响应面法优化深共晶溶剂提取槐米总黄酮的工艺研究

Optimization of Deep Eutectic Solvent Extraction Process for Total Flavonoids from Sophora japonica Buds Using Response Surface Methodology

摘要: 本研究运用响应面法对超声辅助深共晶溶剂提取槐米总黄酮的工艺进行优化。选取氯化胆碱与1,2-丙二醇(摩尔比1:2，含水量10%)作为提取溶剂，在单因素试验基础上，将液料比、提取时间、提取温度确定为关键变量，以总黄酮提取含量为响应值，进行Box-Behnken设计，构建了二次多项式回归模型Y = 5.45 + 0.71A − 0.21B + 0.40C + 0.24AB − 0.84AC + 0.028BC − 1.40A² − 1.00B² + 0.74C²。当液料比为35 mL/g、提取时间为2.5 h、提取温度为48℃时，槐米总黄酮提取含量可达6.11 mg/g。研究结果显示，响应面法能够高效优化DES提取工艺，为槐米总黄酮的绿色提取提供技术支持。

Abstract: This study employed response surface methodology (RSM) to optimize the ultrasound-assisted deep eutectic solvent (DES) extraction process for total flavonoids from Sophora japonica Buds. A DES composed of choline chloride and 1,2-propanediol (molar ratio 1:2, with 10% water content) was selected as the extraction solvent. Based on single-factor experiments, the liquid-to-material ratio, extraction time, and extraction temperature were identified as key variables. Using the total flavonoid extraction yield as the response value, a Box-Behnken design was implemented, establishing the quadratic polynomial regression model: Y = 5.45 + 0.71A − 0.21B + 0.40C + 0.24AB − 0.84AC + 0.028BC − 1.40A² − 1.00B² + 0.74C². The optimal conditions were determined as: liquid-to-material ratio 35 mL/g, extraction time 2.5 h, and extraction temperature 48˚C, achieving a maximum total flavonoid yield of 6.11 mg/g. The results demonstrate that RSM effectively optimizes the DES extraction process, providing technical support for the green extraction of total flavonoids from Sophora japonica Buds.

1. 引言

近年来，天然产物中的黄酮类化合物始终是研究的热点方向。槐米作为豆科植物槐树(Sophora japonica L.)的干燥花蕾，具有凉血止血、清肝泻火的功效，可用于医治便血、吐血及肝热目赤等疾患[1] [2]。其活性成分以黄酮类为主，含量高达30%以上，具有止血、抗氧化、抗炎及抗肿瘤药理活性[3]。

到目前为止，提取黄酮类化合物的方法有索氏提取法[4]、乙醇回流法[5]、超声辅助法[6]、酶辅助提取法[7]等，但这些方法存在成本较高、对环境污染较大的缺点[8] [9]。因此，采用绿色环保的方法提取槐米总黄酮已迫在眉睫。深共晶溶剂(Deep Eutectic Solvent, DES)因其低毒性、可生物降解性、制备简单和可设计性强等优势，被视为替代传统挥发性有机溶剂的绿色提取介质。Wang等[10]采用氯化胆碱/1,4-丁二醇提取槐米芦丁，在最佳工艺下提取含量116.78 mg/g；Peng等[11]利用氯化胆碱/三乙二醇提取槐花芦丁，提取含量279.8 mg/g，进一步表明，基于DES对于高效提取植物有效成分的有效性。类似地，Liu 等[12]利用DES从鸡矢藤中提取总黄酮，提取率为27.04 mg，提取率高达传统方法的1.3倍，同时溶剂用量降低30%~50%，体现出良好的绿色替代潜力。

然而，现有研究在系统比较DES法与多种传统方法在槐米总黄酮提取中的综合性能方面仍显不足，特别是在单位产物溶剂消耗、能耗及环境影响等方面的半定量评估尚未深入开展。因此，本研究使用响应面法优化DES体系用于槐米总黄酮的提取，在提升提取效率的同时，致力于降低单位产物的溶剂消耗与能耗，为槐米黄酮的绿色可持续提取提供新策略，并推动DES在中药活性成分提取中的实际应用。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 试验仪器

KH-600KDE超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)、紫外–可见分光光度计(Cary 50，岛津)、傅里叶变换红外光谱仪(北京北分瑞利分析仪器有限公司)和TDZ4-WS台式低速自动平衡离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)。

2.1.2. 试验试剂

槐米购自安徽省，芦丁标准品购自贵州大学。氯化胆碱、1,2-丙二醇、甘油、乳酸、葡萄糖、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯，购自阿拉丁试剂有限公司。

2.2. 方法

2.2.1. DES的制备

按照特定的摩尔比，将氯化胆碱分别与四种氢键供体混合(含水量30%)，放入50 mL圆底烧瓶中。在60℃恒温水浴中磁力搅拌4 h后，取出烧瓶冷却，得到各类DES溶剂，用于提取槐米总黄酮，并对其提取含量进行比较[13]。各类DES组合见表1。

Table 1. DES combinations

表1. DES组合

组合	HBA	HBD	摩尔比	含水量
DES-1	氯化胆碱	1,2-丙二醇	1:2	30%
DES-2		甘油
DES-3		乳酸
DES-4		葡萄糖

2.2.2. 样品溶液的制备

精密称取1 g槐米粉末放入锥形瓶中，按照液料比15 g/mL加入制备好的DES，将溶液放入超声仪中超声提取1 h。以5000 r/min离心10 min后，取1 mL上清液，加入60%乙醇，放入50 mL容量瓶中定容，制得样品溶液备用[14]。

2.2.3. 槐米总黄酮的测定

精密量取供试品溶液3 mL，置25 mL容量瓶中，按2.2.4项的方法，根据公式(1)算出提取液中槐米总黄酮含量的浓度(mg/g)。

$W=\frac{C\times V\times n}{m\times 1000}$ (1)

式中：

W——总黄酮含量，mg/g，C——溶液质量浓度，mg/mL，V——提取体积，mL

N——稀释倍数，m——粉末质量，g

2.2.4. 响应面试验

Table 2. Factors and levels of Box-Behnken response surface experiment design

表2. Box-Behnken响应面试验设计因素及水平

水平	液料比 (A)/(mL/g)	提取时间 (B)/h	提取温度 (C)/(℃)
−1	35	2.0	20
0	40	2.5	30
1	45	3.0	40

基于单因素实验结果，采用Design-Expert 10.0.3软件依据Box-Behnken中心组合设计原理，设计3因素3水平的响应面试验优化槐米总黄酮的提取工艺，以槐米总黄酮提取含量为响应值。各因素水平如表2所示。

3. 结果与讨论

3.1. DES的红外光谱分析

如图1所示，对含水量10 %、摩尔比1:1的氯化胆碱/1,2-丙二醇DES进行了红外光谱分析。DES的红外吸收光谱如图1所示。3200~3400 cm⁻¹处的宽而强的伸缩振动峰由缔合的O-H键产生，表明DES结构中存在大量氢键。2800~3000 cm⁻¹处的伸缩振动峰由C-H键产生，1600~1800 cm⁻¹处的弯曲振动峰由N-H键产生。C-H的面内变形振动峰在约1400 cm⁻¹处，C-O的伸缩振动峰在约900~1200 cm⁻¹处，-CH₃的面内摇摆振动吸收带在约800 cm⁻¹处。可见，使用氯化胆碱和1,2-丙二醇制备时，DES的分子结构完整。

Figure 1. Infrared absorption spectrum of DES

图1. DES的红外吸收光谱

Figure 2. Effect of DES type on total flavonoid content

图2. DES类型对总黄酮含量的影响

3.2. DES种类对总黄酮含量影响

如图2所示，氯化胆碱/1,2-丙二醇的提取量最高，达3.35 mg/g；其次是氯化胆碱/葡萄糖和氯化胆碱/甘油，分别为2.30 mg/g和2.24 mg/g；氯化胆碱/乳酸在505 nm处未形成峰。因此，选择由氯化胆碱和1,2-丙二醇组成的DES作为提取槐米总黄酮的溶剂。

3.3. DES摩尔比对总黄酮含量影响

如图3所示，槐米总黄酮含量随1,2-丙二醇摩尔比的增加而上升。当氯化胆碱/1,2-丙二醇的摩尔比为1:2时，含量达到最大值3.55 mg/g；当摩尔比降至1:3时，总黄酮提取量下降到2.81 mg/g。摩尔比为3:1和2:1的氯化胆碱/1,2-丙二醇在制备过程中未能完全溶解为均一透明的溶液，无法用于提取槐米黄酮，因此这两组的黄酮含量为0。综上，氯化胆碱/1,2-丙二醇的摩尔比为1:2时提取效果最佳。

Figure 3. Effect of DES molar ratio on total flavonoid content

图3. DES摩尔比对总黄酮含量的影响

Figure 4. Effect of DES water content on total flavonoid content

图4. DES含水量对总黄酮含量的影响

3.4. DES含水量对总黄酮含量影响

如图4所示，随着DES含水量的增加，总黄酮含量也随之增加。当含水量达到10%时，黄酮含量达到峰值3.69 mg/g；但当含水量超过10%时，黄酮提取量下降，当含水量达到40%~50%时，这两组未检测到黄酮。其原因可能是含水量增加使DES粘度降低，更利于黄酮的溶解；但当含水量增加到一定程度时，会使溶剂极性上升，对提取产生不利影响。因此，本实验中DES的最佳含水量为10%。

3.5. 液料比对总黄酮含量影响

如图5所示，在一定范围内，黄酮含量随液料比的增加而增加。当料液比达到35 mL/g时，总黄酮含量达到最大值，即4.68 mg/g。然而，当液料比继续增加时，总黄酮含量下降。可能是随着液料比的增加，槐米中的总黄酮可能已大部分被提取出来。虽然在液料比25~30 mL/g时黄酮含量有所下降，然后在30~35 ml/g时又上升，但整体呈上升趋势。因此，最佳提取料液比为35 mL/g。

Figure 5. Effect of solid-liquid ratio on total flavonoid content

图5. 料液比对总黄酮含量的影响

Figure 6. Effect of extraction time on total flavonoid content

图6. 提取时间对总黄酮含量的影响

3.6. 提取时间对总黄酮含量影响

如图6所示，槐米总黄酮的提取量随时间延长而增加。在2.5 h的时间点，总黄酮提取量达到顶峰，为3.80 mg/g。2.5 h后，黄酮含量下降。较长的提取时间可能导致槐米中一些结构不稳定的化合物发生变化，导致黄酮含量下降。因此，理想的提取时间为2.5 h。

3.7. 提取温度对总黄酮含量影响

如图7所示，槐米总黄酮的提取量在40℃时达到顶峰，即4.08 mg/g。随后，黄酮含量随温度升高而下降。虽然黄酮含量在50℃至60℃有小幅上升，但40℃后总体呈下降趋势。含量下降的原因可能是逐渐升温破坏了黄酮的结构。因此，理想的提取温度为40℃。

Figure 7. Effect of extraction temperature on total flavonoid content

图7. 提取温度对总黄酮含量的影响

3.8. 响应面优化结果

3.8.1. 响应面回归模型建立与分析

根据单因素试验结果，选择对槐米总黄酮提取率影响较大的3个因素：液料比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)，设计3因素3水平响应面试验。试验设计方案及提取率结果如表3所示。

采用Box-Behnken方法，利用Design Expert 13软件，对提取率进行了回归拟合分析，分析结果见表3。同时获得多元二次回归方程：Y = 5.45 + 0.71A − 0.21B + 0.40C + 0.24AB − 0.84AC + 0.028BC − 1.40A² − 1.00B² + 0.74C²。

Table 3. Response surface experiment design and results

表3. 响应面实验设计与结果

试验号	A	B	C	提取含量(mg/g)
1	30	2	40	2.83
2	40	2	40	3.74
3	30	3	40	1.86
4	40	3	40	3.74
5	30	2.5	30	2.74
6	40	2.5	30	5.86
7	30	2.5	50	5.41
8	40	2.5	50	5.15
9	35	2	30	5.07
10	35	3	30	4.67
11	35	2	50	5.65
12	35	3	50	5.36
13	35	2.5	40	5.39
14	35	2.5	40	5.61
15	35	2.5	40	5.30
16	35	2.5	40	5.39
17	35	2.5	40	5.55

Table 4. Analysis of variance results for regression equation

表4. 回归方程方差分析结果

方差来源	平方和	自由度	均方差	F值	P值	显著性
模型	23.48	9	2.61	135.09	<0.0001	^**
A	3.99	1	3.99	206.59	<0.0001	^**
B	0.34	1	0.34	17.83	0.0039	^***
C	1.30	1	1.30	67.52	<0.0001	^**
AB	0.24	1	0.24	12.18	0.0101	^*
AC	2.86	1	2.86	147.87	<0.0001	^**
BC	3.025 × 10^−^3	1	3.025 × 10^−^3	0.16	0.7041
A^2	8.27	1	8.27	428.18	<0.0001	^**
B^2	4.24	1	4.24	219.74	<0.0001	^**
C^2	2.33	1	2.33	120.50	<0.0001	^**
残差	0.14	7	0.019
失拟项	0.070	3	0.023	1.43	0.3587	not significant
纯误差	0.065	4	0.016
总误差	23.62	16
R^2 = 0.9943
R^2Adj = 0.9869

注：^*P < 0.05，差异显著；^**P < 0.01，差异极显著。

由表4可知，F模型 = 135.09，P模型 < 0.0001，表明模型整体高度显著。失拟项P = 0.3587，为不显著。R² = 0.9943，表明99.43%的响应变量变异可由模型解释，拟合效果优良，调整R² = 0.9869，表明调整后拟合优度较高。在因素影响中，液料比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)的P < 0.01，为极显著；在交互项中，AC的P值 < 0.0001，为极显著，是工艺优化的核心交互项；AB的P值为0.0101接近0.01，AB交互作用也显著；但BC的P值 = 0.7041，为不显著，表明二者独立作用于响应值。二次项A²、B²、C²均P < 0.0001，极显著，说明因素对提取率的影响存在非线性关系。根据F值判断，槐米总黄酮的提取含量受各因素的影响大小依次为：A > C > B。

3.8.2. 响应面分析

为了研究各种因素之间的相互影响对槐米总黄酮提取含量的影响，绘制等高线图和3D图，如图8所示。当等高线图是圆形时，表示这两个因素的交互作用比较弱，当等高线图是椭圆形时，表示这两个因素的交互作用比较强[15]。

(a) 液料比与提取时间交互作用

(b) 液料比与超声温度交互作用

(c) 超声时间与超声温度交互作用

Figure 8. Effect of interaction between two factors on extraction content of total flavonoids from Sophora japonica

图8. 两因素交互作用对槐米总黄酮提取含量的影响

如图8所示，液料比(A)：在各交互因素中，槐米总黄酮提取含量，曲面变化明显，等高线分布密集，表明液料比改变会使提取率大幅变动。提取时间(B)和提取温度(C)：影响较突出。AC交互作用显著，表现为曲面坡度和等高线形态反映出二者共同变化对提取率的明显影响如图(a)；AB有一定交互趋势；BC交互作用不显著，其等高线较平缓。基于模型的方差结果分析，所得结果表明液料比和超声温度的交互作用较强，而其他因素之间的交互作用相对较弱。

3.8.3. 验证性试验

根据模型预测结果，当液料比为35 mL/g，超声时间为2.5 h，超声温度为48℃时，槐米总黄酮提取含量可达到6.18 mg/g。按照上述最佳条件，进行三次独立实验验证，结果测得平均提取率为6.11 mg/g，与预测值的相对误差仅为1.13%，表明实际结果与预测值非常接近，从而充分证实了该模型的准确与可靠。

4. 结论

通过溶剂筛选，得到最佳提取槐米总黄酮的溶剂为氯化胆碱与1,2-丙二醇(摩尔比1:2，含水量10%)的组合；同时，利用响应面法建立的超声DES提取槐米总黄酮模型具有高度显著性和预测精度，各因素交互作用显著，最优参数组合为液料比为35 ml/g，超声时间为2.5 h，超声温度为48℃时，槐米总黄酮提取含量可达到6.11 mg/g。DES溶剂为循环使用且生物可降解溶剂，既提高了槐米总黄酮提取含量又可代替挥发性有毒有机溶剂，从而降低环境污染与生产成本，符合绿色化学原则。试验建立的RSM-DES-超声协同工艺为槐米资源高值化开发提供新策略，可延伸至其他中药活性成分的绿色提取领域。

基金项目

2024年贵州省大学生创新创业项目(项目编号：S2024106680581)；2024年贵州省大学生创新创业项目(项目编号：S2024106680685)。

NOTES

^*通讯作者。