1. 引言
深静脉血栓形成(deep venous thrombosis, DVT)是血液在深静脉内不正常凝结引起的静脉回流障碍性疾病，常发生于下肢。[1]《黄帝内经》曰：“血凝于肤者为痹，凝于脉者为泣”“血泣则不通，不通则荣卫归之，不得复反，故痛肿”，指出了淤血为导致DVT的主要病因。《神农本草经》中有载：“桃仁，味苦甘，平。主淤血。”《本草纲目》中有载：“红花，活血，润燥，止痛。”桃仁、红花为一对活血化瘀的经典药对。在临床中选用包含桃仁–红花药对的通络活血方、补阳还五汤等方剂加减治疗深静脉血栓形成有着显著的疗效[2] [3]，但其治疗DVT的药理学机制仍需进一步探究。
本研究期望通过网络药理学的研究，系统揭示桃仁–红花药对治疗DVT的作用多途径和多靶点机制，同时为临床用药治疗DVT提供理论依据。本研究以网络药理学为工具，具体分析桃仁–红花药对的活性成分、潜在的分子靶标及相关信号通路，探讨其在治疗DTV中的作用机制。
2. 资料与方法
2.1. 桃仁–红花药对有效成分筛选
通过检索TCMSP数据库获取桃仁与红花的全部有效成分，按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30，类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18的条件对有效成分进行筛选。
2.2. 有效成分作用靶点获取
通过TCMSP数据库挖掘有效成分的作用靶点，通过Uniprot数据库将作用靶点名称进行标准化处理。
2.3. DVT靶点的获取
在OMIM数据库、GeneCards数据库和TTD数据库中以“deep venous thrombosis”为关键词检索DVT的相关靶点。
2.4. 药物靶点及疾病靶点的交集靶点
利用Excel将桃仁–红花药对有效成分作用靶点与DVT相关靶点经过取交集并去重后，获得药物靶点及疾病靶点的交集靶点。
2.5. 构建药物–成分–交集靶点网络图
使用Cytoscape3.8.0软件构建“药物–成分–交集靶点”网络。网络中的节点(Node)代表药物、成分、交集靶点，相互之间通过边(Edge)来连接。根据节点度值(Degree)的大小筛选出核心节点。
2.6. PPI分析
将桃仁–红花药物靶点与DVT疾病靶点的交集靶点上传至String数据库中进行PPI分析，物种选Homosapiens，置信度设置为0.9，隐去离散靶点后，得到桃仁–红花治疗DVT的PPI网络。将得到的PPI数据导入Cytoscape3.8.0中进行可视化，并利用其Network Analysis功能分析网络拓扑参数。筛选得到互作网路中的核心靶点蛋白。
2.7. 桃仁–红花药对治疗DVT通路富集分析
运用Cytoscape3.8.0分析大黄–桃仁药对有效成分治疗DVT靶点生物过程，以“P < 0.01”对获取的治疗DVT调控通路进行富集分析。
3. 结果
3.1. 有效成分筛选
根据筛选条件，在TCMSP中筛选出桃仁有效成分23个，红花有效成分22个，其中β-谷甾醇为二者共有成分，所以共得到桃仁–红花药对44个有效成分。见表1、表2。
Table 1. Active ingredient of Carthami Flos
表1. 红花有效成分
红花 |
分子名 |
OB |
DL |
MOL001771 |
poriferast-5-en-3beta-ol |
36.91 |
0.75 |
MOL002680 |
Flavoxanthin |
60.41 |
0.56 |
MOL002694 |
4-[(E)-4-(3,5-dimethoxy-4-oxo-1-cyclohexa-2,5-dienylidene)but-2-enylidene]-2,6-dimethoxycyclohexa-2,5-dien-1-one |
48.47 |
0.36 |
MOL002695 |
lignan |
43.32 |
0.65 |
MOL002698 |
lupeol-palmitate |
33.98 |
0.32 |
MOL002706 |
Phytoene |
39.56 |
0.5 |
MOL002707 |
phytofluene |
43.18 |
0.5 |
MOL002710 |
Pyrethrin II |
48.36 |
0.35 |
MOL002712 |
6-Hydroxykaempferol |
62.13 |
0.27 |
MOL002714 |
baicalein |
33.52 |
0.21 |
MOL002717 |
qt_carthamone |
51.03 |
0.2 |
MOL002719 |
6-Hydroxynaringenin |
33.23 |
0.24 |
MOL002721 |
quercetagetin |
45.01 |
0.31 |
MOL002757 |
7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5,6-g]quinoxaline-2,4-dione |
45.75 |
0.19 |
MOL002773 |
beta-carotene |
37.18 |
0.58 |
MOL002776 |
Baicalin |
40.12 |
0.75 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
MOL000422 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
MOL000449 |
Stigmasterol |
43.83 |
0.76 |
MOL000006 |
luteolin |
36.16 |
0.25 |
MOL000953 |
CLR |
37.87 |
0.68 |
MOL000098 |
quercetin |
46.43 |
0.28 |
Table 2. Active ingredient of Persicae Semen
表2. 桃仁有效成分
桃仁 |
分子名 |
OB |
DL |
MOL001323 |
Sitosterol alpha1 |
43.28 |
0.78 |
MOL001328 |
2,3-didehydro GA70 |
63.29 |
0.5 |
MOL001329 |
2,3-didehydro GA77 |
88.08 |
0.53 |
MOL001339 |
GA119 |
76.36 |
0.49 |
MOL001340 |
GA120 |
84.85 |
0.45 |
MOL001342 |
GA121-isolactone |
72.7 |
0.54 |
MOL001343 |
GA122 |
64.79 |
0.5 |
MOL001344 |
GA122-isolactone |
88.11 |
0.54 |
MOL001348 |
gibberellin 17 |
94.64 |
0.49 |
MOL001349 |
4a-formyl-7alpha-hydroxy-1-methyl-8-methylidene-4aalpha,4bbeta-gibbane-1alpha,10beta-dicarboxylic acid |
88.6 |
0.46 |
MOL001350 |
GA30 |
61.72 |
0.54 |
MOL001351 |
Gibberellin A44 |
101.61 |
0.54 |
MOL001352 |
GA54 |
64.21 |
0.53 |
MOL001353 |
GA60 |
93.17 |
0.53 |
MOL001355 |
GA63 |
65.54 |
0.54 |
MOL001358 |
gibberellin 7 |
73.8 |
0.5 |
MOL001360 |
GA77 |
87.89 |
0.53 |
MOL001361 |
GA87 |
68.85 |
0.57 |
MOL001368 |
3-O-p-coumaroylquinic acid |
37.63 |
0.29 |
MOL001371 |
Populoside_qt |
108.89 |
0.2 |
MOL000296 |
hederagenin |
36.91 |
0.75 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
MOL000493 |
campesterol |
37.58 |
0.71 |
3.2. 桃仁–红花药对有效成分作用靶点
在44个有效成分中，有9个成分的靶点未在TCMSP中收录，得到35个有效成分的作用靶点580个，经过去重整理后，共有217个有效靶点。
3.3. DVT相关靶点
从OMIM数据库中获取18个DVT相关靶点，GeneCards数据库中获取260个，TTD数据库中获取2个，将获得的数据合并，运用Excel去重，最终获取到与DVT相关靶点261个。
3.4. 药物靶点及疾病靶点的交际靶点
在Excel文件中将桃仁–红花药对有效成分作用靶点与DVT相关靶点经过取交集并去重后，获得关键靶点40个，包括:NOS2、PTGS1、PTGS2、F2、NOS3、F7、TNF、MMP1、SELE、VCAM1、AKT1、ICAM1、F10、EGFR、VEGFA、PLAU、MMP2、IL6、TP53、SOD1、F3、IL1B、PLAT、THBD、IFNG、MPO、PON1、MMP9、IL10、CD40LG、HIF1A、SERPINE1、CXCL8、IL1A、CRP、RASA1、MET、IL4、CTNNB1、ESR1，并绘制维恩图，见图1。
Figure 1. Venn diagram of the targets of active ingredients in the Peach Kernel-Safflower herb pair and DVT-related targets
图1. 桃仁–红花药对有效成分作用靶点与DVT相关靶点维恩图
3.5. 药物–成分–交集靶点网络的构建
以桃仁–红花、药物成分、药物靶点与DVT疾病靶点的交集靶点3个方面为节点，先在Excel中建立彼此对应关系，然后将文件导入Cytoscape3.8.0中，建立药物–成分–交集靶点网络，见图2。该网络共包含节点68个，边143条，平均度值为4.14。度值越高表示该节点对应的靶点在网络中的作用越高。中间的方形粉格代表红花，方形红格代表桃仁，菱形绿格代表药物成分，椭圆形紫格代表交集靶点蛋白。按照Degree值排序，排名前5的化合物分别为槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、黄芩素(baicalein) β-谷甾醇(beta-sitosterol)。
Figure 2. Drug-component-intersection targets network diagram
图2. 药物–成分–交集靶点网络图
3.6. PPI分析
将上述40个交集基因输入String数据库中进行PPI分析。得到String数据库中的PPI网络见图3。Cytoscape3.8.0可视化后的PPI网络如图4所示。在网络图中，节点的颜色以橙色显示，其深度与其度值呈正相关，连接度较高的节点颜色越深，以此直观反映其在网络中的关键地位及影响力。将Cytoscape3.8.0导出的数据经Excel进行数据处理后得到8个核心靶点：TNF (肿瘤坏死因子)、IL6 (白细胞介素-6)、IL1B (白细胞介素-1β)、IFNG (干扰素γ)、CXCL8 (白细胞介素-8)、ICAM1 (细胞间黏附分子-1)、TP53 (P53抑癌基因)、CTNNB1 (连环蛋白β1基因)。
3.7. 基因富集分析
3.7.1. GO富集分析
GO功能富集分析共获得1935条功能条目。其中，生物过程为1796条，主要有对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、凋亡信号通路的调节、细胞对生物刺激的反应等；细胞组分为18条，主要与质膜外侧、丝氨酸型肽酶复合物、肽酶抑制剂复合物、膜筏等有关；分子功能为121条，包括细胞因子活性、丝氨酸型内肽酶活性、细胞因子受体结合、丝氨酸型肽酶活性等，见图5。
3.7.2. KEGG富集分析
KEGG通路富集分析，共获得128条信号通路，见图6。图6中，垂直轴标示了信号通路的名称，水平轴则反映了基因的富集密度。圆圈的直径大小直观呈现了通路中富集的蛋白质数量，而色彩的深浅编码了富集程度的显著性，其中更深的红色象征着更强的富集功能。结果揭示，潜在基因显著富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等信号传导通路中。桃仁与红花的活性成分呈现出显著的多样性与复杂性，其在治疗深静脉血栓方面的功效源自对众多生物靶点的综合调控与协同作用，以及对多条关键生物途径的精准干预。
Figure 3. Protein-protein interaction network of Persicae Semen-Carthami Flos in treating DVT
图3. 桃仁–红花治疗DVT的蛋白互作网络图
Figure 4. Visualized protein-protein interaction network
图4. 可视化后的蛋白互作网络图
Figure 5. Bar chart of GO enrichment analysis
图5. GO富集分析条形图
Figure 6. Bubble chart of KEGG enrichment analysis
图6. KEGG富集分析气泡图
4. 讨论
近年来随着现代药理学的发展，中药治疗DVT作用机制不断明确，主要以活血化瘀药和虫类药物为主[4]。活血化瘀类药物可有效改善血流动力学，推动血流速度，降低血液浓度。李双双等[5]研究证实桃仁具有扩张外周血管、促进器官血流量增加、抑制血小板聚集、抵抗凝血与血栓形成以及促纤溶作用。红花则在改善微循环、抗心律失常、消炎、镇痛、抗衰老及抗肿瘤方面具有显著疗效[6]
4.1. 有效成分
通过网络药理学筛选，共得到桃仁–红花药对有效成分44个、药物靶点217个，槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、黄芩素(baicalein) β-谷甾醇(beta-sitosterol)等成分可能是桃仁–红花药对治疗深静脉血栓的重要药效成分。槲皮素(quercetin)是一种广泛存在于植物中的天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物活性；木樨草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中；山奈酚(kaempferol)具有多种药理活性，如抗炎、抗过敏、抗肿瘤等，其临床常用于治疗心血管疾病；黄芩素具有降低脑血管阻力，改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用，临床常用于脑血管病后瘫痪的治疗；β-谷甾醇是一种有机化合物，广泛存在于自然界中的各种植物油、坚果等植物种子中，也存在于某些植物药中。β-谷甾醇以其特有的生物学特性和物理化学性质被较多地应用到医药行业中。
4.2. 作用靶点及信号通路
ICAM-1是细胞免疫球蛋白超家族的一部分，广泛表达于血管内皮细胞，上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞以及树突状细胞等细胞类型上。这种黏附分子在多种免疫反应、特别是炎症和血栓形成中发挥关键作用。袁松林的研究显示：ICAM-1在DVT的发生发展中有重要的作用，特别是ICAM-1参与中性粒细胞外捕诱网(NETs)的激活这一过程[7]。李达的研究表明TNF相关基因被敲除的小鼠，可阻断TNF-α的作用通路，从而减少ICAM-1的表达，降低深静脉血栓的发生[8]。炎症反应也是静脉血栓栓塞症病理生理学的一个重要因素[9]。IL-6在炎症相关血栓形成中起着关键作用，诱导组织因子的表达来促进促凝状态，从而参与DVT的形成[10] [11]。有研究表明：IL-8的水平升高可能与凝血异常功能相关[12]，白细胞介素-1β可直接作用于血管内皮细胞，损害内皮功能，并诱导局部血栓形成来促进血栓形成，是血栓形成的主要介质[13]。AGE-RAGE信号通路与炎症细胞因子、氧化应激、神经及血管等多方面密切相关[14]；IL-7信号通路属炎症反应通路，能参与炎症发展过程，推动炎症的发生。
综上所述，本研究通过网络药理学方法，对桃仁–红花药对治疗DVT的作用机制进行探索，结果显示，桃仁–红花药对的多种有效成分通过多靶点、多通路的机制发挥作用。由于网络数据库的不完整性，本研究尚有一定的局限性，桃仁–红花药对治疗DVT的作用机制还有待通过更确切的实验研究加以验证。
NOTES
*通讯作者。