1. 引言
肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)是一种起源于胆道系统的恶性肝胆肿瘤，具有隐匿性、高侵袭性、难治性且预后较差[1] [2]。近年来，iCCA发病率呈上升态势，但其5年总生存率仅约9%，且由于早期症状不典型，大多数患者在确诊时已进展至局部晚期或发生远处转移，致使常规治疗或放疗应答率较低，而且手术后的复发率和转移率依然较高[3]。因此迫切需要确定有效的治疗方法和探索新的治疗靶点和生物标志物来改善这种疾病的不良预后，以应对当前临床面临的困境。
溶质载体家族35，成员E4 (Solute Carrier Family 35, Member E4, SLC35E4)基因位于染色体22q12.2上，属于核苷酸糖转运体E亚家族。SLC35E4被预测为反向转运蛋白。先前研究发现SLC35E4作为通过建立与胆管癌预后的相关的竞争性内源性RNA(ceRNA)网络的主要节点，有进一步作为胆管肿瘤的潜在治疗靶点和预后生物标志物的潜力[4] [5]。根据既往的研究，SLC35E4与肝内胆管癌之间可能存在一定的相关性。然而，目前SLC35E4是否在肝内胆管癌中发挥作用以及其作用涉及哪些机制还尚未有研究报道。本研究旨在探索SLC35E4能否作为治疗新靶点并在肝内胆管癌中发挥功能调控作用，为肝内胆管癌患者的个体化治疗中提供一个新的视角。
2. 材料和方法
2.1. 试剂和耗材
肝内胆管癌细胞(RBE、Hccc9810、HuCCT1、HiBEpic)来自于中山大学实验室惠赠。二甲基亚砜(DMSO)和RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司。10%胎牛血清和RPMI-1640高糖基础培养基购自美国(Gibco)公司。青霉素–链霉素购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司。Polyethylenimine Linear (PEI)试剂购自上海复申生物科技有限公司。RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。逆转录酶试剂盒购自赛默飞世尔科技公司。Cell Counting Kit-8试剂盒购自广州硕谱生物科技有限公司。4%多聚甲醛购自兰杰柯科技有限公司。0.1%结晶紫染色液购自北京索莱宝科技有限公司。Hoechst 33342染液购自上海碧云天生物公司。SLC35E4抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。Cleaved caspase-3购自美国Affinity Bioscience (艾菲)公司。Bax和二抗Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) HRP购买于南京巴傲德生物科技有限公司。内参β-Tubulin武汉塞维尔生物科技有限公司。
2.2. 生信分析
通过从泛癌的角度对SLC35E4进行综合分析。使用TIMER数据库分析多种癌症样本中SLC35E4表达情况，并利用不同患者队列数据集(TCGA数据集和GEO数据集)验证SLC35E4在肿瘤和正常组织中的表达差异。使用TCGA数据集绘制ROC曲线确认SLC35E4在区分肿瘤和正常组织的诊断价值，接着进行K-M生存分析，分析SLC35E4对iCCA生存的影响，并可视化生存分析结果。
2.3. 细胞培养和转染
人iCCA细胞系(RBE, Hccc9810, HuCCT1)和正常人肝内胆管上皮细胞(HiBEpic)培养于37℃、5% CO2培养箱中，加入1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清以及RPMI-1640基础培养基。随后，将RBE细胞株分为NC组、shSLC35E4-1组、shSLC35E4-2、shSLC35E4-3组，使用转染试剂PEI对四组细胞分别进行慢病毒转染。
2.4. RT-qPCR检测
使用天根公司的RNA提取试剂盒，从细胞系中提取总RNA，并使用超微量分光光度计检测RNA的浓度。采用逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录成cDNA，接着配置目的基因SLC35E4的扩增体系并使用实时荧光定量PCR仪进行RT-qPCR检测。实验结果以2-ΔΔCT值形式得到。引物序列如下：
SLC35E4基因：
Forward: 5’- AGTCTCACCTTTGGCACGTC -3’
Reverse: 5’- CAGGGTGAACAGAGGTGTGG -3’
2.5. Western Blot
使用RIPA蛋白裂解缓冲液从肝内胆管癌细胞中提取总蛋白，并通过BCA等方法定量后加入上样缓冲液并煮沸变性。接着进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将变性后的蛋白质依据分子量大小在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离；随后通过湿转法，将凝胶上分离的蛋白质转移至PVDF膜上。转膜完成后，在室温下用TBST配置的5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，并与一抗SLC35E4 (1:2000)、Cleaved caspase-3 (1:2000)、Bax (1:1000)和β-Tubulin (1:10000)为内参在4℃下孵育过夜。使用TBST洗膜后加入按比例配置好的二抗Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) HRP (1:5000)共室温摇床孵育1个小时，最后配置ECL化学发光工作液，均匀淋于膜表面。将膜放置于化学发光仪中，将蛋白面朝上曝光每个膜上的条带。
2.6. CCK-8实验
取作敲低处理后RBE的4组细胞进行胰酶消化、离心。重悬后的细胞悬液经过细胞计数后分别以1 × 103个/孔细胞接种于96孔板中，并设置5个平行复孔，放入37℃培养箱中培养。在第24 h、48 h、72 h和96 h进行检测，每孔加入10 μL CCK-8试剂和90 μL无血清培养基，培养箱孵育1 h，酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值，使用GraphPad软件绘制细胞生长曲线。
2.7. 克隆形成实验
取处于对数生长期的作敲低处理后RBE细胞以每孔800个细胞接种6孔板中，并轻轻晃动，使细胞分散均匀。置于37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中，培养至14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液处理并观察细胞状态。PBS润洗两次，以4%多聚甲醛固定30 min；PBS润洗2次后，用0.1%结晶紫染色15 min，然后用流水缓慢洗去染色液。晾干后用手机对其拍照。使用ImageJ软件对细胞克隆数进行量化并使用GraphPad软件作图，最后按下列公式计算克隆形成率，两组间比较使用t检验，多组比较用方差分析。以p < 0.05认为有统计学差异。
克隆形成率 = (克隆数/接种细胞数) × 100% (1)
2.8. 细胞划痕实验
取处于对数生长期的作敲低处理后RBE细胞进行消化，以每孔5 × 105个细胞接种于6孔板中，当细胞汇合度达到80%~90%时，用200 μl的移液器黄色枪头水平划痕。随后用PBS冲洗细胞到无脱落细胞为止。在同一时间段于显微镜下观察细胞板并拍照记录。
细胞迁移率 = (0 h划痕面积 − 24 h划痕面积)/0 h划痕面积 × 100% (2)
2.9. 细胞凋亡实验
取对数生长期细胞，将细胞消化成单个细胞悬液，接种3 × 105至6孔板中过夜培养，设置对照组NC组，三个敲低实验组shSLC35E4-1、shSLC35E4-2、shSLC35E4-3，处理24 h后通过凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。刺激细胞发生凋亡后吸弃6孔板中培养基，按0.5 mL/孔加入固定液，10 min后吸弃固定液随后用PBS润洗两次，按1:100加入染色浓缩液和染色稀释缓冲液。放到摇床上染色5~10 min。随后用PBS润洗两次后加入PBS。利用Leica荧光显微镜随机选取多个视野观察并拍照记录。
2.10. 统计学方法
使用R版本4.3.0软件及其资源包和GraphPad prism 9.0进行统计分析和相关的可视化图形(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)。使用非参数秩和检验进行两组间的统计分析，并对多组样本比较采用Kruskal Wallis检验。用p < 0.05来表示有统计学意义。
3. 结果
3.1. SLC35E4在不同肿瘤类型中的表达及诊断、预后分析
通过TIMER在线数据库对SLC35E4基因在多种癌症中的表达情况分析，结果显示相较于正常组织，SLC35E4在CHOL、LIHC、COAD等肿瘤组织中高表达(图1(A))。此外，利用TCGA和GEO数据库的数据集再次验证了SLC35E4在肝内胆管癌组织中呈现显著的上调趋势(图1(B)~(C))。使用TCGA数据集绘制ROC曲线确认SLC35E4在区分肿瘤和正常组织的诊断价值。图1(D)显示，诊断ROC的AUC值大于0.7，这提示SLC35E4可作为iCCA潜在的辅助诊断指标。K-M生存曲线结果显示，SLC35E4高表达与iCCA患者的预后不良有关，且差异具有统计学意义(p < 0.05，图1(E))。
注：(A) TIMER数据库分析SLC35E4在36种肿瘤中的表达水平；(B)~(C) SLC35E4基因在TCGA和GEO数据集中mRNA表达水平；SLC35E4基于TCGA数据集的诊断ROC曲线(D)和K-M生存曲线(E)。
Figure 1. Expression differences of SLC35E4 across different tumor types and diagnostic and prognostic values
图1. SLC35E4在不同肿瘤类型中的表达差异及诊断、预后价值
3.2. 构建敲低SLC35E4的肝内胆管癌细胞株
为进一步确定SLC35E4在各种肝内胆管癌细胞中的表达情况，通过RT-qPCR检测SLC35E4在3种肝内胆管癌细胞系(RBE、HuCCT1和Hccc9810)和正常肝内胆管上皮细胞(HIBEpic)中mRNA的表达。结果发现，与HiBEpic细胞相比，SLC35E4在RBE和HuCCT1中高表达(图2(A)，p < 0.05)。进一步通过WB验证结果相一致(图2(D))。因此，构建了SLC35E4敲低表达的肝内胆管癌细胞系，探索SLC35E4对肝内胆管癌肿瘤细胞的影响。RT-qPCR的结果显示，RBE和HuCCT1细胞的敲低组(shSLC35E4-1, shSLC35E4-2, shSLC35E4-3)的SLC35E4的mRNA表达水平均显著低于NC组，且在RBE肿瘤细胞系中敲低效果更明显，差异具有统计学意义(图2(B)~(C)，p < 0.05)。为了进一步验证RBE细胞中SLC35E4不同敲低序列的沉默表达，使用WB方法检测NC组以及shSLC35E4-1、2和3共三个敲低组的蛋白表达水平。比较发现，shSLC35E4-1和shSLC35E4-3的蛋白表达水平明显较低(图2(E))。与我们之前的结果完全符合，这些提示了shSLC35E4-1和shSLC35E4-3可以显著敲低SLC35E4的内源性表达，能够很好的代表肝内胆管癌SLC35E4沉默表达的细胞系。
注：(A) SLC35E4在正常和iCCA细胞系中mRNA水平表达；(B)~(C) RT-qPCR检测RBE和HuCCT1细胞中SLC35E4敲低效果；(D) WB检测SLC35E4在正常和肝内胆管癌细胞系中的蛋白水平表达；(E) WB检测RBE细胞中SLC35E4敲低后的蛋白表达水平；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001。
Figure 2. Expression differences of SLC35E4 in iCCA cells and establishment of SLC35E4 low-expression cell line
图2. SLC35E4在iCCA细胞里的表达差异及构建SLC35E4低表达细胞系
3.3. 敲低SLC35E4抑制RBE细胞的增殖和迁移
通过CCK-8实验检测SLC35E4对肝内胆管癌细胞增殖能力的影响，结果显示，与NC组相比，SLC35E4敲低后，RBE细胞的增殖能力在贴壁后96 h明显受到抑制(p < 0.05，图3(A))。克隆形成实验结果显示，SLC35E4敲低后克隆形成的能力显著降低(p < 0.05，图3(B)~(C))。综合上述结果，SLC35E4对细胞的增殖方面具有抑制作用。为了探究敲低SLC35E4对RBE的迁移能力的影响，我们首先使用细胞划痕法检测0~48小时肝内胆管癌细胞迁移的距离。如图3(D)~(E)所示，4组细胞均在0~48 h内正常迁移，与NC组比，3个敲低组能明显抑制RBE细胞的迁移能力(p < 0.05)。综上结果表明敲低SLC35E4对RBE细胞的迁移具有明显的抑制作用。
注：(A) CCK-8检测敲低SLC35E4对RBE细胞增增殖的影响；(B) 敲低SLC35E4对细胞克隆形成的影响；(C) 克隆形成的统计图，ns：无显著性；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001；(D) 显微镜下观察0~48 h RBE细胞迁移距离，放大倍数：20×，图中粉色区域代表细胞正常迁移；(E) NC组和3个SLC35E4敲低组在0~48 h时间段中RBE细胞迁移距离的统计学比较，**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001。
Figure 3. Knockdown of SLC35E4 Inhibits the Proliferation and migration of RBE Cells
图3. 敲低SLC35E4抑制RBE细胞的增殖和迁移
3.4. 敲低SLC35E4促进RBE细胞的凋亡
为了探究敲除SLC35E4是否通过细胞凋亡抑制细胞增殖，首先使用Hoechst 33342凋亡试剂盒检测细胞的凋亡情况。如图4(A)所示，经Hoechest 33342染色后，NC组细胞呈低蓝色，而shSLC35E4-1、shSLC35E4-2和shSLC35E4-3组细胞呈高蓝色，细胞破碎状，并且可见凋亡小体。与NC组相比，3个SLC35E4敲低组中亮蓝色的凋亡细胞明显多于NC组。为了进一步佐证敲低SLC35E4对RBE凋亡的促进作用，通过WB检测肝内胆管癌细胞RBE中凋亡蛋白的表达。结果显示，敲低组的Bax的蛋白水平表达升高。除此外Cleaved caspase-3蛋白表达增加(图4(B))。这些结果证实了，敲低SLC35E4可能通过内源性和外源性途径来诱导肝内胆管癌细胞的凋亡。
注：(A) 倒置荧光显微镜下观察不同组别细胞凋亡情况；放大倍数：10×，图中箭头指向凋亡小体；(B) WB检测凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3和Bax的表达。
Figure 4. Detection of the effect of SLC35E4 knockdown on RBE apoptosis using WB and Hoechst 33342 apoptosis kit
图4. WB和Hoechst 33342凋亡试剂盒检测SLC35E4敲低对RBE凋亡的影响
4. 讨论
溶质载体(SLC)组是膜转运蛋白的第二大组，在60多个家族中有400多个成员。这些蛋白质参与许多生理过程，包括无机离子、氨基酸、糖类、脂类、神经递质和药物的转运[6]。其中SLC35家族表征了编码定位于高尔基体和/或内质网(ER)的核苷酸糖转运蛋白。大多数成员主要负责将核苷酸糖从胞质转运至内质网(ER)或高尔基体腔，为蛋白质和脂质的糖基化提供底物[7]。最近几年有关于SLC35家族在肝癌中的研究越来越多[8]-[11]。其中SLC35A2作为核苷酸糖转运体，是肝癌转移的关键因子，其在肝癌组织中上调且与患者不良预后相关；其表达改变会显著影响肝癌细胞侵袭、黏附、转移及膜聚糖谱，并导致细胞黏附相关分子表达或糖基化失调，机制上其活性对关键半乳糖基转移酶B4GALT1募集至肝癌细胞高尔基体至关重要[8]。研究发现，SLC35A2也在乳腺癌[12]、结直肠癌等[13]多种肿瘤高表达。值得注意的是SLC35C1编码鸟苷二磷酸–岩藻糖转运蛋白，可将鸟苷二磷酸–岩藻糖从细胞质转运至高尔基体和内质网，促进蛋白质糖基化[14]-[16]。有研究表明，SLC35C1在HCC和iCCA中表现出上调表达[17] [18]。在胆汁淤积相关肝癌中，上调的SLC35C1可通过促进CEACAM1在N153位点的岩藻糖基化，抑制趋化因子CCL2和CXCL2的表达，减少炎症细胞招募和浸润，从而会间接抑制因炎症反应过度导致的肝癌细胞凋亡[19]。在结肠癌中，SLC35C1是Wnt信号通路的负调节因子，下调SLC35C1可通过过度激活Wnt通路，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，进而诱导结肠癌发生[20]。由于基因家族的多个基因往往具有结构或功能上的相似性，因此根据了解其他SLC35家族成员的结构功能在一定程度上可以为SLC35E4这个孤儿转运体的研究上提供参考价值。
本研究发现，利用TIMER数据库发现SLC35E4在各类型癌症中都有不同程度的表达差异，其中相较于正常组织，SLC35E4在CHOL、LIHC、COAD等肿瘤组织中高表达，数据集验证结果一致，并进一步经实验验证SLC35E4在iCCA细胞中表达也上调。因此推测SLC35E4的表达差异确实与iCCA发生发展息息相关。接着通过ROC和K-M生存曲线分析发现SLC35E4可以作为iCCA潜在的辅助诊断指标，且其高表达与预后不良相关，表明SLC35E4具有较好的预后价值。为了进一步了解SLC35E4如何对iCCA功能进行调控，通过以RBE细胞系为模型，构建SLC35E4敲低的细胞株，探讨SLC35E4对iCCA恶性生物学行为的影响，结果发现SLC35E4敲低能显著抑制RBE细胞增殖和迁移，且促进细胞凋亡。这些都提示了SLC35E4可能通过调控肝内胆管癌细胞系 RBE 的增殖、迁移能力及凋亡过程，参与iCCA的病理发生与发展进程。由于SLC35E4的功能机制尚处于探索阶段，其作为潜在的肿瘤调控因子，对揭示iCCA的发病机制具有重要意义。
基金项目
本研究获得广西自然科学基金的资助(项目编号：2024GXNSFAA010419和2016GXNSFBA380017)，广西高校青年中年教师基础研究能力提升项目的资助(项目编号：2022KY0103)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。