肝脏缺血再灌注损伤机制的研究进展

Research Progress on the Mechanism of Liver Ischemia Reperfusion Injury

摘要: 缺血再灌注损伤是指组织或器官在缺血后紧接着得到血液供应，但是此时血液的供应却不利于缺血组织、器官的功能恢复，甚至加重了组织代谢的障碍、结构组织的破坏。肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科常见的病理生理现象，特别是肝脏移植和肝叶切除术后影响肝功能的一个重要原因。本文就肝脏缺血再灌注损伤发生机制简单作一综述。

Abstract: Ischemia reperfusion injury refers to the condition where tissues or organs receive blood supply immediately after ischemia, but this blood flow hinders functional recovery and may even exacerbate metabolic disorders and structural damage. Liver ischemia reperfusion injury is a common pathophysiological phenomenon in hepatobiliary surgery, particularly a major factor affecting liver function after liver transplantation and hepatic lobectomy. This article provides a concise review of the mechanisms underlying liver ischemia reperfusion injury.

1. 引言

随着人们对肝脏的解剖和生理功能认知的加深，对于肝脏的重要性及肝病的认知也逐步加深，肝脏疾病的治疗方式也越来越多。肝脏外科技术和手术设备日益提高，使得肝脏手术的安全性得到了一定的提高，但肝脏缺血再灌注损伤仍是影响肝移植和肝脏手术预后的主要原因，其病理生理过程较为复杂。因此，其发生的机制成为医学界关注的热点问题，所以弄清楚缺血再灌注损伤的机制则显得尤为重要。

2. 肝缺血再灌注损伤的发生机制

2.1. 无氧代谢与pH悖论

缺血缺氧时，线粒体内氧化磷酸化受到抑制，ATP主要来源于糖酵解，ATP明显减少，依赖于ATP的各种细胞活动将停止。无氧代谢，细胞内乳酸堆积，线粒体氧化磷酸化低下，导致pH值降低，减少磷脂酶，蛋白酶对细胞的损伤，再灌注后，pH值恢复，pH依赖酶类活性增强，加重细胞缺血再灌注损伤，称为pH悖论(pH Paradox) [1]，以酸性pH再灌注或控制再灌注后细胞内pH升高可预防缺血再灌注损伤引起的肝细胞坏死。相反，促进再灌注后细胞内pH恢复则可加重细胞坏死。

2.2. 代谢性酸中毒

代谢性酸中毒往往发生在人体产生过多的酸以及肾脏无法把多余的酸排出体外的情况下。它和缺血缺氧密切相关，是缺血再灌注损伤中最基本的机制[2]。酸中毒往往发生在无氧酵解时，由于肝脏迅速消耗了三磷酸腺苷(ATP)，从而产生大量乳酸以及酮体。组织的pH值降低可以抑制磷脂酶和蛋白水解酶，从而减少细胞损伤。然而，在灌注期间人体的pH值迅速上升，大大增加了这些酶的活性。这将导致大量细胞凋亡和坏死，加重了缺血再灌注所带来的损伤。

2.3. 钙离子超载

一些有害因素可引起钙平衡系统功能失调和钙分布紊乱，导致细胞内钙浓度异常性升高，即钙超载；细胞内钙超载是IRI的重要病理生理机制[3]。多数研究表明细胞内钙超载引起肝细胞损伤的机理是：1) 使磷脂酶C和磷脂酶A₂等Ca²⁺依赖酶激活，使其双分子层结构紊乱，破坏细胞膜、线粒体膜的结构[4]；下调线粒体内钙浓度可减轻肝脏IRI。2) 使Ca²⁺依赖蛋白酶激活，破坏细胞骨架与胞膜连接的完整性而损伤细胞[5]。3) 线粒体钙超载可引起严重能量代谢障碍，并促进氧自由基大量产生，对细胞产生不可逆的损伤。

2.4. 内皮素与一氧化氮NO内皮素(Endothelins, ET)

ET是血管内皮细胞分泌的肽类物质，有强力的收缩血管作用，引起肝脏微循环功能障碍；而NO是由血管内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等多种细胞分泌的介质，它能舒张血管、抑制血小板聚集、抑制白细胞与内皮细胞黏附，拮抗ET作用。HIRI期间血浆NO水平持续下降，ET水平逐渐升高，二者呈显著负相关，且随缺血再灌注时间的延长，二者相关性增强。

2.5. 无流现象

缺血再灌注将导致许多肝脏微循环区域血流的完全停止[6]。这种现象被叫做无流是缺血的再继续，其机制可能与细胞凋亡、坏死有关，尤其是肝窦内皮细胞的凋亡、坏死有关。

2.6. Kupffer细胞的活化

Kupffer细胞在肝脏IRI病理生理机制中发挥核心作用。再灌注过程由2个阶段组成：初期肝脏中活化的巨噬细胞和Kupffer细胞产生大量ROS，诱导氧化应激；后期(再灌注后6~24 h)中性粒细胞聚集，释放可直接引起组织损伤的炎症介质。Kupffer细胞活化导致ROS的产生和释放以及炎症级联反应，包括释放促炎细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-2、IL6和高迁移率族蛋白1 (high mobility group protein1, HMGB1) [7]。与此同时，NO水平降低，使来自eNOS的内皮素-1和NO间的平衡打破，导致肝血窦血管细胞收缩。肝血窦内皮细胞间隙的缩小导致血小板和中性粒细胞聚集，进而释放氧化物和蛋白酶导致肝细胞损伤。另外，ROS在内皮细胞和肝细胞中激活氧化还原敏感性转录因子AP-1和NF-κB。HMGB1是一种DNA结合蛋白，由非实质肝细胞(Kupffer细胞和内皮细胞)和嗜中性粒细胞主动分泌或坏死性肝细胞被动释放，可诱导炎性信号级联反应。正常大鼠HMGB1主要存在于肝细胞核中，大鼠肝脏部分热缺血60~90 min后，HMGB1从细胞核转移到细胞质，并在再灌注后1 h内释放到血液循环中；肝脏热缺血期间，HMGB1水平随固有免疫激活而增加，并持续反应24 h [8]。事实上，肝脏再灌注期间发生的炎症主要由固有免疫主导，其可能诱发肝脏实质和非实质细胞热IRI。Kupffer细胞激活后常见的CD⁴⁺T细胞也可被激活，在再灌注后1 h内积聚于肝脏，可导致肝细胞和LSEC损伤，最终导致肝细胞坏死[9]。

2.7. 线粒体损伤

线粒体损伤也是IRI的主要潜在损伤机制之一。有研究表明，线粒体超氧化物于热缺血组织再灌注时期产生，主要由细胞内氧化呼吸链复合体Ⅰ的逆电子传输(reverse electron transport, RET)产生，可引发IRI [10]。RET具有独特的生理作用，是线粒体通过逆行氧化还原信号快速传达其状态的途径。ＲET使线粒体的2个核心功效结合：通过辅酶Q还原电位感测呼吸链的电子供应，以及由质子动力势能的大小反映ATP需求。因此，当线粒体无活性并且过量供应电子时，线粒体ＲET将被加速，当线粒体处于高活性时ＲET速度最小化。超氧化物将转化为过氧化氢，其可扩散至以修饰氧化还原性蛋白质硫醇作为氧化还原信号的胞质溶胶。在热IRI中，这种信号通路过度激活将导致氧化应激损伤[10]。

此外，核因子E2相关因子2 (nrythrocyte related factor-2, Nrf2)也是近年来该通路中较为热门的研究对象。Nrf2是细胞抗氧化防御系统的主调节器，激活Nrf2可促进细胞生长和存活，并有助于在氧化应激损伤中启动细胞保护作用；抑制Nrf2则可促进高氧条件下引起的急性器官损伤和氧化应激介导的炎症细胞损伤[11]。此外，抑制Nrf2还会损害血管内皮细胞生成能力并减少抗氧化基因表达，导致心脏肥大，增加心肌纤维化和细胞凋亡。因此，Nrf2对防御氧化应激至关重要，并且可能是调节器官损伤炎症反应、抗氧化应激的决定性分子。有学者已经确定Nrf2-Akt-FoxO1轴是IRI肝脏炎症反应的调控通路，Nrf2的激活减少巨噬细胞/中性粒细胞聚集，增强抗凋亡功能，并在抑制FoxO1信号时增加HO-1和信号转导及转录活化因子3表达，最终改善肝脏热IRI，这项研究揭示了PI3K-依赖型通路和Nrf2-Akt-FoxO1综合信号网络之间的交互作用以及TLR4介导的固有免疫反应[12]。

2.8. LSEC损伤

LSEC是一种特异的内皮细胞，具有成百上千直径100~150 nm的小孔，渗透性较强，为肝脏血流在内皮下的开放通道，在肝脏再生、肝脏纤维化和肝脏肿瘤细胞转移等过程中起到重要作用[13] [14]。总体上，肝脏热IRI可概括为微循环障碍和内皮功能障碍。在肝脏热IRI早期(再灌注后2 h内) LSEC是主要的损伤位点[13] [14]，也是早期微循环炎症细胞浸润的主要场所。Hide等[15]研究发现，热IRI可导致大鼠肝脏热IRI模型中肝脏微循环及内皮细胞功能障碍，减少Kruppel样因子2 (Kruppel-like factor 2, KLF2)表达，降低一氧化氮(nitricoxide，NO)生物利用度，促进肝脏炎症反应和细胞凋亡。热IRI后期(再灌注后6~48 h)以多核中性粒细胞介导的肝脏实质细胞炎症反应为主，激活核转录因子(nuclear factor kappa B, NF-κB)，诱导多种促炎趋化因子、细胞因子和黏附因子的转录。Toll样受体-4 (toll like receptor-4, TLR4)主要表达于肝脏实质细胞，可激活NF-κB，是热IRI中关键的损伤分子[16]。体外细胞实验已经证实，KLF2是层流剪切应力诱导血管内皮细胞表达的转录因子，在肺脏、内皮细胞和淋巴细胞中大量表达，且具有抗炎、抗血栓形成、抗氧化应激、抗凋亡等作用[17]。近年来很多学者通过不同方式上调KLF2表达，研究其对肝脏内皮细胞系统的保护作用及机制[17] [18]。有研究显示[18]，在正常大鼠供肝保存过程中通过药物诱导KLF2表达，其下游内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)和血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)的表达增加，能减少超氧化物、剪切型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3和细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)生成，减轻氧化应激、细胞凋亡和炎症反应。Hide等[15]研究同样表明，在70%大鼠肝脏热IRI模型中，通过药物诱导KLF2表达，能上调eNOS、HO-1和TM的表达，抑制炎性细胞浸润和TLR4表达，改善LSEC功能，减少肝细胞凋亡，减轻肝脏热IRI。因此，上调KLF2表达可有效减轻肝脏热IRI。

2.9. 中性粒细胞

大量研究证明，中性粒细胞在缺血缺氧早期即大量产生，并聚集到肝脏微循环系统中被活化，再灌注时中性粒细胞聚集进一步增加，加重再灌注损伤。其造成细胞、组织或器官损伤的机制：1) 激活的中性粒细胞通过还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶和髓过氧化物酶产生“呼吸爆发”，释放大量的氧自由基，造成肝细胞的损伤；激活的中性粒细胞与血管内皮细胞黏附，促进肝微循环“无复流”现象的产生，进而加重肝细胞损伤。2) 活化的中性粒细胞可通过释放活性氧族(ROS) [4]、蛋白酶，分泌细胞因子，产生血小板激活因子等直接或间接引起肝细胞及细胞外基质的损伤，导致肝功能衰竭。国外的研究发现，用中性粒细胞单克隆抗体预处理的大鼠，肝缺血再灌注后的坏死和ATP减少现象均有明显缓解[19] [20] [21]。

2.10. 细胞粘附分子

ICAM-1属免疫球蛋白超家族又称CD54，为单链跨膜糖蛋白其核心多肽为5500，主要受体为淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)。ICAM-1在肝窦内皮细胞、胸腺树突状细胞及扁桃体上皮细胞等上均有表达。正常时，细胞的ICAM-1呈低表达在细胞因子如IL-1、TNF作用下表达可增加。细胞粘附分子介导的肝缺血再灌注损伤可分为几个阶段：初始粘附、粘附加固、白细胞迁移、引发损伤[22]。经ICAM-1介导的粘附形成白细胞永久结合于内皮细胞的结构更进一步活化白细胞，开始改变细胞移动作用状态，并使这些细胞攻入内皮细胞层引发缺血再灌注损伤[23]。因为在ICAM-1介导下的白细胞与内皮细胞结合不可逆，所以在这一阶段阻断ICAM-1的作用对于减轻肝缺血再灌注损伤具有重要的意义，Wang ZZ [24]应用中药藜芦碱提取液预处理Wistar大鼠，结果表明通过抑制ICAM-1及E-选择素减少，炎症反应而改善肝脏缺血再灌注损伤。应用抗ICAM-1的单克隆抗体可大大减轻肝缺血再灌注损伤、改善肝功能、提高肝窦灌注率、血中AST及ALT水平下降，提高肝脏中的ATP及动物的生存率，并可以大大减少在窦后静脉中的白细胞碎片[25]。

2.11. 内毒素

内毒素水平与移植肝原发性无功能密切相关[26]。肝脏缺血再灌注时，一方面肠源性内毒素可因肠道粘膜屏障损伤而随门静脉血流进入肝脏或随移植物传给受者，另一方面，肝脏对内毒素清除能力减弱，特别是在无肝期，肝脏枯否细胞清除内毒素能力缺乏，均使内毒素水平升高。目前研究表明，内毒素在肝内可激活Kupffer细胞释放多种毒性介质，影响细胞间粘附和肝脏微循环而造成肝脏损伤。此外，缺血再灌注损伤可显著提高机体对内毒素攻击的敏感性，从而为继发性打击起预激作用。关于I/R增强机体对内毒素敏感性的确切机理尚不清楚。近年来的研究表明，CD14是内毒素结合的功能受体，它与脂多糖结合蛋白共同构成机体内毒素一系列生物反应的重要增敏系统[27]。

2.12. 氧自由基

氧自由基的产生再灌注时产生的氧自由基是缺血再灌注损伤的主要原因[28]。氧自由基可在细胞内或细胞外产生，其中线粒体被认为是产生氧自由基的主要场所，另外内质网、溶酶体也可产生氧自由基。再灌注时由于重新提供了氧–黄嘌呤氧化酶的底物，这样就会产生超氧阴离子。在体内黄嘌呤氧化酶的作用是多方面的，最近研究表明缺血后黄嘌呤脱氢酶并不转化成黄嘌呤氧化酶，但这两种酶均从细胞内流出而进人血循环中，再灌注时黄嘌呤脱氢酶迅速转变成氧化酶。黄嘌呤氧化酶粘附于肝窦内皮细胞表面从而导致氧自由基的生成[29]。细胞外另一主要氧自由基的来源是中性粒细胞和枯否细胞膜表面的NADPH氧化酶系统。再灌注时上述氧化酶系统被激活，氧被还原成H₂O₂和O²⁻。大量的氧自由基产生将促进肝实质细胞的凋亡。

2.13. 细胞凋亡

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)是受细胞外微环境和细胞内基因调控的一种细胞主动自杀性死亡方式，细胞凋亡是细胞增殖的反面，也是多细胞生物确保机体正常发育、维持机体正常生理过程所必须的。相反，若凋亡规律失常，将导致许多疾病发生。能量代谢障碍、氧自由基、细胞内钙超载、细胞因子以及早期即刻基因等均可诱导细胞凋亡[30]。有文献报道，再灌注时约50%~70%肝窦内皮细胞和40%~60%肝细胞出现凋亡，缺血再灌注后肝窦内皮细胞较肝细胞出现凋亡的形态学改变早，缺血60 min再灌注1 h时22%肝窦内皮细胞TUNEL染色阳性2%肝细胞染色阳性。经过长时间缺血大部分肝窦内皮细胞和肝细胞染色阳性。随着再灌注时间延长，染色阳性细胞增多，肝窦内皮细胞和肝细胞凋亡可经DNA梯形电泳和电镜证实[31]。以上说明内皮细胞和肝细胞相继凋亡是肝脏缺血再灌注损伤的重要方面。

2.14. 细胞因子

在肝缺血再灌注损伤的病理生理过程中有许多细胞因子参与其中，如TNF-，IL-1，IL-6，补体系统，趋化因子，粘附分子等。这些细胞因子既可通过单个形式也可通过彼此间协同作用引起肝细胞损伤。目前研究较多的是肿瘤坏死因子-α和白细胞介素1。肿瘤坏死因子-α (T umor Necrosis Factor-α, TNF-α)在啮齿类动物的部分肝脏缺血再灌注模型中，再灌注不久即可检测到血浆和肝脏中的TNF-α水平升高。TNF-α直接导致肝窦内皮细胞肿胀；通过中性粒细胞，内皮细胞的相互作用导致肝脏微循环障碍[32]；激活中性粒细胞释放氧自由基；刺激单核巨噬细胞和其它细胞分泌IL-1，IL-6等炎性因子。给予相关抗体能减轻肝脏炎性反应和损伤[33]。白细胞介素1 (Interlukin-1, IL-1)，能够刺激TNF-α的产生；促进中性粒细胞产生氧自由基；能增强肝脏CXC趋化因子的合成，并且能够上调中性粒细胞粘附分子-1，促进这些细胞在肝脏脉管系统内聚集。另外还与TNF-α协同作用于内皮细胞，诱导合成凝血酶及纤维蛋白酶，破坏内皮细胞的细胞骨架。

2.15. 微循环功能障碍

肝IRI引起肝脏微循环功能障碍的机制主要有：1) ET和NO的浓度失衡，引起肝窦内皮细胞收缩，微循环阻力增加；2) 各种因素造成肝窦内皮细胞肿胀、死亡及脱落而阻塞肝窦；3) 血小板活化因子的生成，血小板黏附、聚集引起血管阻塞；4) 粒细胞的黏附、聚集及毒性作用。Andre等[34]提出聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase, PARP]通过触发粘附分子的表达以及调节白细胞，血小板与内皮细胞之间的作用导致肝微循环障碍微循环功能障碍后使得肝血窦血流减少甚至消失，加重肝脏的缺血缺氧，并激活Kupffer细胞及中性粒细胞产生大量炎症介质、细胞因子、氧自由基，进一步加重肝细胞的损伤。

2.16. T淋巴细胞的影响

肝脏缺血再灌注损伤产生的多种细胞因子和化学因子能够直接使Ｔ淋巴细胞活化[35]。活化后数量增多的Ｔ淋巴细胞在肝脏缺血再灌注损伤的早期发挥关键的作用。Martin等[36]用新型免疫抑制剂FTY720预处理大鼠减少CD⁴⁺的表达来研究Ｔ淋巴细胞对肝脏缺血再灌注损伤的影响。结果显示，与对照组相比，CD⁴⁺减少组肝脏缺血再灌注损伤明显减轻。近年来kuboki等[37]研究发现不同的T淋巴细胞亚群在肝脏缺血再灌注过程中引起损伤的作用机制不同。另外，他们还发现Ｔ淋巴细胞受体敲除的小鼠缺血再灌注后损伤和中性粒细胞聚集现象均较对照组减轻。

2.17. 活性氧损伤

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要由线粒体通过电子传递链氧化磷酸化产生，由于细胞内抗氧化系统的存在，在正常的生理条件下，氧化还原处于一种平衡态。但是在缺血再灌注的过程中，由各种因素引起的ROS增多打破了这种微妙的平衡。过多的ROS耗尽了内源性的抗氧化物质，并诱导抗氧化酶的表达。在损伤发生并持续的过程中，细胞内的各种补偿应答未能正确地修复已经被打破的氧化还原平衡，增强了氧化应激反应并导致了后续的炎症应答以及肝脏损伤(Prieto and Monsalve 2017)。缺血再灌注导致活性氧上升的因素包括：1) 线粒体内单电子还原生成ROS增加。缺血阶段，线粒体呼吸链上的酶活性被抑制，再灌注时，线粒体呼吸链上的酶活性并没有随着复氧的过程而及时恢复从而使氧气分子经由单电子还原途径产生大量的ROS。2) 组织缺氧时，细胞内黄嘌呤脱氢酶会被代谢成黄嘌呤氧化酶，再灌注后，黄嘌呤氧化酶介导的氧化反应伴随有ROS生成(Casillas-Ramírez et al. 2006)。3) 再灌注时期被激活的Kuffer细胞，中性粒均能产生额外的ROS。4) 缺氧导致的肾素–血管紧张素系统(Renin-angiotensin system)改变会释放大量的儿茶酚胺，儿茶酚胺的自身氧化会产生大量的ROS (Shirasugi et al. 1997)。5) 相对于缺血再灌注所引发的多种ROS产生系统，肝脏中的抗氧化物(如谷胱甘肽，超氧化物歧化酶)产生水平很低，无法清除过多的ROS。上升的ROS主要会造成如下的损伤：1) ROS能够直接损伤细胞器的膜结构，导致细胞器内容物的释放，并进一步地引起炎症、细胞凋亡。2) 过多的ROS能够氧化细胞内的生物大分子(包括DNA、蛋白质、脂类等)造成膜脂的过氧化反应或DNA的断裂，从而导致细胞损伤并引起细胞凋亡。3) ROS造成的氧化应激会导致内质网内的蛋白错误折叠并引起持续性的未折叠蛋白应答(Unfolded protein response, UPR)，如果内质网稳态无法被恢复，持续的内质网应激反应最终也会引起细胞的坏死和凋亡。

3. 肝缺血再灌注损伤的保护机制

3.1. 氧化应激反应

众所周知，氧化应激在HIRI中起到相当重要的作用。过度氧化应激主要是由于再灌注过程中产生的活性氧(ROS)引起的，ROS的异常形成导致生物膜损伤，最终坏死或凋亡细胞死亡，ROS的产生非常复杂。在正常的生理条件下，ROS的产生高度局限于特定的亚细胞位点，并受一些负反馈机制的调控[38] [39]。在哺乳动物细胞中有很多产生ROS的酶系统，其中有四种酶系统占据主导地位。这些包括NADPH氧化酶，黄嘌呤氧化酶，NO解偶联的合成酶和线粒体电子传递链。这些来源之间存在着大量的相互作用，例如激活一个可以导致其他的激活。这可能导致正反馈过程，从而进一步增加ROS的产生和氧化应激[40]。ROS在错误的时间出现在错误的位置，或产生过多的ROS，都会导致氧化应激，从而导致细胞功能紊乱和细胞凋亡[41]。机体内存在多种抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽、维生素Ｅ等都可以抑制ROS的过氧化反应。何其宽等[42]研究表明外泌体可以上调内源性抗氧化酶的水平，减轻脂质氧化应激反应，从而缓解HIRI。

3.2. 补体激活

研究表明补体激活后形成的膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC)是HIRI时的主要介质[43]。MAC特异性靶向补体抑制剂CR2-CD59与C3或者C5抑制剂不同，它不但能在HIRI时保护肝细胞，而且在HIRI后明显地促进肝细胞再生。将CR2-CD59应用于90%的肝切除大鼠模型，不但能增加细胞再生能力，而且将术后的远期生存率从0提高到70%。大量实验证实补体抑制剂被认为是HIRI的潜在治疗方法，但是早期的补体激活产物C3a和(或) C5a对肝脏术后肝细胞的增殖至关重要，如果抑制剂作用于C3a或C5a均可能影响HIRI后肝细胞的再生。Saidi等[44]研究表明补体C1抑制物C1-INH能减轻HIRI，并促进肝细胞再生，也证明了补体经典激活途径参与了HIRI。对于补体系统的进一步研究可能会为HIRI的干预带来新的方法。

3.3. 自噬

自噬是指真核细胞利用溶酶体对在生物合成过程中形成的受损长寿蛋白、细胞器及畸形蛋白进行降解的过程。既往认为HIRI的发生主要与凋亡相关，而最新的研究发现[45]自噬作用也参与了肝细胞死亡过程。近年来发现自噬相关调控蛋白主要有自噬基因Beclin-1和轻链(lightchain, LC) 3-Ⅱ两种，并且已经证实二者可以作为自噬的标志物。一项新的研究指出[46]，丙酮酸乙酯可抑制B淋巴细胞瘤-2基因(B-celllymphoma-2, Bcl-2)、Bax蛋白、自噬基因Beclin-1以及LC3的表达，减弱自噬程度，减轻HIRI造成的肝细胞损伤。并且发现丙酮酸乙酯是通过抑制高迁移率族蛋白B (high mobility group box, HMGB) 1和Beclin-1的BH3结构域结合，使自噬不能活化；还通过增加Bcl-2的表达，使Bcl-2和Beclin-1紧密结合，抑制自噬发挥作用。此外，丙酮酸乙酯还具有抑制HMGB1/TLr4/NF-κB轴，使炎症因子(TNFα, IL-6)释放减少的作用。除了调控蛋白外，调节自噬的关键因子还有雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)。mTOR是PI3K-Akt信号通路下游的一个效应分子，可以抑制自噬的发生[47]。在体外模型的实验中发现，热休克预处理间充质干细胞在经历缺血再灌注损伤时，其酸性自噬泡、Beclin-1和LC3-Ⅱ表达增加，自噬小体形成增多。而且通过P38促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)/mTOR通路，增加了细胞的存活率及自我修复能力[48]。另外自噬可能与ROS产物相关。Li等[49]发现通过减少HIRI时ROS和细胞因子的释放，可抑制肝细胞的凋亡和自噬，发挥这一作用可能的机制是钝化诸如P38MAPK，c-Jun氨基末端激酶以及细胞外调节蛋白激酶等MAPK家族蛋白磷酸化的活性。目前大部分研究[50]认为，增强自噬可以提高肝脏对HIRI的耐受性，而过度的自噬反而会介导缺血再灌注损伤的肝组织死亡，并且对肝细胞的坏死和凋亡有促进作用[51]。在正常环境中，细胞中较低水平的自噬可以降解胞浆中衰老的细胞器和变性的生物大分子，维持正常的生理功能。而HIRI发生时，线粒体绝大部分变性、溶解，而无法正常供能，染色质断裂，核解体时就会导致自噬型细胞死亡。因此自噬和自噬型细胞死亡的临界点就成为了目前研究的重点，而MPT可能是二者的分界线[52]。MPT是HIRI时线粒体自噬下调的分子信号，使功能失调的线粒体不能通过自噬途径清除。此时，受损线粒体内装载的ROS反过来会导致氧化磷酸化解偶联，导致能量合成障碍，最终肝细胞死亡[53]。总之，自噬在HIRI发病机制中占有一定地位，但具体作用机制有待于进一步研究。此外，HIRI的发病机制还涉及酸中毒、线粒体损伤及细胞凋亡等其他因素，各个因素相互作用，共同造成肝组织的损伤。

3.4. B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)

Bcl-2是一种编码多功能蛋白的基因，至今研究仍表明其凋亡调控作用是其诸多功能中最为重要的。Bcl-2过表达可限制或完全阻止多种类型细胞在生物反应时受到如营养限制、毒物聚积、病毒感染、缺氧以及流体力等刺激而引起的凋亡。Bcl-2具有拮抗血小板源性生长因子和肝细胞生长因子介导的凋亡作用。它可与肝细胞生长因子受体结合形成复合物，诱导凋亡后此复合物迅速增加。Bilbao G等[54]实验表明通过腺病毒介导基因转染的方式增强肝组织细胞中Bcl-2基因的表达，显著减少大鼠缺血再灌注损伤肝细胞凋亡和肝细胞坏死。BarrierA等[55]应用人体供肝进行缺血预处理，对多种基因表达进行筛选，发现Bcl-2超高表达，具有抗凋亡、保护肝脏缺血再灌注损伤作用。

3.5. 热休克蛋白(HSP)

热休克蛋白(HSP)也称为应激反应蛋白，当人体处于应激状态下，该反应蛋白的水平大大增加。热休克蛋白HSP32也被称为血红素(HO-1)，很多研究已证实，它对缺血再灌注损伤具有保护作用，是所有热休克蛋白中治疗缺血再灌注损伤最具有潜力的一员。HSP32的保护机制主要有多个方面，该蛋白诱导形成的胆红素具有抗氧化的功能。此外，在这个过程中产生的副产品为CO，可以诱导形成一个具有缺血保护作用的一个关键蛋白P58。HSP70也是热休克蛋白家族的一员，具有提高患者生存率以及保护肝脏缺血再灌注损伤的功能。

3.6. 核转录因子Kappa-B (NF-κB)

核转录因子kappa-B (NF-κB)是一种转录刺激因子，其普遍存在于真核细胞中，是参与到肝IRI损伤的重要的一个因子[19]。NF-κB在IRI的两个不同阶段被激活，并产生不同的效应：在早期再灌注阶段(30 min至3 h)，它诱使促炎细胞因子(IL-1、IL-6及TNF-)的表达的增加。在再灌注的后期阶段(9~12 h后)，它作为一种抗炎药发挥保护作用[56]。NF-κB发挥保护作用的机理可能是抑制TNF-反应中ROS的聚集，而TNF-会刺激细胞发生凋亡或坏死，因此NF-κB可能通过抑制凋亡信号传递在IRI中其保护作用[57]。

3.7. 非编码RNA

非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA。微小RNA (microRNA, miRNA)与HIRI关系甚为密切，miRNA是由21~23个氨基酸组成的非编码RNA，起着调节基因的表达以及转录的作用。许多miRNA参与了HIRI，且作用是多样的。Jiang等[58]研究发现在大鼠的巨噬细胞中，miRNA-146a能通过直接抑制IL-1受体相关激酶(inerleukin-1 receptor associated kinase, IRAK) 1以及TNF受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor, TRAF) 6减轻HIRI。其机制可能是巨噬细胞中的miRNA-146a负向调节TLR信号通路，钝化NF-κB的亚基P65，从而减少TNFα等炎症因子的释放，间接抑制肝细胞凋亡。另外一项研究[59]发现在大鼠热缺血模型中，shRNA沉默TNFα基因能够显著降低大鼠血清ALT、AST水平，保护肝细胞。相反地，一项最新的研究[60]显示mi-NA-34a的高表达能减少核因子E-2相关因子(nuclear factor-E2-related factor, Nrf) 2及其下游产物的表达，抑制H2S对缺血再灌注大鼠的肝细胞保护作用。在非编码RNA中，有一类RNA长度超过200 bp，称为长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)。Chen等[61]检测到在缺血再灌注损伤发生时，lncRNA表达谱发生变化。lncRNA AK139328表达下调后，磷酸化蛋白激酶B、糖原合酶激酶和内皮型一氧化氮合酶等信号蛋白的数量会增加。并且发现lncRNA AK139328可降低血清转氨酶水平，降低caspase3的活化，减轻肝细胞坏死。此外，它还能减少巨噬细胞的释放，抑制NF-κB活性和炎性细胞因子表达。该项研究表明沉默的lncRNAAK139328可成为诊断、预防及治疗HIRI的新途径。

4. 结论

肝脏缺血再灌注损伤一直以来是肝脏外科手术的重大难题。进一步认识肝IRI损伤的机制有助于在肝切除术、肝移植术、肝外伤处理期间，在减少及改善肝缺血再灌注损伤方面提供有效的理论依据及安全可靠的手术指南。因此，期望在不久的将来有更新更安全的药物和方法给肝脏缺血再灌注损伤的治疗保护方面带来一定的福音。

NOTES

^*通讯作者。