响应面法优化超声辅助提取杜仲总黄酮及其抗氧化活性研究

Optimization and Antioxidant Activity Evaluation of Ultrasound-Assisted Total Flavonoid Extraction from Eucommia ulmoides Using Response Surface Methodology

摘要: 试验通过响应面法优化杜仲总黄酮的提取条件，并评估其抗氧化活性。以杜仲皮为原料，基于单因素试验，通过响应面法优化超声辅助提取杜仲总黄酮的工艺条件，并测定了提取物的抗氧化能力。结果表明，超声时间50 min、乙醇浓度68%和液料比31 mL/g为杜仲总黄酮的最适提取组合。在此条件下，杜仲总黄酮的得率达到3.34%。抗氧化活性结果显示，杜仲总黄酮提取物对DPPH自由基和羟基自由基具有一定的清除效能，而对ABTS⁺自由基和超氧阴离子展现出较强的清除作用，其半抑制浓度IC₅₀分别为0.08 mg/mL和0.06 mg/mL。优化所得的提取工艺合理可行，杜仲提取物表现出良好的抗氧化潜力，为后续将其开发为抗氧化饲料添加剂提供了依据。

Abstract: The extraction process of total flavonoids from Eucommia ulmoides and the determination of their antioxidant activity were optimized by response surface methodology. Using Eucommia ulmoides bark as raw material, on the basis of single-factor tests, the ultrasonic-assisted extraction process conditions for total flavonoids from Eucommia ulmoides were optimized using response surface methodology, and the antioxidant capacity of the extract was determined. The optimal extraction parameters, determined by response surface methodology, were an extraction time of 50 min, an ethanol concentration of 68%, and a liquid-to-solid ratio of 31 mL/g. Under these conditions, a maximum total flavonoid yield of 3.34% was achieved. Furthermore, the obtained extract exhibited significant radical scavenging activity against both DPPH and hydroxyl radicals, while it exhibited stronger scavenging effects on ABTS⁺ radicals and superoxide anions, with half-maximal inhibitory concentrations (IC₅₀) of 0.08 mg/mL and 0.06 mg/mL, respectively. The optimized extraction process of is reasonable and feasible, and the extract of Eucommia ulmoides shows good antioxidant potential, providing a basis for its subsequent development as an antioxidant feed additive.

1. 引言

杜仲(Eucommia ulmoides)为杜仲科植物杜仲干燥树皮，据《中国药典》记载，其具有补益肝肾、强筋健骨、养胎护元等药效[1]，在我国分布广泛，主要分布在西南地区。杜仲皮和杜仲叶具有相似的化学成分，均可作为药食同源物质，以各式各样的中成药、保健品和饮品存在于市场中，受到人们的广泛关注。

杜仲中富含活性成分，且作为中草药具有低毒和高效性，可利用生物学功能及其安全性，将其提取物用于绿色饲料添加剂，推动养殖业的发展。杜仲叶具有提高动物生长性能、抗氧化能力和免疫能力等。陈姗姗等[2]添加杜仲提取物饲养蛋鸡，发现蛋鸡的抗氧化能力、免疫力和产蛋品质得到提高，同时还能调节蛋鸡脂质代谢。靳可[3]发现饲料中添加0.5%~1%的杜仲叶粉可增强临武鸭生长性能，改善肠道菌群组成和健康状况。王东等[4]发现犊牛饲粮中添加0.2%的杜仲提取物，可以提高饲粮纤维降解率和抗炎能力，降低腹泻率。丁佳颖等[5]发现日粮添加0.6%的杜仲叶粉喂食断奶猪仔可提高免疫球蛋白含量，从而提高免疫力，还可提高猪肉品质[6]。喂食添加杜仲提取物饲料还能缓解鲶鱼脂肪肝病和炎症，改善肠道氧化能力和肠道微生物群结构，提高鲶鱼的抵抗力[7]。因此，杜仲提取物作为饲料添加剂既可以物尽其用，提高经济效益，又能使畜禽产品安全质量得到保障[8]，在绿色中草药饲料添加剂领域展现出广阔的应用前景。

杜仲中活性成分主要包括黄酮类、酚酸类、木脂素类、环烯醚萜类、多糖类、萜类及甾体类等[9]。其中黄酮类化合物作为杜仲主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，如显著的抗氧化、抗炎及抑菌等功能[9]-[11]。因此，杜仲总黄酮提取方法研究受到广泛关注。杜仲总黄酮的提取方法主要为水提法或醇提法，如：钟淑娟等[12]采用超声辅助醇提法，得到杜仲皮中总黄酮提取率为1.45%；全熙宇[13]采用水热法，得到杜仲皮中黄酮提取率为0.8%；陆梅元等[14]采用乙醇回流提取法，正交试验结果显示杜仲皮中总黄酮的提取率最高为1.61%。相较于传统溶剂提取，超声辅助提取法能显著缩短提取时间，提高提取效率，并减少溶剂消耗。从理论上解释，杜仲总黄酮分子结构中含有酚羟基，根据相似相溶原理，乙醇分子可通过氢键、范德华力等作用与黄酮类化合物相互作用，破坏其与植物细胞基质的结合力，促使其溶解于乙醇溶液，从而实现分离提取。结合超声波产生的空化效应、机械振动及热效应等，可有效破坏杜仲细胞壁，加速黄酮类化合物的溶出。本研究以杜仲皮为原料，采用超声波辅助醇提法富集杜仲总黄酮，基于单因素试验筛选关键变量，通过响应面法进行工艺优化，为杜仲总黄酮的资源化利用提供理论支持。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 试验仪器

KH-600KDE超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)、UV-5800紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、XF-100型粉碎机(东莞市房太电器有限公司)、BS124S电子分析天平(天津市德安特传感技术有限公司)、GL-20G-C台式高速冷冻离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)。

2.1.2. 试验试剂

芦丁标准品(纯度 ≥ 98%)购自上海源叶科技有限公司；杜仲树皮购自贵州毕节七星关区仁德堂中西药房；水杨酸、硫酸亚铁、对氨基苯磺酸、过硫酸钾购自成都科隆化学品有限公司；自由基试剂(DPPH、ABTS⁺)及抗坏血酸(VC)购自上海麦克林生化科技股份有限公司；Tris-HCl、邻苯三酚、盐酸萘乙二胺购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2.2. 方法

2.2.1. 样品预处理

杜仲树皮于烘箱烘干后粉碎，过60目筛，保存备用。

2.2.2. 芦丁标准曲线的绘制

参照文献[15]，分别吸取0.2 mg/mL芦丁标准液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL于25 mL容量瓶中，依次加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，0.3 mL 10%硝酸铝溶液和 4 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液，以上操作均需摇匀并放置6 min后再加入下一种试剂。最后用60%的乙醇溶液定容，10 min后于510 nm处测定吸度A。以吸光度(y)对芦丁标准品浓度值(x)作图，得到标准曲线y = 11.4x + 0.0162 (R² = 0.9996)。

2.2.3. 杜仲总黄酮提取与测定

称取1.0 g杜仲皮粉末于100 mL锥形瓶内，按照设定的液料比加入相应的乙醇溶液，将锥形瓶放置于超声波清洗机内，按照设定的超声功率、提取温度和提取时间提取。提取液经抽滤后收集，在5000 r/min下离心10 min，取上清液备用，即总黄酮提取液。

量取1 mL上清液于25 mL容量瓶，参考2.2.2方法检测其吸光度。代入芦丁标准曲线方程，并计算提取液中总黄酮提取率[16]，公式为：

总黄酮提取率(%) = $\frac{\text{c}\times \text{V}\times {\text{V}}_2}{\text{M}\times {\text{V}}_1}\times 100\text{\%}$ (1)

式中：c为提取液中总黄酮的质量浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；V1为取样体积，mL；V₂为稀释体积，mL；M为杜仲粉末质量，mg。

2.2.4. 单因素试验

准确称取杜仲粉末1.0 g，按照2.2.3中的方法提取杜仲中的总黄酮，分别考察超声功率(240、300、360、480、600 W)、超声温度(30、40、50、60、70℃)、超声时间(30、40、50、60、70 min)、液料比(10、20、30、40、50 mL/g)、乙醇浓度(50、60、70、80、90%)和提取次数(1、2、3、4、5次)对杜仲总黄酮提取率的影响。

2.2.5. 优化因素的选择与固定水平的确定

单因素试验结果表明，超声功率在300~420 W范围内，提取率随功率增大而升高，在420 W时达到峰值为1.62%，继续增大功率则提取率下降。因此，选择420 W这一较优功率水平进行固定。同样，提取温度和提取次数在50℃、提取两次时提取率最高，分别为1.66%、2.44%，故将温度固定于50℃、提取次数固定为两次。

相比之下，超声时间、乙醇浓度和液料比三个因素在单因素试验中不仅表现出较强的显著性，且在其较优水平附近(时间50 min、乙醇浓度70%、液料比30 mL/g)提取率变化趋势较为平缓，表明这些因素可能存在交互作用，适合通过响应面法进一步优化其协同效应。此外，已有研究也表明这些因素对黄酮提取率的影响较为复杂，存在明显的交互潜力[16]。因此，通过固定超声功率和温度，重点优化时间、乙醇浓度和液料比，既符合单因素试验所反映的规律，也能更高效地揭示多因子之间的交互作用，提高工艺优化的科学性和可靠性。

2.2.6. 响应面试验

在单因素试验基础上，选取影响显著的三个因素为自变量：超声时间(A)、乙醇浓度(B)和液料比(C)为自变量，以杜仲总黄酮提取率为响应值，建立响应面模型。各因素水平设计见表1。

Table 1. Factors and levels of Box-Behnken response surface experimental design

表1. Box-Behnken响应面试验设计因素及水平

水平	超声时间(A)/min	乙醇浓度(B)/%	液料比(C)/(mL/g)
−1	40	60	20
0	50	70	30
1	60	80	40

2.2.7. 抗氧化活性测试

(1) DPPH自由基的清除能力测定

参考文献方法[17] [18]，取3 mL不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的杜仲提取液，分别加入2 mL 0.15 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀，避光反应30 min；以VC作为阳性对照，按上述方法操作，于517 nm测定吸光度。

(2) 羟基自由基的清除能力测定

参考文献方法[19] [20]，取3.0 mL不同浓度杜仲提取液，依次加入2.0 mL 9 mmol/L的硫酸亚铁溶液、2.0 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液和2.0 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，混匀反应40 min；以VC作为阳性对照，按上述方法操作，于510 nm测定吸光度。

(3) ABTS⁺自由基的清除能力

参考文献方法[21] [22]，将7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，避光静置18 h。用无水乙醇稀释溶液，调节在734 nm处的吸光度直至0.70 ± 0.05，得ABTS⁺工作液。取2 mL不同浓度杜仲提取液与2 mL ABTS⁺工作液混匀，避光反应10 min；以VC作为阳性对照，按上述方法操作，于734 nm测定吸光度。

(4) 超氧阴离子的清除能力

参考文献方法[23]，取4.5 mL Tris-HCl缓冲液，在25℃水浴预热20 min。加入2 mL不同浓度杜仲提取液和0.4 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液预热，快速摇匀，25℃水浴反应4 min，加入2滴8 mol/L HCl终止反应；以VC作为阳性对照，按上述方法操作，于320 nm测定吸光度。

2.2.8. 数据统计分析

试验原始数据使用Excel 2019进行预处理，响应面试验设计使用Design-Expert 13软件，数据统计和分析使用Origin 2024软件。

3. 结果与分析

3.1. 单因素试验结果

3.1.1. 超声功率对杜仲总黄酮提取率的影响

图1显示，当超声功率在300~420 W时，杜仲总黄酮提取率随之增大，当超声功率为420 W时提取率最高，为1.62%。当超声功率较低时，超声的空化、机械效应增强，利于破坏细胞结构释放黄酮；但功率过高可能导致杂质溶出或有效成分破坏，致使提取率下降。

Figure 1. Effect of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids from Eucommia ulmoides

图1. 超声功率对杜仲总黄酮提取率的影响

3.1.2. 超声温度对杜仲总黄酮提取率的影响

Figure 2. Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids from Eucommia ulmoides

图2. 超声温度对杜仲总黄酮提取率的影响

由图2显示，杜仲总黄酮提取率随温度升高先增后减，50℃时达到峰值1.66%。适度升温有助于黄酮溶出，但温度过高可能影响其稳定性，导致提取率降低，故50℃为较适提取温度。

3.1.3. 超声时间对杜仲总黄酮提取率的影响

图3显示，提取率随超声时间延长显著上升，50 min时达到最大值2.28%。50 min后继续延长提取时间，得率反而下降。可能原因是时间不足时溶出不完全，延长有利于溶出；但过长时间可能导致黄酮降解或溶剂饱和，反而降低效率。因此，响应面试验选取40、50、60 min。

Figure 3. Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from Eucommia ulmoides

图3. 超声时间对杜仲总黄酮提取率的影响

3.1.4. 液料比对杜仲总黄酮提取率的影响

图4显示，提取率随液料比增大而提高，液料比30 mL/g时达最高值2.01%。随后，增加溶剂比例反而导致得率降低。溶剂不足限制溶出，适量溶剂提高效率；但溶剂过量会引起稀释效应或分散超声能量，降低提取效率。因此，响应面试验选取20、30、40 mL/g。

Figure 4. Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of total flavonoids from Eucommia ulmoides

图4. 液料比对杜仲总黄酮提取率的影响

3.1.5. 乙醇浓度对杜仲总黄酮提取率的影响

图5显示，乙醇浓度升高，提取率先增后减，70%时得率最高，为2.22%。杜仲总黄酮属中等极性化合物，乙醇浓度过低时溶剂极性过强，黄酮溶解度低；浓度过高时溶剂极性减弱，同样降低溶解度。因此，响应面试验选取60、70、80%。

Figure 5. Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from Eucommia ulmoides

图5. 乙醇浓度对杜仲总黄酮提取率的影响

3.1.6. 提取次数对杜仲总黄酮提取率的影响

图6显示，提取次数增加，提取率先升后降。提取两次时提取率最高，为2.44%。增加次数可能导致原料中黄酮减少，且多次超声可能加速化合物降解。

Figure 6. Effect of extraction times on the extraction yield of total flavonoids from Eucommia ulmoides

图6. 提取次数对杜仲总黄酮提取率的影响

3.2. 响应面优化结果

3.2.1. 响应面回归模型建立与分析

由表2响应面试验结果进行拟合，得到多元二次回归方程：杜仲总黄酮提取率Y = 3.3600 + 0.0513A − 0.0937B + 0.0625C + 0.0200AB − 0.1375AC − 0.0625BC − 0.3595A² − 0.4245B² − 0.3220C²。

由表3可知，F_模型 = 189.56，P_模型 < 0.0001，这表明模型的拟合程度极显著，能够相对来说比较准确地反映每个因素与响应值的关系。P_失拟项 = 0.5538 > 0.05无显著性，表明所建立的模型回归显著可靠。R² = 0.9959，R²_Adj = 0.9907，表明杜仲总黄酮提取率实际值与预测值的拟合度较好。在该模型中，AB无显著性影响(P > 0.05)，其余均具有极显著的影响(P < 0.01)。根据F值所示，提取率受单因素的影响程度为：B > C > A。

Table 2. Response surface experimental design and results

表2. 响应面试验设计与结果

试验号	A	B	C	提取率/%
1	40	60	30	2.63
2	60	60	30	2.68
3	40	80	30	2.44
4	60	80	30	2.57
5	40	70	20	2.42
6	60	70	20	2.81
7	40	70	40	2.83
8	60	70	40	2.67
9	50	60	20	2.61
10	50	80	20	2.51
11	50	60	40	2.85
12	50	80	40	2.50
13	50	70	30	3.41
14	50	70	30	3.37
15	50	70	30	3.35
16	50	70	30	3.38
17	50	70	30	3.31

Table 3. Variance analysis results of the regression equation

表3. 回归方程方差分析结果

方差来源	平方和	自由度	均方差	F值	P值
模型	2.16	9	0.2395	189.56	< 0.0001
A	0.0210	1	0.0210	16.63	0.0047
B	0.0703	1	0.0703	55.65	0.0001
C	0.0313	1	0.0313	24.73	0.0016
AB	0.0016	1	0.0016	1.27	0.2976
AC	0.0756	1	0.0756	59.85	0.0001
BC	0.0156	1	0.0156	12.37	0.0098
A^2	0.5442	1	0.5442	430.66	< 0.0001
B^2	0.7587	1	0.7587	600.47	< 0.0001
C^2	0.4366	1	0.4366	345.5	< 0.0001
残差	0.0088	7	0.0013
失拟项	0.0033	3	0.0011	0.8031	0.5538
纯误差	0.0055	4	0.0014
总误差	2.16	16
R^2 = 0.9959
R^2Adj = 0.9907
R^2pred = 0.9714

注：P < 0.05表示影响显著；P < 0.01表示影响极显著。

3.2.2. 各因素相互作用对杜仲总黄酮提取率的影响

Figure 7. Interactive effects of various factors on the extraction yield of total flavonoids from Eucommia ulmoides

图7. 各因素交互作用对杜仲总黄酮提取率的影响

响应面斜率越陡峭或等高线图越椭圆，表明两个因素之间的交互作用越明显[24] [25]。图7(b)、图7(c)显示，AC、BC交互响应面曲率陡峭，趋近椭圆，表明超声时间与液料比、乙醇浓度与液料比对提取率存在显著交互影响。图7(a)显示，虽然AB响应曲面陡峭，但等高线图却趋近于圆，因此超声时间和乙醇浓度的交互作用不显著。这与表3中的结果一致。

3.3. 最佳工艺参数验证

按照最优模型，当超声时间为50.49 min、乙醇浓度为68.84 %，液料比为30.97 mL/g，可以得到最佳的提取率，提取率预测值为3.37%。结合实际操作的可行性和便捷性，对提取的最佳工艺进行了调整，具体操作如下：超声时间为50 min、乙醇浓度为68%，液料比为31 mL/g。使用此优化工艺进行验证实验，平行测定3次，结果显示提取率平均分为3.34%，与预测值的相对误差仅为0.89%，表明实际结果与预测值非常接近，从而充分证实了该模型的准确与可靠。

3.4. 抗氧化活性测试结果

3.4.1. 杜仲提取液对DPPH自由基的清除能力

DPPH清除机制涉及单电子转移(SET)或氢原子转移(HAT) [26]。图8显示，随着杜仲提取液浓度从0.1 mg/mL增加到0.5 mg/mL，DPPH自由基清除率先快速上升后趋于平缓，IC₅₀为0.27 mg/mL。当浓度为0.3 mg/mL时，清除率为47.67%，表明杜仲提取物具有一定DPPH清除能力，但弱于VC。

Figure 8. Scavenging effect of Eucommia ulmoides extract on DPPH free radicals

图8. 杜仲提取液对DPPH自由基的清除

3.4.2. 杜仲提取液对羟基自由基的清除能力

Figure 9. Scavenging effect of Eucommia ulmoides extract on hydroxyl free radicals

图9. 杜仲提取液对羟基自由基的清除

羟基自由基(•OH)活性强、破坏力大，清除难度高[27]。VC可直接高效淬灭•OH [28]。图9显示，随着杜仲提取液浓度从0.1 mg/mL增加到0.5 mg/mL，•OH清除率逐渐增加。当浓度为0.5 mg/mL时，清除率为47.33%。说明杜仲提取物对•OH具有一定的清除能力。

3.4.3. 杜仲提取液对ABTS+自由基的清除能力

ABTS+自由基稳定性介于DPPH和•OH之间[29]，清除机制同样涉及SET和HAT。图10显示，提取液清除ABTS⁺能力较强。随着质量浓度从0.1 mg/mL增加到0.5 mg/mL，清除率急剧增加，然后趋于稳定，其IC₅₀为0.08 mg/mL。当浓度0.3 mg/mL时清除率高达99%，与VC相当，表明杜仲提取物对ABTS⁺自由基清除效果优异。

Figure 10. Scavenging effect of Eucommia ulmoides extract on ABTS⁺ free radicals

图10. 杜仲提取液对ABTS⁺自由基的清除

3.4.4. 杜仲提取液对超氧阴离子的清除能力

图11显示，质量浓度从0.1 mg/mL增加到0.5 mg/mL，超氧阴离子清除率快速上升后增幅放缓，其IC₅₀为0.06 mg/mL。当质量浓度为0.3 mg/mL时，清除率达到87.33%。推测在低浓度时黄酮单体作用有限；当浓度达到0.3 mg/mL后，成分间可能产生电子传递或自由基接力淬灭的协同效应，导致清除率显著跃升[30] [31]。

Figure 11. Scavenging effect of Eucommia ulmoides extract on superoxide anion free radicals

图11. 杜仲提取液对超氧阴离子自由基的清除

4. 结论

本研究采用超声辅助提取杜仲总黄酮，通过单因素试验结合响应面优化，确定了杜仲总黄酮的最佳提取工艺条件为：超声时间50 min、乙醇浓度68%、液料比31 mL/g。验证试验表明，在此条件下提取率达3.34%，相比报道的提取率明显提高[12]-[14]，且与模型预测值接近，证明优化条件稳定可行。体外抗氧化活性测试结果显示，杜仲总黄酮提取物对DPPH自由基和羟基自由基具有一定的清除效能，而对ABTS⁺自由基和超氧阴离子展现出较强的清除作用，其半抑制浓度IC₅₀分别为0.08 mg/mL和0.06 mg/mL。

本研究建立的超声辅助提取工艺为杜仲总黄酮的高效获取提供了技术支持。杜仲提取物的显著体外抗氧化活性，奠定了其作为畜禽天然饲料抗氧化剂的应用基础，为开发绿色畜禽饲料添加剂提供技术储备，助力养殖业可持续发展。

基金项目

2024年贵州省大学生创新创业训练立项项目“杜仲皮总黄酮提取工艺及其生物活性研究”(S2024106680597)；2024年贵州省大学生创新创业训练立项项目“艾叶挥发油提取及抑菌活性研究”(S2024106680568)。

NOTES

^*通讯作者。