼的样品30 mg，放入装有100 μL磷酸盐缓冲液(PBS, pH= 7.4)的离心管中，使用金属浴98℃加热10 min，离心后上清液为提取到的基因组DNA，放置于−20℃的冰箱留存备用。
2) 可视化检测
在PCR管依次加入12.5 μL反应缓冲液、1 μL混合反应液、3 μL混合引物、2.5 μL三文鱼或虹鳟鱼DNA提取液、6 μL纯净水，振荡混匀后，将配制好的反应体系放于金属浴中65℃加热30 min，85℃下反应5 min终止反应，取出冷却，观察颜色变化，根据颜色变化判定实验结果。
2.3.5. 实际样品检测
将微针隔着保鲜膜刺入三文鱼和虹鳟鱼样本，保持10 min后取出。用移液枪吸取100 μL纯净水，反复吹打微针8~10次，洗脱样本DNA并收集洗脱液留存备用。在PCR管分别加入12.5 μL反应缓冲液、1 μL混合反应液、3 μL混合引物、2.5 μL样本待测液、6 μL纯净水，振荡混匀后，将配制好的反应体系放于金属浴中65℃加热30 min，85℃下反应5 min终止反应，取出冷却，观察颜色变化，根据颜色变化判定实验结果。
3. 结果与分析
3.1. 微针性能评价结果
3.1.1. 形貌评价
通过体视显微镜观察微针外观，结果如图2所示。整片针的针数为522根，弯曲折断数目为3根。整体针形呈现出规则的锥形结构，使得微针能更好地刺入鱼肉，实现提取DNA的目的；涂层均匀覆盖于微针表面，无明显团聚、开裂或脱落现象，表明该涂层与微针结合紧密，可有效提高微针的提取性能；此外，微针阵列的基底平整度良好，无明显翘边或缺损情况，针体高度为500 μm，且针体高度均一性偏差小于2%。这表明所制备微针具有良好的形貌特征，其规整的阵列排布与高度的结构一致性，为DNA提取过程的均一性提供了可靠保障。微针变形程度为50%时，仍存有部分完好针尖，并结合力学性能表明所制备微针具有较强的机械性能和抗形变性能。
Figure 2. Overall appearance of microneedle patch before destruction (A) and the details of microneedles before (B) and after (C) destruction at a deformation degree of 50%
图2. 微针破坏前整体外观表型(A) 微针破坏前(B) 以及变形程度为50%时的细节展示(C)
3.1.2. 力学性能评价
根据微针强度测试仪的数据显示(图3)，当形变程度为50%时，整片针的最大承受力为41.18 N，单根针能承受的力为0.08 N。这表明该微针在可控形变范围内既能抵抗外力导致的结构性失效，又能实现高效经皮穿刺。综上，该微针阵列具备优异的抗形变能力与靶向穿刺性能，满足经皮提取的力学性能指标要求。
Figure 3. Time-force curve of microneedles when the deformation degree is 50%
图3. 微针变形程度为50%时的时间–力值曲线
3.1.3. 提取性能评价
经过超微量紫外分光光度仪的测量(图4)，虹鳟的浓度曲线的表明浓度值为208.05 ng/μL，浓度较高，且A260/A280的比值为2.299，比值较高，表明纯度较好；三文鱼样品的核酸浓度为215.00 ng/μL，浓度较高；A260/A280比值为2.268，样品纯度较高；表明微针能够高效地从样品中提取到浓度高、纯度高的DNA，为后续的LAMP反应提供了高质量的DNA样本，确保了实验结果的准确性和可靠性。
Figure 4. The nucleic acid curve diagram of rainbow trout (A) and salmon (B)
图4. 虹鳟(A)和三文鱼(B)提取DNA曲线图
3.2. 检测结果
当靶标核酸存在(阳性反应)时，LAMP扩增过程中会产生大量焦磷酸根离子，与反应体系中的镁离子结合形成焦磷酸镁沉淀，导致体系pH值下降，此时试剂盒中的pH指示剂会由初始的洋红色转变为黄色；而在非靶标核酸的情况下，扩增反应未发生，体系pH值保持近中性或弱碱性，指示剂则维持初始的洋红色。以去离子水、裂解法提取到的三文鱼和虹鳟鱼的DNA以及微针提取到三文鱼和虹鳟鱼的DNA作为模板，利用三文鱼COI基因的特异性引物进行LAMP扩增，结果如图5所示。空白模板是指加LAMP检测试剂和去离子水；标准阳性对照是指加入LAMP检测试剂和裂解法提取的三文鱼DNA；标准阴性对照是指加入LAMP检测试剂和裂解法提取的虹鳟的DNA。扩增反应完成后，可以明显看出，标准阳性对照呈现黄色，标准阴性对照和空白模板都呈现洋红色，能明显区分出靶标和非靶标之间的阳性和阴性之分。这表明该引物具有特异性，能够有效区分靶标和非靶标，显示出阳性和阴性结果，从而验证了基于三文鱼COI基因设计的引物可用于三文鱼的LAMP可视化检测。此外，微针提取的三文鱼DNA (图5(D))和标准阳性对照的颜色一致呈现黄色，微针提取的虹鳟DNA (图5(E))和标准阴性对照的颜色一致呈现洋红色，这表明微针提取DNA联合LAMP技术可用于实际的三文鱼鉴别中。
Figure 5. The visual LAMP results of blank template (A), standard positive control (B), standard negative control (C), microneedle-extracted salmon DNA detection (D) and microneedle-extracted rainbow trout DNA detection (E)
图5. 可视化实验结果空白模板(A)、标准阳性对照(B)、标准阴性对照(C)、微针提取三文鱼DNA检测(D)、微针提取虹鳟DNA检测(E)
4. 讨论与结论
本研究证实，涂层微针能够成功提取虹鳟鱼与三文鱼的DNA，其提取浓度分别可达208 ng/μL和215 ng/μL，这表明所制备的微针具备优异的DNA提取能力，这一成果为实现1 h内完成从样本采集到结果判读的快速检测流程提供了科学依据。本研究结合LAMP比色法作为检测手段，在结果判读中高效便捷，结果表明通过微针快速提取DNA并联合LAMP比色法能够为三文鱼的POCT体系构建提供了创新性技术路径。本研究选用三文鱼的特异性引物，实现了三文鱼与虹鳟鱼的精准鉴别，还可拓展应用于其他鲑科鱼类与三文鱼的鉴别。因此，微针辅助DNA快速提取联合LAMP技术不仅为三文鱼的POCT提供了全新方法，还为其他物种DNA鉴别研究提供了新的思路。
为了进一步摆脱实验室条件的限制，针对LAMP pH比色法存在的易受气溶胶污染、反应体系稳定性不足及易形成引物二聚体等局限性，可以通过使用液体石蜡、设计密闭仪器避免开盖操作以减轻气溶胶污染，优化引物的浓度比例，添加有机添加剂、氧化石墨烯、尿嘧啶-DNA-糖基化酶、金纳米粒子减轻LAMP反应体系中的非特异性扩增，使得反应体系更加满足现场便捷检测的需求。
未来，我们期望开发出更为稳定的反应体系以突破LAMP反应的局限性，以实现DNA的快速、稳定鉴别，从而彻底摆脱对实验室设备的依赖，最终达成“采样–提取–检测”一体化操作的目标。同时，探索更适宜的样本储存方案与低成本原材料，以期推动该技术的商业化转化与普及应用，进而促进DNA鉴别技术的推广，有效遏制食品假冒伪劣现象，为食品安全保障体系的构建奠定坚实基础。
基金项目
山东省自然科学基金项目(ZR2022QB14)，山东第一医科大学教育教学改革研究项目(XM2023016)。
NOTES
*通讯作者。