1. 引言
局灶节段性肾小球硬化(Focal Segmental Glomurular Sclerosis, FSGS)是肾病综合征最常见的病理类型之一，主要特征为肾小球节段性瘢痕化、肾小管萎缩和受累肾段间质纤维化[1]。近年来，FSGS的患病率呈逐年上升趋势，肾穿刺依然是当前诊断FSGS的金标准，但作为一种侵入性检查手段，不易被患者接受[2] [3]。液体活检因其无创性和易获取性，在疾病诊断方面具有巨大的潜力[4]。已有研究报道，CX3CL1、TGFB1和NR4A1等可能是FSGS潜在的分子标志物[5]-[7]。但这些研究主要依赖于肾脏组织样本进行验证，基于液体活检如血液样本的验证仍然不足，在一定程度上限制了这些标志物在临床实践中的应用，亟需寻找有效诊断FSGS的分子标志物。
FSGS发病机制复杂，治疗仍充满挑战[8] [9]，目前临床上多采用以糖皮质激素联合免疫抑制剂的非特异性治疗方案延缓FSGS的进展，但由于患者的激素敏感性、肾功能和蛋白尿水平的差异性，50%的患者在5~10年内逐渐进展为终末期肾病[10]，迫切需要开发新型的FSGS靶向治疗药物。
本研究综合分析多个FSGS相关的基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)的微阵列数据集，利用来自外周血和肾脏组织样本的FSGS数据集进行验证，鉴定FSGS相关的潜在液体活检分子标志物，并预测靶向治疗FSGS的小分子药物，为FSGS患者的临床诊断和药物研发提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 数据下载
从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载六个与FSGS相关的基因表达谱芯片数据集，其中GSE108109、GSE104066、GSE108112和GSE133288四个数据集作为测试集，GSE37171和GSE129973两个数据集作为验证集。
2.2. FSGS差异表达基因的筛选
利用R语言“limma”包进行差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)的筛选，筛选标准为|log2FC| ≥ 1和adj. P < 0.05。利用“ggplot2”和“pheatmap”包进行可视化处理。为增强结果的稳健性并减少批次效应带来的假阳性，运用Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对测试集DEGs取交集，将在四个数据集中表达差异一致的DEGs用于后续分析。
2.3. GO和KEGG富集分析
利用R语言中“clusterProfiler”包，进一步研究DEGs的富集途径和功能。选取富集分析结果中排名前十的条目，以条形图进行展示。
2.4. 构建PPI网络和筛选候选关键基因
将DEGs输入STRING (http://string-db.org)数据库，利用Cytoscape 3.8.0构建蛋白质–蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络。通过MCC、MNC、Degree和EPC四种不同的拓扑算法，分别筛选出PPI网络排名前十的基因取交集，筛选FSGS相关的候选关键基因。
2.5. 候选关键基因的表达水平验证及诊断价值评估
利用来自肾脏组织(GSE129973)和外周血(GSE37171)两个独立外部数据集，对筛选出的候选基因进行表达和诊断效能验证。运用“pROC”包绘制各基因的受试者工作特性曲线(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC曲线)并计算其曲线下面积(area under the curve, AUC)值，评估候选关键基因对FSGS的判别能力。为保障关键基因的可靠性与泛化性，本研究设定以下验证标准：仅当基因在两个外部验证集中与训练集差异表达趋势一致(均上调或下调)，且AUC均 ≥ 0.7，才被最终认定为FSGS关键基因。
2.6. FSGS免疫细胞浸润分析
采用CIBERSORT算法评估FSGS组织与健康对照组织的免疫浸润水平并计算关键基因与免疫细胞的相关性。使用“reshape2”、“ggpubr”和“corrplot”软件包绘制关键基因与FSGS免疫细胞的相关性图形。
2.7. 单细胞测序分析关键基因的表达及其亚细胞定位
将DEGs输入CMap数据库(https://clue.io/)，筛选得分最小的十个潜在治疗FSGS的小分子药物。利用AutoDockTools软件分析排名前三的小分子药物与关键基因蛋白的结合活性。利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)预测关键基因蛋白的亚细胞定位。
2.8. 预测FSGS小分子药物及分子对接
将DEGs输入CMap数据库(https://clue.io/)，筛选得分最小的十个潜在治疗FSGS的小分子药物。利用AutoDockTools软件分析排名前三的小分子药物与关键基因蛋白的结合活性。
3. 结果与分析
3.1. FSGS相关的差异表达基因
对GSE108109、GSE108112、GSE133288和GSE104066进行分析，分别获得1350个、262个、271个和1153个DEGs (图1(a)，图1(b))。对这些DEGs取交集，最终得到111个共同的DEGs (图1(c))，其中，21个表达上调(图1(d))，90个表达下调(图1(e))。
Figure 1. Differentially expressed genes associated with FSGS
图1. FSGS相关的差异表达基因
3.2. GO功能富集和KEGG通路富集
GO功能富集结果显示，DEGs显著富集在有毒物质反应、解毒和miRNA代谢调节等生物过程(图2(a))，主要定位于各种复合物、内吞泡和血液微粒等部位(图2(b))，与血红素、四吡咯和铁离子结合等分子功能密切相关(图2(c))。KEGG信号通路分析表明，DEGs主要与有毒物质反应、解毒、JAK-STAT调控受体等信号通路有关(图2(d))。
Figure 2. GO and KEGG enrichment analysis for DEGs
图2. DEGs的GO和KEGG富集分析
3.3. PPI网络的构建和候选关键基因的鉴定
对DEGs进行分析，获得一个由31个节点和37条边组成的PPI网络(图3(a)，图3(b))。利用CytoHubba插件中的四种不同的拓扑算法筛选出排名前十的基因，取交集后得到EGF、HDAC5、CCL5、CSRNP1和EGR1等五个候选的关键基因(图3(c)，图3(d))。
3.4. 候选关键基因的表达水平及诊断价值
为了验证5个候选关键基因的组织特异性，利用外周血和肾脏组织样本相关数据集进行表达水平验证，结果显示，只有EGF和HDAC5在肾脏组织(图4(a))和外周血(图4(b))中的表达水平与测试集的结果一致。与正常样本相比，EGF在FSGS患者中显著低表达(P < 0.05)，HDAC5显著高表达(P < 0.05)。ROC曲线结果表明，EGF和HDAC5均具有良好的诊断价值(AUC > 0.70) (图4(c)，图4(d))。
3.5. 免疫细胞浸润
Figure 3. Network topology map of PPI and candidate key genes associated with FSGS
图3. PPI网络拓扑图和FSGS候选关键基因
注：ns：P > 0.05；*：P < 0.05；**：P < 0.01；***：P < 0.001；****：P < 0.0001。
Figure 4. Expression levels and diagnostic value of candidate key genes
图4. 候选关键基因的表达水平和诊断价值
Figure 5. Analysis of immune cell infiltration in FSGS
图5. FSGS的免疫细胞浸润分析
基于DEGs进行免疫细胞浸润分析，结果显示，FSGS组织中T细胞、自然杀伤细胞和B细胞的比例明显高于健康对照组(图5(a))。免疫细胞之间相互作用分析结果表明，活化的自然杀伤细胞与活化的肥大细胞呈正相关；浆细胞与调控T细胞呈正相关(图5(b))。其中EGF与浆细胞、活化的自然杀伤细胞呈显著正相关(r ≥ 0.331, P ≤ 0.004)，而与静息的自然杀伤细胞、M1巨噬细胞呈显著负相关(r ≤ −0.258, P < 0.05) (图6(a))。HDAC5与单核细胞、M1巨噬细胞呈显著正相关(r ≥ 0.252, P < 0.05)，而与浆细胞呈显著负相关(r = −0.317, P = 0.006) (图6(b))。
Figure 6. Correlation between key genes and immune cell infiltration in FSGS
图6. 关键基因与FSGS免疫细胞浸润的相关性
3.6. 关键基因的单细胞测序分析和亚细胞定位
通过HPA数据库中的单细胞分析，发现EGF主要富集在近端小管细胞和远端小管细胞中(图7(a))，且主要分布在溶酶体、细胞外基质和肾脏细胞质膜中(图7(b))；HDAC5主要富集在远端小管细胞、集合管细胞、T细胞和巨噬细胞中(图7(c))，主要定位于细胞质基质和细胞核(图7(d))。
Figure 7. Single-cell sequencing analysis and subcellular localization of key genes
图7. 关键基因单细胞测序分析和亚细胞定位
3.7. 潜在治疗FSGS的小分子药物及分子对接验证
利用CMap数据库，筛选得到具有潜在治疗FSGS的十个小分子药物，其中，1-苯基双胍(1-Phenylbiguanide)、水仙环素(Narciclasine)和花萼海绵诱癌素(Calyculin)为排名前三的药物(表1)。分子对接结果表明，以上三个药物与EGF和HDAC5的结合能均 < −5 kcal∙mol−1，且花萼海绵诱癌素与两个关键蛋白的结合能均为最小(表2，图8)。
4. 讨论
FSGS在肾活检中诊断为原发性肾小球疾病的病例中占比达6%~12%，缺乏早期诊断和治疗的靶标[11]。近年来，随着生物信息学的发展，为精准识别疾病分子标志物并预测潜在的治疗药物，提供了坚实的数据支撑与理论依据[4] [12]。本研究通过整合生物信息学分析方法，系统鉴定了111个和FSGS相关的DEGs。基因功能富集分析显示，这些DEGs主要富集于JAK-STAT调控受体信号通路、有毒物质反应及解毒等信号通路。值得注意的是，已有研究证实JAK2-STAT3信号通路的异常激活可通过促进肾脏炎症反应和纤维化进程，在FSGS的发生发展中发挥关键作用[13]。
Table 1. Top ten potential small molecule drugs for treating FSGS
表1. 潜在治疗FSGS的前十个小分子药物
Name |
ID |
Description |
Score |
1-Phenylbiguanide |
BRD-K31491153 |
Serotonin receptor agonist |
−99.22 |
Narciclasine |
BRD-K06792661 |
Coflilin signaling pathway activator |
−98.66 |
Calyculin |
BRD-A47513740 |
Protein phosphatase inhibitor |
−98.63 |
Cycloheximide |
BRD-A62184259 |
Protein synthesis inhibitor |
−98.59 |
Anisomycin |
BRD-K91370081 |
DNA synthesis inhibitor |
−98.38 |
Verrucarin-a |
BRD-A26002865 |
Protein synthesis inhibitor |
−98.11 |
Tyrphostin-AG-126 |
BRD-K67506692 |
ERK1 and ERK2 phosphorylation inhibitor |
−98.06 |
Cephaeline |
BRD-K80348542 |
Protein synthesis inhibitor |
−98.06 |
Homoharringtonine |
BRD-K76674262 |
Protein synthesis inhibitor |
−97.99 |
Liothyronine |
BRD-K89152108 |
Thyroid hormone stimulant |
−97.92 |
Table 2. Binding energy of FSGS key genes and small molecule drug docking
表2. FSGS关键基因与小分子药物对接的结合能
小分子药物 |
分子对接结合能(kcal∙mol−1) |
EGF |
HDAC5 |
1-苯基双胍 |
−5.6 |
−7.6 |
水仙环素 |
−6.6 |
−9.0 |
花萼海绵诱癌素 |
−6.6 |
−9.1 |
基于PPI分析，本研究并利用MCC、MNC、Degree和EPC四种算法，分别在外周血来源和肾组织来源的FSGS数据集中进行验证，最终筛选出EGF和HDAC5两个FSGS相关的关键基因。与正常对照组相比，FSGS患者肾脏组织和外周血中均呈现EGF表达显著下调和HDAC5表达显著上调的特征性改变。EGF作为一种重要的有丝分裂因子，其表达下调能够激活PI3K/Akt信号通路活性，促进肾小管间质纤维化[14]-[16]。在慢性肾病中，EGF低表达状态可激活T细胞中的NF-κB信号通路，诱导炎症反应并加速肾纤维化进程[17]。HDAC5作为表观遗传调控的关键效应分子，通过调控组蛋白赖氨酸去乙酰化过程参与多种肾脏疾病的病理进程[18]。值得注意的是，近期研究发现HDAC5在糖尿病肾病患者中高表达，通过促进肾小管上皮–间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)过程，加剧肾纤维化进展[19]。ROC曲线分析结果表明，EGF和HADC5两个标志物均表现出良好的诊断效能(AUC值 ≥ 0.735)。鉴于血液样本采集的非侵入性和便捷性，本研究结果提示血清EGF和HDAC5表达水平可能是FSGS无创诊断的新型液体活检的标志物。
Figure 8. Molecular docking of EGF and HDAC5 with small molecule drugs
图8. EGF和HDAC5与小分子药物的分子对接
本研究通过CMap数据库进行药物筛选，发现1-苯基双胍、水仙环素及花萼海绵诱癌素对FSGS具有潜在的治疗价值，分子对接结果进一步证实三者均能高效结合EGF与HDAC5。已有研究表明，水仙环素通过抑制NF-κB信号通路，能够有效逆转肾小管上皮细胞损伤表型，抑制成纤维细胞活化，并显著降低血清肌酐水平，缓解蛋白尿及炎症反应[20]。殷丽萍等人[21]报道，水仙环素通过ESR1/S100A11轴减轻脓毒症相关的急性肾损伤。目前尚无关于1-苯基双胍和花萼海绵诱癌素在肾病治疗中的相关报道，未来需进一步探索其在肾病治疗中的应用潜力。
综上所述，EGF和HDAC5可能是FSGS液体活检的潜在分子标志物，1-苯基双胍、水仙环素和花萼海绵诱癌素可能是潜在治疗FSGS的三种小分子药物，但仍需进一步的实验研究来证实。
基金项目
本项目由2025年度广东省医学科研基金立项项目(项目编号：B2025711)、2024年坪山区卫生健康系统科研项目(项目编号：2024543)、2024年广西大学生创新创业训练项目(项目编号：S202410601172)共同资助。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。