生物标志物在胃癌早期诊断中的研究进展

Research Progress of Biomarkers in the Early Diagnosis of Gastric Cancer

摘要: 目的：了解胃癌早期诊断生物标志物的研究进展，并评估细胞外囊泡、tsRNAs、miRNA等新型生物标志物在胃癌早期诊断的潜力。方法：查阅、分析近年来发表的国内外胃癌早期诊断相关生物标志物的研究成果并进行综述。结果：传统标志物的敏感性、特异性较差，对有潜力的胃癌早期诊断标志物进行探索，结果发现miR-181、miR-652、PDGF-BB、tRF-17-WS7K092、中性粒细胞来源的外泌体等标志物在胃癌早期诊断中有良好的应用价值。结论：新型的生物标志有很高的应用潜力，随着研究的进一步深入可能成为胃癌早期诊断的有效工具。未来的研究需要进一步验证这些标志物的有效性，找出高效、规范的检测方法，推动其在临床中的广泛应用。

Abstract: Objective: To know the progress of research on biomarkers for early diagnosis of stomach cancer and to assess the potential of new biomarkers such as extracellular vesicles, tsRNAs and miRNA for early diagnosis of stomach cancer. Methods: We consulted, analyzed and reviewed the results of the latest national and international research on biomarkers related to the early diagnosis of stomach cancer. Results: The sensitivity and specificity of traditional markers are low. Exploration of potential markers for early diagnosis of stomach cancer has revealed that miR-181, miR-652, PDGF-BB, tRF-17-WS7K092 and exosomes of neutrophic origin have been well used in early diagnosis of stomach cancer. Conclusions: the new biomarkers have high potential for application and could become, as research advances, effective tools for the early diagnosis of stomach cancer. Future research will need to further test the efficacy of these markers and find effective and standardized tests that will promote their widespread use in the clinic.

1. 引言

胃癌在全世界新发病例超过968,000例，死亡人数接近660,000人，发病率、死亡率均位于全球第五，在东亚和东欧发病率最高[1]。2022年我国胃癌发病率为35.87%，在男性新发癌症病例中排名第四，胃癌死亡人数为260,400人，是男性癌症死亡原因中第三位，女性癌症死亡原因的第四位[2]。随着我国胃癌防治措施工作的不断推行，胃癌的死亡率呈下降趋。胃癌在不同时期治疗效果差异悬殊，大多数病人在发现时胃癌已进展至晚期，在手术、化疗、放疗后五年总体生存率不足50%，但早期胃癌预后好，内镜切除术后五年生存率可达92.6%。来自韩国的一项研究显示[3]，接受过筛查的胃癌患者和未接受筛查的胃癌患者相比死亡风险降低了33%，在所有癌症分期的亚组中死亡率显著地持续下降，这说明接受胃癌筛查的患者长期生存率有明显改善。因此胃癌早期发现、早期诊断、早期治疗，对于降低胃癌死亡率，改善患者生存质量有十分重要的意义。内镜结合活检是目前早期诊断胃癌的主要方法，但由于该检查为侵入性检查、费用较高，患者在检查过程中会出现剧烈、恶心、呕吐等反应，因此难以广泛用于胃癌的临床筛检。因此必须寻找更简便有效的诊断方法。目前临床上广泛使用的标志物包括癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(carbohydrate antigen, CA)等，但这些传统生物标志物的特异性和敏感性不足，无法用于胃癌的早期检测，因此需要找到新的易于在临床中应用的生物标志物。

2. 非编码RNA

2.1. 微小RNA (microRNA，miR或miRNA)

microRNA在哺乳动物基因组中广泛存在，平均长度为22~24个核苷酸，是一类重要的小分子内源性单链非编码RNA。大多数microRNA基因位于其他基因的内含子区域，由RNA聚合酶II转录生成[4]。miRNA在细胞发育、分化、增殖、凋亡和基因组稳定等方面发挥作用[5]。研究发现miRNA可以作为肿瘤抑制因子或癌基因直接参与肿瘤的发生[6] [7]，也能通过调节肿瘤微环境中其他细胞的功能，制造出有利于癌细胞生长和逃避免疫反应的微环境[8] [9]。现有研究发现肿瘤相关的miRNA在多种癌症中表达增加[10]-[13]，并且可以在血浆或血清中检测到。Tian W等人[14]发现胃癌患者血清中miR-181、miR-652表达水平显著高于良性病变者和健康对照者，晚期胃癌患者血清miR-181、miR-652显著高于早期胃癌患者。随后它们通过ROC曲线评估miR-181、miR-652、CA72-4诊断胃癌的效能。结果显示，miR-181、miR-652、CA72-4的ROC曲线下面积分别为0.820、0.842、0.769，miR-181的敏感性、特异性分别为83.6%、78.5%，miR-652的敏感性、特异性分别为86.2%、80.4%，均高于CA-72-4。当miR-181、miR-652、CA72-4联合使用时AUC可提升到0.917，敏感性为92.5%，特异性为86.8%。以上结果说明血清miR-181、miR-652在区分胃癌患者与健康对照者时具有较高的诊断价值，可能具备一定的早期诊断能力，未来应该在更大样本量(包含早期胃癌人群)的研究中进一步验证。He L等[15]通过实时荧光定量PCR (Real-Time PCR, RT-PCR)技术测定了40名胃贲门癌患者和40名健康对照者血清中miR-21水平，发现胃贲门癌患者血清miR-21水平为健康对照者的3.5倍。他们的研究还发现血清miR-21水平与肿瘤分期显著相关，这表明miR-21可能是早期诊断胃癌的生物标志物。虽然血清miR-21与肿瘤分期有显著的相关性，但还需通过后续的研究评估它的诊断效能。Murano T等[16]将123名胃癌患者和132名健康对照者的血清进行血清miRNA胃癌早诊试剂盒(GASTROClear)分析评分，结果提示癌症患者G评分显著高于健康对照者，而且胃癌II~IV期G评分中位数显著高于I期样本。他们使用ROC曲线评估GASTROClear区分胃癌与健康者以及早期胃癌与健康者的效能。结果显示，截断值为37时GASTROClear诊断胃癌的AUC为0.80、敏感性为70.9%、特异性为75.4%，诊断TNM I期胃癌(UICC分类)的AUC为0.74、敏感性为61.70%，当其与Hp-Ab、胃蛋白酶原联合使用时AUC、敏感性、特异性分别为0.879、70.9%、86.9%。GASTROClear在早期胃癌的诊断方面有较好的诊断性能，但单独使用时敏感性较低，与其他标志物的联合使用能提升其诊断效能。这表明microRNA是一类有潜力的胃癌早期诊断的生物标志物。

2.2. 长链非编码RNA (Long Non-Coding RNA, lncRNA)

lncRNA是指长度超过200个核苷酸的转录[17]，广泛参与基因表达、表观遗传调控、转录等重要的生理过程[18]-[20]。现有的研究发现在肺癌、乳腺癌、直肠癌患者的血浆中可以稳定地检测出异常表达的lncRNA [21]-[24]。Liang H等人[25]评估了100名胃癌患者、90名健康对照者血浆中lncRNA XIST、lncRNA-ZFPM2-AS1的表达水平，运用ROC曲线比较它们与传统标志物(CEA、CA19-9、CA12-5、CA15-3、CA72-4)的诊断价值。结果提示胃癌患者血浆中XIST、ZFPM2-AS1水平显著升高，血浆XIST、ZFPM2-AS1的AUC值分别为0.68、0.62，诊断价值高于CA19-9、CA12-5和CA15-3。他们还发现IV期患者血浆中ZFPM2-AS1表达水平显著高于I期患者，肿瘤有远处转移者血浆XIST水平高于无远处转移者。血浆XIST、ZFPM2-AS1可能是胃癌早期诊断的潜在生物标志物，但它们的AUC值相对较低，还需要进一步验证和研究与其他标志物联合使用的诊断价值。

2.3. 环状RNA (circularRNA, circRNA)

circRNA是一类具有共价闭合环结构的新型RNA，是稳定、保守、非随机的RNA剪接产物[26]，广泛存在于人体的血清、血浆及其他体液中[27] [28]。circRNA在转录、转录后和翻译水平发挥调控基因表达的功能[29] [30]。circRNA被发现在癌症的生长、转移、复发以及耐药等过程中发挥作用[31]。目前的研究表明许多circRNA在GC中存在异常表达并且可能与胃癌的发生、进展相关[32]-[34]。Yuan W等人[35]测定104名胃癌患者和64名健康者、35名胃炎患者血清中hsa_circ_0000702水平，评估其表达水平在这三组中有无差异。结果显示，胃癌患者血清中hsa_circ_0000702水平显著低于健康对照者和胃炎患者。他们后续的研究发现血清hsa_circ_0000702水平与胃癌的分化程度以及TNM分期相关，说明该标志物的表达水平与肿瘤进展有关联。随后他们通过ROC曲线评估hsa_circ_0000702、CEA和CA19-9的诊断价值，结果显示hsa_circ_0000702的AUC值为0.74、敏感性为82.69%、特异性为48.49%，且三者联合使用时AUC值为0.781，敏感性为84.62%。这表明hsa_circ_0000702能够较好地区分胃癌患者与健康对照者但特异性不足，与其他标志物联合使用可以进一步提高诊断效能。hsa_circ_0000702可能是胃癌早期诊断的潜在生物标志物，还需要在大规模的研究中进一步验证。

2.4. tRNA衍生RNA (tsRNAs)

tsRNAs由成熟的转运RNA (tRNA)或其前体(pre-tRNA)产生，根据其来源tRNA或pre-tRNA上不同的切割位点可分为两大类：tRFs和tiRNAs。近年来随着不断的研究，tsRNAs被发现在细胞增殖、病毒逆转录起始、基因表达调控、DNA损伤反应调控、肿瘤调控等方面发挥重要的作用[36] [37]。20世纪70年代tsRNAs就被发现是诊断泌尿系统肿瘤的标志物[38] [39]。近年来的研究发现tsRNAs不仅在肿瘤中呈现差异性表达，还参与调控肿瘤的发生和进展[40]。而且tsRNAs广泛存在于人类的体液中，因此tsRNAs可能是诊断癌症的标志物[41] [42]。Yu X等人[43]测定120名健康者、48名良性病变者、48名癌前病变患者、72名早期胃癌患者血浆中tRF-27的水平，并分析各组患者血浆tRF-27表达水平的差异。结果显示，早期胃癌患者血浆tRF-27水平高于健康对照者。随后，他们使用ROC曲线评估了tRF-27在区分胃癌患者与健康对照者中的诊断效能，结果显示tRF-27的AUC为0.7767、灵敏性62.26%、特异性为89.17%。Zhang Y等[44]发现胃癌组织中tRF-23-Q99P9P9NDD表达水平显著高于癌旁组织，随后测定了124例胃癌患者、50例胃炎患者、119例健康者血清中tRF-23-Q99P9P9NDD的水平，发现胃癌患者血清tRF-23-Q99P9P9NDD水平显著高于健康对照者和胃炎患者，健康对照者、胃炎患者血清tRF-23-Q99P9P9NDD水平的差异无统计学意义。进一步研究发现血清tRF-23-Q99P9P9NDD水平随着浸润深度增加而增加III~IV期胃癌患者血清tRF-23-Q99P9P9NDD水平高于I~II期患者。他们纳入82名早期胃癌患者、119名健康患者评估tRF-23-Q99P9P9NDD的诊断效能。结果显示tRF-23-Q99P9P9NDD的AUC为0.724、敏感性为60%、特异性为85%，与CEA、CA19-9、CA72-4联合使用时AUC、敏感性、特异性分别为0.819、78%、48%。Gu X等人[45]发现胃癌细胞中tRF-17-WS7K092表达增加，随后测定136名胃癌患者、40名胃炎患者、136名健康对照者血清tRF-17-WS7K092s水平，发现胃癌患者血清tRF-17-WS7K092水平显著升高且与T分期、TNM分期、淋巴结转移正相关。他们采用ROC曲线评估tRF-17-WS7K092区分胃癌与健康对照者的效能，结果显示tRF-17-WS7K092的AUC为0.819、灵敏性为77%、特异性为84%。tRF-27和tRF-23-Q99P9P9NDD在灵敏性方面相对较低，需要继续研究它们与其他标志物联合使用的诊断效能。tRF-17-WS7K092能较好地区分胃癌患者与健康对照者，需要在更大规模样本的研究中验证。以上结果说明tsRNAs是一类潜在的胃癌早期诊断的生物标志物。

3. 蛋白质

传统的鉴定癌症相关蛋白类标志物的方法主要侧重于对单一肽段和蛋白质的检测。现有的研究[46]证明遗传和表观遗传改变的积累会导致蛋白质表达的变化，进而引起肿瘤的发生和进展。此外，在肿瘤发生后的克隆进化过程中每次细胞分裂平均有1到10次基因突变[47]，该过程会导致某些蛋白质的结构和功能发生改变，从而影响肿瘤的进展。因此单一肽和蛋白质在肿瘤的发生、进展过程中的重要性降低。新兴的蛋白质组学技术对连续的血清或血浆样本进行评估，能够更全面地揭示肿瘤生物学所涉及的生物变量全貌[48]。目前的研究成果表明蛋白质组学方法可以用于新型胃癌早期诊断标志物的探索[49]-[51]。Guo D等[52]运用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对25名早期胃癌患者、25名进展期胃癌患者、25名慢性胃炎患者的胃黏膜组织样本中差异表达的蛋白质进行分析，发现早期胃癌胃黏膜中PRTN3表达水平显著高于慢性胃炎患者和进展期胃癌患。他们通过PRM实验进一步确认了PRTN3在早期胃癌胃黏膜中显著升高，慢性胃炎和进展期胃癌组之间PRTN3表达的差异不显著。这说明PRTN3可能是潜在的诊断早期胃癌的生物标志物。Chen W等人[53]通过iTRAQ技术检测早期胃癌、进展期胃癌、慢性胃炎患者胃黏膜蛋白质，之后进行通路与蛋白质的网络分析发现FGA、FGB和FGG蛋白质参与了早期胃癌阶段的特异性通路。最后通过PRM技术以及临床验证确定早期胃癌患者胃黏膜中FGG水平明显高于进展期胃癌组和慢性胃炎组，而且进展期胃癌组与慢性胃炎组FGG水平差异无统计学意义。这说明FGG可能是早期胃癌诊断的潜在生物标志，其诊断早期胃癌的潜力还需进一步验证。因此蛋白类标志物可以用于胃癌早期诊断。

4. 细胞因子

免疫细胞和某些非免疫细胞分泌的一类具有生物活性的小分子蛋白质被称为细胞因子，具有调节固有免疫和适应性免疫，促进细胞生长和组织修复，调节细胞增殖、分化和迁移，维持内环境稳定以及激发炎症反应等功能[54]。细胞因子为不同的细胞提供炎性或抗炎性信号，各类细胞也可以释放或激活细胞因子以影响细胞活性[55]，这种效应促进炎性肿瘤微环境(TME)的形成。有研究表明，TME的形成与肿瘤的增殖与转移相关[56]。研究表明，某些趋化因子及其特异性受体可能是诊断胃癌的生物标志物[57]。Liu CT等人[58]运用ELISA (酶联免疫吸附测定)技术检测胃癌患者和健康对照的血清IGFBP7水平，并将之分为训练队列(包括169名胃癌患者、100名正常对照者)和验证队列(包括55名胃癌患者、55名正常对照者)。结果显示在训练队列和验证队列中胃癌患者血清IGFBP7水平均低于健康对照者，早期胃癌与其他胃癌患者血清IGFBP7水平没有明显差异。并且用ROC曲线评估血清IGFBP7用于诊断早期胃癌的效能，训练队列的AUC为0.774，截断值为1.515 ng/ml时，特异性为90%，敏感性为36.7%，验证队列中AUC为0.758，敏感性为34.5%，特异性为85.5%。血清IGFBP7的敏感性较低，但特异性高，需要在后续的研究中进一步研究它与其他标志物联合诊断的效能。因此血清IGFBP7是潜在的胃癌早期诊断的生物标志物。Bademler S等[59]使用ELISA技术测定64名胃癌患者和40名健康对照者血清中CCR5、CCL5、PDGF-BB、EphA的水平，发现胃癌患者血清CCR5、PDGF-BB、EphA水平明显高于健康对照者，两组间血清CCL5水平没有明显差异。该研究通过ROC曲线评估了CCR5、PDGF-BB、EphA在区分胃癌患者与健康对照者中的效能。结果显示，CCR5的AUC为0.71、敏感性为94.2%、特异性为42.5%，PDGF-BB的AUC值为0.92、敏感性为91.3%、特异性为77.5%，EphA的AUC值为0.83、敏感性为91.3%、特异性为67.5%。这说明血清CCR5、PDGF-BB、EphAq可能是潜在的胃癌早期诊断的生物标志物。综上所述细胞因子是一类早期诊断胃癌的生物标志物。

5. 细胞外囊泡

国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)将细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)定义为是指由细胞释放的被脂质双层包裹，且不能自主复制(即不含有功能性细胞核)的颗粒。根据生物发生途径的不同，EVs常常被分为凋亡小体、微囊泡、外泌体。EVs广泛存在于多种生物体液中，如血浆、血清、尿液、胃液和唾液。EVs内含有多种分子如DNA、mRNA、非编码RNA以及蛋白质等，能够发挥供体细胞与受体细胞之间的信号传递的功能 [62]。肿瘤来源的EVs可通过重塑肿瘤微环境、促进肿瘤进展、促进肿瘤转移以及免疫逃逸等方式，参与肿瘤的发生发展过程 [64]。已有研究指出，EVs中所含分子有潜力成为癌症筛查的标志物 [65]。Gu X等人[66]运用五种Cy5 (MUC1、EpCAM、PTK7、CD63、PD-L1)和BHQ3双标记发夹探针检测92名胃癌患者、96名健康对照者的血清细胞外囊泡，发现胃癌患者细胞外囊泡上MUC1、CD63、PD-L1和EpCAM的表达显著增加。他们通过XGBoost (极端梯度上升)方法构建的五种目标蛋白标志物联合检测胃癌的模型显示出最佳的诊断效能，在独立验证队列中AUC、敏感性、特异性分别为0.935、72.7%、100%，与传统标志物相比能更好区分健康对照组与胃癌患者。以上结果说明胃癌来源的细胞外囊泡区分胃癌患者与健康者有较高的价值，在后续的研究中需要评估其诊断早期胃癌的效能。因此胃癌来源的细胞外囊泡可能是潜在的胃癌早期诊断的生物标志。Yu D等[67]运用双抗体辅助荧光Dynabeads分离检测系统分析胃癌患者、健康对照者血清CD66b+Neu-Exo (中性粒细胞来源的外泌体)水平，并且使用ROC曲线评估27名胃癌患者、27名健康对照者血清CD66b+Neu-Exo的诊断价值。结果显示，胃癌患者中CD66b+Neu-Exo百分比明显高于健康对照组，AUC、敏感性、特异性分别为0.809、77.78%、74.07%。以上结果说明CD66b+Neu-Exo是潜在的早期诊断胃癌的生物标志物。他们的研究还发现miR-223-3p和miR-425-5p在胃癌患者中性粒细胞和Neu-Exo中表达上调，并且通过ROC曲线评估49例健康对照组、36例良性胃病患者和61例胃癌患者血清Neu-Exo中的miR-223-3p和miR-425-5p的诊断价值。miR-223-3p和miR-425-5p的AUC分别为0.806和0.744，联合使用时的AUC、敏感性和特异性分别为0.847、77.05%和75.51%。miR-223-3p和miR-425-5p联合使用区分早期胃癌和健康对照者的AUC为0.747，敏感性为50.00%、特异性为91.60%。这说明血清Neu-Exo来源的miR-223-3p和miR-425-5p是早期诊断胃癌的生物标志物。后续研究使用ddPCR (微滴式数字PCR)技术检测血清Neu-Exo中的miR-223-3p，并且使用ROC曲线评估miR-223-3p区分早期胃癌患者和健康者的效能。结果显示，AUC为0.930、敏感性为100%特异性为79.85%。这说明与qRT-PCR (实时定量反转录PCR)技术相比，使用ddPCR检测Neu-Exo中的miRNAs可以显著提高中性粒细胞外泌体来源的miR-223-3p诊断早期胃癌的效能。综上所述细胞外囊泡及来源于细胞外囊泡的miRNA可以作为胃癌早期诊断的重要生物标志。

6. 小结与展望

近年来，随着对胃癌早期诊断生物标志物的研究逐渐深入和新技术的飞速发展，越来越多的标志物在临床中得到应用，极大地推动了对胃癌发生、进展机制的全面认识。细胞外囊泡、细胞因子、蛋白类标志物、tsRNAs等新型标志物在研究中展现了它们广阔的应用前景。基于机器学习构建的联合标志物检测模型能大幅度提升诊断效能，未来结合临床数据和人工智能方法可以开发出更高效、易于临床应用的诊断工具。尽管在这些方面取得令人鼓舞的成就，但目前还有一些问题需要解决。首先，检测生物标志物技术的高效化、精准化、标准化是提高诊断水平的主要挑战。其次，新型标志物在不同个体、不同种族之间的表达差异尚未明确。此外，患者的基础疾病、药物等因素是否会影响生物标志物的表达，还需进一步研究。最后，应该在大规模的前瞻性研究中进一步验证这些标志物的诊断效能。未来的研究不仅要致力于寻找新的生物标志物，还要解决上述的这些问题，达成推动胃癌早期诊断技术临床转化，提升胃癌早期诊断能力的目标。

7. 讨论与整合

虽然胃癌的发病率、死亡率在不断降低，但胃癌的早期诊断仍然是目前临床研究的重要课题。随着分子生物学技术的飞速发展，越来越多的新型标志物被发现。它们在胃癌早期诊断中展现不同的优势，但也在临床应用中面临着不一样的挑战。miRNA在胃癌发生、进展过程中的作用得到了全面的研究，并且具有高度稳定性。然而，miRNA的特异性较差，而且在不同个体和不同肿瘤亚型之间的表达差异较大，这限制了其在胃癌早期诊断中的应用。现在已经发现lncRNA能够通过多种机制调控肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，与miRNA相比，lncRNA具有更高的组织特异性。由于lncRNA在胃癌的发生、发展过程中具有复杂的功能，使得关于它的研究成果有较大的不确定性，从而影响lncRNA在胃癌早期诊断中的应用。现有的研究表明circRNA在胃癌组织中异常表达，而且具备耐热和耐酶降解的特点，这使它有成为胃癌早期诊断标志物的潜力。但是circRNA的检测方法复杂，尚未形成标准的检测流程，进而影响了circRNA在临床中的大规模应用。tsRNAs在胃癌中的表达变化明显，且具有较高的稳定性和特异性。但是tsRNAs的功能和机制尚未得到全面的研究，而且其早期诊断胃癌的效能缺乏大规模临床数据的验证。蛋白质标志物已经广泛应用于临床，而且检测技术成熟、便于检测，但蛋白质标志物的灵敏度和特异性较差，容易受到胃溃疡、炎症性肠病等疾病的干扰，影响胃癌的诊断。细胞因子能够反映肿瘤的免疫反应，但其特异性较差，容易受到其他免疫系统疾病的干扰。细胞外囊泡，尤其是外泌体及来源于外泌体的miRNA、蛋白质等分子成为近年来的研究热点。外泌体具有较高的稳定性，可以通过非侵入性的方式进行检测，显示出较大的临床应用潜力。然而，细胞外囊泡的提取与纯化技术仍面临挑战，而且异质性可能会影响诊断的准确性。

基于现有的研究成果，未来的研究应该主要集中两方面。第一，将非编码RNA、蛋白质、细胞外囊泡等多种类型的标志物联合使用，通过机器学习构建出高灵敏度、高特异度的诊断模型，弥补单一标志物诊断效能不足的问题。第二，基于多类型标志物联合诊断模型结合人工智能等技术开发诊断平台，排除患者基础疾病的干扰，优化诊断流程，帮助临床医生精准地找出潜在的胃癌患者。随着多种新型生物标志物的发现和技术进步，胃癌的早期诊断逐渐走向精准化。然而，单一标志物特异性差、检测技术尚未标准化依旧是未来的研究中需要关注的重要问题。未来胃癌早期诊断相关标志物的发展将依赖于多学科的合作，尤其是与人工智能的结合，为胃癌早期诊断带来新的希望。