1. 引言
记忆损伤是多种神经系统疾病的一个标志性特征。在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)这种典型的进行性神经退行性疾病中，记忆损伤是最早的临床表型之一[1]-[4]。虽然已经提出了多种AD病理生理学假设(例如，tau过度磷酸化和淀粉样蛋白级联反应等)，但记忆障碍背后的直接分子机制仍未完全探索清楚[5]。
丙酮醛，又称甲基乙二醛(Methylglyoxal, MGO)是一种源自葡萄糖代谢的活性二羰基代谢物，主要通过乙二醛酶系统代谢[6]。研究发现MGO具有强大的神经毒性特性[7]，早起研究就发现AD患者的MGO水平高于对照组，并且MGO在脑脊液中的浓度是血浆中的5~7倍[8]，多项研究发现MGO能够显著影响记忆[9] [10]。作为晚期糖基化终产物(AGE)的主要前体之一，MGO被认为可能通过引起RAGE上调表达并引发神经细胞炎症过程，同时MGO能还引起PSEN1的上调表达影响Aβ累积[10]。同时也有研究证据表明，MGO及其晚期糖基化终产物都通过加剧淀粉样蛋白β聚集和tau蛋白病变来促进AD的发病机制[11]。此外，MGO可增强Aβ寡聚物诱导的神经元细胞凋亡[12]。然而，MGO破坏突触可塑性和记忆的确切机制尚未确定。特别是，miRNA失调在MGO介导的认知能力下降中的作用仍未得到深入探索。在本研究中，我们提供了初步证据，证明MGO诱导的记忆障碍与神经元中的特定miRNA介导的转录后调控密切有关，并通过调控内质网应激(ERS)关键蛋白CHOP影响神经细胞的凋亡过程。本研究结果为进一步理解MGO引起的记忆损伤及其治疗新策略奠定了良好的理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 实验使用细胞与动物
本研究使用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y, ATCC)，使用如下完全培养基DMEM培养基 + 10% FBS + 1% P/S，培养环境保持95%空气 + 5% CO2。
实验使用8周龄SD大鼠(购自北京斯贝福生物技术有限公司)，体重(200 ± 20) g，饲养于广东医科大学附属医院动物实验中心的标准SPF级动物房。饲养条件：4只/笼，12小时昼夜节律光照，温度20℃~24℃，相对湿度(55 ± 5)%，动物自由活动，给予标准饲料，自由饮水。所有实验和程序都是在广东医科大学动物伦理委员会批准指导下进行(动物伦理许可编号：GDY2102178-1)。
2.2. 动物手术与给药方法
将SD大鼠麻醉后，取俯卧位将大鼠头部固定在脑立体定位框架上，手术刀沿正中线打开头部皮肤暴露头骨，标记Bregma点；以前卤Bregma点为原点，向后囟方向1.1 mm，旁开1.5 mm，使用牙钻在头骨上打一个小孔，植入不锈钢注射套管(Reward Life Technology，中国深圳)约深4.5 mm深。在此孔周围另打两个小孔拧上小螺丝，然后用牙科水泥一起固定后缝合皮肤。术后将SD大鼠单独饲养，每天注射80,000单位青霉素以防感染，连续注射三天。术后5天将SD大鼠随机分为两组(n = 6只/组)，一组动物通过微型注射器注射MGO (0.5 μmol/μL × 5 μL/day)，注射后将微量注射器留在原位5分钟，以确保注射物质完全吸收，注射结束后小心取出注射器针头盖上注射管旋盖，连续注射6天。另一组利用同样方式注射生理盐水作为对照。
2.3. MGO处理细胞凋亡检测
SH-SY5Y细胞用于MGO毒性检测。我们之前的研究表明，MGO对SH-SY5Y细胞具有剂量依赖性抑制作用，并且用1 mM MGO处理24小时后细胞活力下降至63.6% (数据未发表)。本研究将终浓度1 mM MGO加入SH-SY5Y细胞培养基中，24小时后通过流式细胞术测定细胞活力。
2.4. RNA提取与转录组检测
使用miRNeasy血清/血浆试剂盒(QIAGEN)从样品中提取总RNA。RNA文库构建和测序由Majorbio (中国)进行，对于miRNA表达分析，具有显着表达变化(p < 0.05)和倍数变化大于2.0的miRNA被鉴定为差异表达。
2.5. 转染
利用Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen，美国)将靶分子(miRNA)转染到细胞，操作过程参阅使用说明。转染后48小时收获细胞以进行后续测定。
2.6. 双荧光素酶实验
将细胞接种在24孔板中，孵育24小时，然后根据操作说明，利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美国)将Pezx-MT06荧光素酶报告载体(iGeneBio，中国)和miRNA共转染至细胞内。48小时后，通过双荧光素酶报告基因测定试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)测量萤火虫荧光素酶活性，肾荧光素酶作为标准化内参。
2.7. 蛋白质印迹实验
采用基于RIPA缓冲液的提取从细胞中提取蛋白，通过BCA试剂盒(Beyotime生物技术研究所)测定蛋白质定量。蛋白质裂解物通过SDS-PAGE分离，并通过电泳转移到PVDF膜(Millipore)上。随后在室温下将膜封闭在5%脱脂牛奶/TBST溶液中1小时，然后与特异性一抗(抗FoxO1, Cell Signaling Technology, #2880; 1:1000)在4℃下孵育16小时。TBST洗涤后，使用HRP偶联的二抗(1小时，室温)开发免疫反应条带，并使用化学发光底物(LumaxLight Superior，ZETA Life，美国)和凝胶成像系统进行检测。
2.8. 水迷宫实验
采用Morris水迷宫(MWM)评估大鼠的空间记忆。MWM测试按照标准操作程序进行，逃逸潜伏期和在先前记录平台的位置游泳的时间用作空间记忆保留的衡量标准。
3. 结果
3.1. MGO损伤大鼠记忆并引起脑内miRNAs差异表达
大鼠侧脑室MGO处理后4周利用水迷宫进行动物行为学测试，结果显示MGO处理造成大鼠在水中潜伏期以及水中总时间显著增加；提示MGO处理导致显著记忆损伤(图1(A)~(C))。利用全转录组检测MGO处理后的大鼠脑组织内RNA表达水平，筛选到一系列差异表达的miRNAs，包括显著下调表达miRNAs共10条，显著上调表达的miRNAs共7条(图1(D)，图1(E))。
Figure 1. Screening of miRNAs related to memory damage caused by MGO-treated rats in lateral ventricle
图1. 侧脑室MGO处理大鼠引起记忆损伤相关miRNAs筛选
3.2. 差异表达miRNAs靶基因筛选与靶向结合关系验证
筛选显著下调表达的两个miRNAs，利用targetscan在线软件预测其靶基因，发现miR-96-5p与miR-183-5p均可靶向DDIT3基因，该基因编码CHOP蛋白，与细胞死亡关系密切。随后我们利用双荧光素酶试验验证miR-96-5p与miR-183-5p均可特异性抑制包含DDIT3基因3’端mRNAs片段质粒转录水平，造成荧光强度显著下降(图2)。提示miR-96-5p与miR-183-5p可靶向调控CHOP蛋白表达水平。
Figure 2. Dual luciferase verified the binding relationship between miR-96-5p/miR-183-5p and the target gene DDIT3, *p < 0.05
图2. 双荧光素酶验证miR-96-5p/miR-183-5p与靶基因DDIT3结合关系，*p < 0.05
3.3. miR-96-5p/miR-183-5p抑制CHOP等细胞凋亡相关蛋白表达
利用western Blot检测SH-Y5Y细胞转染目标miRNAs后CHOP蛋白表达水平，结果表明miR-96-5p与miR-183-5p可单独或联合抑制SH-Y5Y细胞CHOP蛋白表达水平(图3)。同时检测转染miR-96-5p与miR-183-5p后SH-Y5Y细胞凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2、以及PARP的表达水平，结果表明转染miR-96-5p/miR-183-5p后，BAX与PARP蛋白水平显著下调，而Bcl-2蛋白水平则显著上调表达(图3)。提示miR-96-5p与miR-183-5p抑制CHOP蛋白表达后，细胞内促凋亡蛋白表达水平显著下调，而抗凋亡蛋白表达水平则相应上调表达；表明miR-96-5p与miR-183-5p具备抗细胞凋亡特性。
Figure 3. Western blot detects the expression levels of apoptosis-related proteins in SH-Y5Y cells after transfection with miR-96-5p and miR-183-5p, *p < 0.05
图3. 利用western blot检测SH-Y5Y细胞转染miR-96-5p与miR-183-5p后凋亡相关蛋白表达水平变化，*p < 0.05
3.4. miR-96-5p/miR-183-5p抑制SH-SY5Y凋亡
SH-Y5Y细胞转染目标miRNAs后，检测细胞凋亡水平，镜下观察并使用流式细胞仪检测发现，SH-Y5Y细胞转染miR-96-5p与miR-183-5p显著抑制细胞凋亡水平。尤其是同时转染miR-96-5p与miR-183-5p后，细胞凋亡水平从近40%下降到12.9% (图4)。提示细胞内高表达miR-96-5p与miR-183-5p可能通过抑制CHOP蛋白水平从而降低细胞凋亡水平。
4. 讨论与结论
甲基乙二醛(MGO)是一种反应性糖酵解副产物，以往研究表明MGO在神经退行性疾病中发挥至关重要的作用[13] [14]。先前的研究报道了MGOs可以诱导神经元和微血管内皮细胞死亡[12] [15] [16]，但详细机制尚不清楚。在本研究中，我们发现MGO诱导的两种显著下调表达的miRNA (miR-96-5p和miR-183-5p)
Figure 4. The apoptosis level of SH-Y5Y cells changed after transfection with target miRNAs
图4. SH-Y5Y细胞转染目标miRNAs后，细胞凋亡水平变化
可以调节神经元中的CHOP蛋白水平。CHOP是内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)的标志物，ERS触发未折叠蛋白应答(unfolded protein response, UPR)，通过减少蛋白质翻译来恢复体内平衡，如果损伤无法修复，则诱导细胞死亡[17]-[19]；因此，CHOP被视为ERS相关凋亡蛋白标志之一[20]，并且以往研究发现ERS与几乎所有神经系统和神经退行性疾病有关[17]。在我们的体外研究中，利用miR-96-5p和miR-183-5p抑制CHOP后，促凋亡蛋白BAX以及PARP蛋白的表达水平均显著下调，而细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平则显著上调表达，尤其在同时转染miR-96-5p和miR-183-5p后，SH-SY5Y细胞内Bcl-2蛋白表达水平显著提高，导致MGO诱导的细胞死亡率显著降低。本研究证据表明，miRNA介导的转录后调控可能在MGO诱导的ERS相关细胞死亡过程中发挥重要作用，该作用可能通过特异性调控细胞内CHOP蛋白表达水平而实现。
最近也有研究发现一种在大豆中发现的异黄酮化合物(染料木黄酮)可以通过ERS介导的凋亡途径减轻AD的记忆障碍[21]，这表明ERS介导的细胞凋亡在AD过程发挥关键作用。此外，研究发现AD发病过程的毒性因子Aβ也可以通过XBP-1和CHOP的上调激活ERS，影响内皮细胞并损害血脑屏障[22]加剧AD进展。最近一项研究表明Mangiferin (一种天然C-葡糖基黄酮)以剂量依赖性方式显著抑制甲醛诱导的鼠海马细胞(HT22) Tau过度磷酸化，同样是通过减弱甲醛诱导的ERS来实现的，主要表现为抑制ERS标记蛋白GRP78和CHOP以及下游Tau相关激酶(GSK-3β和Camkii) [23]。因此，miR-96-5p/miR-183-5p~CHOP调控的细胞ERS与细胞内Aβ累积以及Tau蛋白磷酸化过程密切相关，在AD发病过程发挥关键作用，可能成为治疗AD等疾病的潜在靶点。
虽然本研究发现了两种通过调控CHOP蛋白影响细胞凋亡的miRNAs，并在体外试验中验证其能够显著抑制MGO引起的细胞凋亡现象。但是，本研究证据并不能证明MGO引起记忆损伤的作用完全是由miR-96-5p和miR-183-5p来介导的，仍然不能排除MGO通过另外的通路影响记忆损伤的可能，确切的作用机制还需要更进一步的研究证实。此外，本研究发现miR-96-5p和miR-183-5p可在体外显著抑制神经细胞的凋亡，但是能否在体内改善MGO引起的神经细胞凋亡从而改善其记忆损伤也尚未获得切实的证据。作为本研究项目的进一步延伸探索，进一步探索合适的方法利用miR-96-5p和miR-183-5p治疗MGO引起的记忆损伤的动物实验是可行的。相信上述研究将会对进一步理解MGO引起记忆损伤的机制及其相关的治疗策略大有裨益。
基金项目
本研究受到以下科学研究基金项目资助：广东省医学科学技术研究基金项目(项目编号：A2020376)；湛江市科技计划项目(项目编号：2021A05249, 2022A01169)；广东医科大学附属医院高层次人才科研启动项目(项目编号：GCC2022021)。
NOTES
*通讯作者。