枸杞多糖结合电针对鱼藤酮诱导帕金森病大鼠神经元保护作用研究

Research on the Protective Effect of Lycium barbarum Polysaccharides Combined with Electroacupuncture on Neurons of Parkinson’s Disease Rats Induced by Rotenone

摘要: 目的：观察枸杞多糖(LBP)结合电针对帕金森病(PD)模型大鼠黑质环氧合酶-2 (COX-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响，探究LBP结合电针在帕金森病治疗中的可能作用机制。方法：30只SD大鼠，随机分为：正常组、模型组、LBP组、电针组和结合组，各6只。使用鱼藤酮于颈背部皮下注射制备PD动物模型，药物组进行LBP灌胃；电针组采用高频电针(100 Hz)治疗；结合组先给予LBP灌胃，再行电针治疗；三组均治疗21天。通过免疫组化检测黑质COX-2、TH、TNF-α的表达。结果：PD大鼠黑质COX-2表达增加，LBP、电针和结合治疗都可使黑质COX-2表达降低(P < 0.01)，但结合治疗效果优于单用LBP或电针(P < 0.05)。PD大鼠黑质TNF-α表达增加，LBP、电针和结合治疗都可使黑质TNF-α表达降低(P < 0.01)，但结合治疗效果优于单用LBP或电针(P < 0.05)。PD大鼠黑质TH表达减少，LBP、电针和结合治疗都可使黑质TH表达增加(P < 0.01)，但结合治疗效果优于单用LBP或电针(P < 0.05)。结论：LBP结合电针治疗PD大鼠可有效保护PD模型大鼠的多巴胺能神经元，且作用强于单用LBP或电针。

Abstract: Objective: To observe the effects of Lycium barbarum polysaccharides (LBP) combined with electroacupuncture on the expression of substantia nigra cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor (TNF-α) and tyrosine hydroxylase (TH) in Parkinson’s disease (PD) model rats, and to explore the possible mechanism of LBP combined with electroacupuncture in the treatment of Parkinson’s disease. Methods: Thirty SD rats were randomly divided into normal group, model group, LBP group, electroacupuncture group and combined group, with 6 rats in each group. Animal models of PD were prepared by subcutaneous injection of rotenone in the neck and back, and LBP gavage was performed in the drug group. The electroacupuncture group was treated with high-frequency electroacupuncture (100 Hz). The combination group was given LBP gavage first, followed by electroacupuncture. All three groups were treated for 21 days. The expression of substantia nigra COX-2, TH, TNF-α was detected by immunohistochemistry. Results: The expression of COX-2 in the substantia nigra rats was increased, and the expression of COX-2 in the substantia nigra was decreased by LBP, electroacupuncture and combination therapy (P < 0.01), but the effect of combination therapy was better than that of LBP alone or electroacupuncture (P < 0.05). The expression of TNF-α in substantia nigra rats was increased, and the expression of TNF-α in substantia nigra was decreased by LBP, electroacupuncture and combination therapy (P < 0.01), but the effect of combined treatment was better than that of LBP alone or electroacupuncture (P < 0.05). The expression of substantia nigra TH was decreased, and LBP, electroacupuncture and combination therapy could increase the expression of substantia nigra TH (P < 0.01), but the effect of combination treatment was better than that of LBP alone or electroacupuncture (P < 0.05). Conclusion: LBP combined with electroacupuncture can effectively protect dopaminergic neurons in PD model rats, and the effect is stronger than that of LBP or electroacupuncture alone.

1. 引言

帕金森病(Parkinson’s disease)是第二大常见的神经系统退行性疾病，其发病率随年龄增长而增加，临床表现主要包括运动迟缓、静止性震颤、僵直和姿势平衡障碍、认知障碍等。帕金森病的病理标志包括路易体和路易神经突形式的神经包涵体，黑质和其他大脑区域的细胞丢失[1]。目前的治疗以多巴胺受体激动剂、左旋多巴等药物疗法为主，但在进行药物治疗的过程中，会随时间产生一系列并发症和磨损现象[2] [3]。近年来普遍共识，针灸和中药治疗对PD多种非运动症状均有较好疗效[4]。有研究表明枸杞多糖(LBP)能抑制PD模型小鼠黑质(SN)中多巴胺(DA)能神经元的凋亡[5]。环氧合酶-2 (COX-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)与酪氨酸羟化酶(TH)是PD研究的经典标志物[6]，因此本研究通过检测COX-2、TNF-α与TH的表达水平，来探讨电针结合LBP对PD治疗作用和可能机制。

2. 材料和方法

2.1. 动物及试剂

SPF级SD大鼠30只(济南朋悦实验动物繁育有限公司)，体重(190~210) g，合格证号：SCXK (鲁) 2014-0007。鱼藤酮、酪氨酸羟化酶和环氧合酶-2抗体(Affinity Biosciences公司)、TNF-α抗体、(武汉塞维尔生物科技有限公司)、枸杞多糖(由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6种单糖成分组成；纯度 ≥ 50%)购自上海源叶生物科技有限公司、PBS (solarbio公司，P1010)、二抗试剂盒(博士德生物工程有限公司)。

2.2. 实验分组

将30只SD大鼠，以6只一组的方法随机分为正常组、模型组、LBP组、电针组和结合组。

2.3. 模型制备

通过鱼藤酮皮下注射制备PD动物模型，治疗组和模型组均给予皮下注射鱼藤酮生理盐水混合液(2 mg/kg，浓度1 mg/mL)，每日1次，持续4周。

2.4. 模型筛选

参照陈忻等[7]行为学评分标准，评分在2~8分视为造模成功。

2.5. 干预方法

LBP治疗：给予LBP (100 mg/kg)灌胃，治疗21天。

高频电针治疗：电针组取合谷、太冲穴，采用连续波，高频电针(100 Hz)治疗21天。

电针结合LBP治疗：每天先LBP (100 mg/kg)灌胃，再高频电针治疗(同电针组)，治疗21天。

2.6. 标本采集

大鼠称重后用10%水合氯醛(0.4 mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔，剪开膈肌，暴露心脏，经左心室多聚甲醛灌流固定，灌注结束断头取脑，于冰上分离中脑，一部分用于Western Blot检查，另一部分用4%多聚甲醛中固定过夜，随后进行组织脱水、透明、浸蜡、包埋。

2.7. 免疫组织化学染色

制作(厚度为5 μm)连续切片，切片经脱蜡水化和抗原修复后，使用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗后，封闭液(BSA)室温封闭后滴加浓度为1:10的COX-2、TNF-α和TH一抗，放入冰箱4℃孵育过夜。第二天于37℃温箱复温30分钟，而后PBS冲洗，滴加二抗，室温孵育20分钟，滴加SABC，再次PBS冲洗后，滴加DAB显色剂，于显微镜下观察。观察后复染、脱水、封片，显微镜观察和采集图像。

2.8. 统计学处理

采用SPSS16.0统计软件行单因素方差分析进行组间比较，结果采用均数 ± 标准差表示，P < 0.05表示差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 针药结合对PD模型大鼠SN中TH表达的影响

中脑SN中的TH阳性神经元的胞浆染色为棕褐色，对照组SN中的TH阳性神经元密度较高，胞体呈圆形或椭圆形且轮廓清晰，胞浆深染，突起可见。相较对照组，模型组SN中的TH阳性神经元密度显著下降(P < 0.01)，胞浆染色变浅，形态轮廓畸形或缺损，突起减少或消失。与模型组比较，LBP组、电针组和结合组SN中TH阳性神经元密度均有显著增加(P < 0.01)，且形态、轮廓和突起情况都有不同程度的恢复。相较LBP组，电针组SN中TH表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)，结合组SN中TH阳性神经元密度有所增加(P < 0.05)。相较电针组，结合组SN中TH阳性神经元密度增加(P < 0.05) (见表1，图1)。

Table 1. Effects of electroacupuncture combined with LBP on TH expression in rats with PD model

表1. 电针结合LBP对PD模型大鼠TH表达的影响

组别	细胞数(个/高倍视野)
对照组	35.78 ± 2.22
模型组	15.20 ± 1.80☆
LBP组	25.92 ± 2.23☆△
电针组	24.63 ± 1.97☆△
结合组	31.15 ± 2.28☆△□○

注：与对照组比较，_☆P < 0.01，与模型组比较，_△P < 0.01，与LBP组比较，_□P < 0.05，与电针组比较，_○P < 0.05。

注：(A) 正常组；(B) 模型组；(C) LBP组；(D) 电针组；(E) 结合组。

Figure 1. Expression of TH

图1. TH的表达

3.2. 针药结合对PD模型大鼠SN中COX-2表达的影响

SN中COX-2阳性神经元胞浆染色为棕黄色，对照组SN中COX-2阳性神经元密度较低。相较对照组，模型组SN中COX-2阳性神经元密度明显增加(P < 0.01)。相较模型组，LBP组、电针组和结合组SN中COX-2阳性神经元密度均显著减少(P < 0.01)。相较LBP组，电针组SN中COX-2表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)，结合组SN中COX-2表达显著减少(P < 0.01)。相较电针组，结合组SN中COX-2表达显著减少(P < 0.01) (见表2，图2)。

Table 2. Effects of electroacupuncture combined with LBP on COX-2 expression in rats with PD model

表2. 电针结合LBP对PD模型大鼠COX-2表达的影响

组别	细胞数(个/高倍视野)
对照组	14.53 ± 1.96
模型组	45.93 ± 2.28☆
LBP组	35.68 ± 2.30☆△
电针组	35.80 ± 2.24☆△
结合组	24.63 ± 1.97☆△□○

注：与对照组比较，_☆P < 0.01，与模型组比较，_△P < 0.01，与LBP组比较，_□P < 0.05，与电针组比较，_○P < 0.05。

注：(A) 正常组；(B) 模型组；(C) LBP组；(D) 电针组；(E) 结合组。

Figure 2. Expression of COX-2

图2. COX-2的表达

3.3. 针药结合对PD模型大鼠SN中TNF-α表达的影响

SN中TNF-α阳性神经元胞浆染色为棕黄色，对照组SN中TNF-α阳性神经元密度较低。相较对照组，模型组SN中TNF-α阳性神经元密度明显增加(P < 0.01)。相较模型组，LBP组、电针组和结合组SN中TNF-α阳性神经元密度均显著减少(P < 0.01)。相较LBP组，电针组SN中TNF-α表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)，结合组SN中TNF-α表达显著减少(P < 0.01)。相较电针组，结合组SN中TNF-α表达显著减少(P < 0.01) (见表3，图3)。

Table 3. Effects of electroacupuncture combined with LBP on TNF-α expression in rats with PD model

表3. 电针结合LBP对PD模型大鼠TNF-α表达的影响

组别	细胞数(个/高倍视野)
对照组	8.73 ± 1.80
模型组	31.13 ± 2.18☆
LBP组	25.58 ± 2.29☆△
电针组	25.78 ± 2.23☆△
结合组	15.97 ± 1.81☆△□○

注：与对照组比较，_☆P < 0.01，与模型组比较，_△P < 0.01，与LBP组比较，_□P < 0.05，与电针组比较，_○P < 0.05。

注：(A) 正常组；(B) 模型组；(C) LBP组；(D) 电针组；(E) 结合组。

Figure 3. Expression of TNF-α

图3. TNF-α的表达

4. 讨论

COX-2属于环氧合酶家族中的一种诱导型酶，在炎症、肿瘤或细胞损伤时被诱导高表达，NF-κB通路的激活可触发其释放[8]。COX-2作为神经炎症标志物，在神经退行性疾病的发生、诊断和治疗中发挥作用[9]。COX-2存在于黑质致密部(SNpc)的DA能神经元和小胶质细胞内，在PD患者和PD动物模型的大脑黑质中发现COX-2表达增加[10] [11]。有研究表明COX-2/前列腺素E2 (PGE2)介导的神经元炎症导致DA能神经元的凋亡[12]。另有研究发现通过抑制COX-2的表达可以减少PD患者的炎症反应和淀粉样沉积，从而挽救DA能神经元[13]。以上研究提示COX-2在PD黑质DA能神经元的变性和神经炎症过程中起到显著影响。

TNF-α作为帕金森病神经炎症的主要介质之一，与其他细胞因子类似，由活化的小胶质细胞和星形胶质细胞产生。尽管TNF-α可以在大脑中具有神经保护作用，但长期的神经炎症和TNF释放可能是有害的，具有导致少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元死亡的神经毒性作用，因此与神经退行性变有关[14]。TNF-α与COX-2一样，同样受NF-κB的调控[15]。有研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)/蛋白激酶B (AKT)/TNF/神经系统一氧化碳合酶(iNOS)信号通路可能会影响PD的发生发展[16]。

LBP是从中药枸杞子中提取一种水溶性多糖，具有极高的药用价值且无毒副作用。能通过减少细胞凋亡、降低神经炎症、增强自噬、改善线粒体功能、改善氧化应激来治疗神经退行性疾病[17]。且研究表明氧自由基和氧化应激与PD的发病机制有关，而LBP通过下调细胞内Ca²⁺和NF-κB通路阻断神经系统一氧化碳合酶(nNOS)和iNOS来防止神经元的细胞凋亡[18]。SONG等[19]研究发现，LBP提高了蚕PD模型的运动能力、多巴胺水平和TH活性。有进一步研究发现，LBP已被证明是一种新的PI3K/AKT/核因子E2相关因子2 (Nrf2)轴激活剂，可防止氧化应激的发展[20]。

近年来研究表明电针能改善PD模型大鼠的形态学表现，使DA能神经元中TH的mRNA表达增高，提升DA能神经元密度[21]。有研究发现电针可能调控胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)/胰岛素受体底物1 (IRS-1)/PI3K/AKT胰岛素信号转导通路，部分恢复PD模型小鼠的TH下降，保护DA能神经元，缓解PD模型小鼠的运动障碍[22]。单纯的电针或药物治疗虽然有疗效，但针药结合一方面能够提升疗效，还能减少药物的用量，缓解剂末现象。使用针药结合治疗可显著降低PD患者神经炎症因子水平，促进神经功能恢复[23]。另有研究表明电针联合中药对PD模型小鼠DA神经元起到保护作用[24]。

TH作为合成DA的关键酶，与PD发病具有直接联系。本研究结果表明电针结合LBP治疗PD大鼠可使其黑质TH表达增加，COX-2表达减少，效果优于单纯LBP或电针治疗，其机制可能是LBP通过下调NF-κB通路，从而降低COX-2和TNF-α表达，减轻其介导的炎性反应。同时LBP协同电针激活PI3K/AKT，增加黑质TH的表达，进而保护DA能神经元。

声 明

本研究获得石河子大学伦理委员会批准。

NOTES

^*通讯作者。