植入前无创胚胎选择技术：从培养基中提取的miRNA到AI的多维评估

Non-Invasive Preimplantation Embryo Selection: From Culture Medium miRNA to Multidimensional Evaluation with AI

摘要: 辅助生殖技术(ART)为不孕夫妇带来新的希望，但胚胎选择方法仍是影响妊娠结局的关键因素。本文综述了无创胚胎选择的主要研究进展，包括培养基中的miRNA与cfDNA检测、延时成像(TLI)和人工智能(AI)分析。传统形态学评估和PGT-A虽被广泛应用，但分别存在主观性强与侵入性高等局限。相比之下，无创技术在保障胚胎安全的同时，能够从分子、生物学及形态学多维度提供更客观的评估。当前证据表明，这些方法在提高胚胎筛选准确性、缩短妊娠周期和提升活产率方面具有潜力。然而技术标准化不足、结果一致性差及成本效益不明仍是推广的主要障碍。未来研究应聚焦多模态数据融合与大规模临床验证，以推动无创技术在ART中的临床转化，并为个体化胚胎选择提供可靠依据。

Abstract: Assisted reproductive technology (ART) has brought new hope to infertile couples, yet embryo selection remains a critical factor influencing pregnancy outcomes. This review summarizes recent advances in non-invasive embryo selection, including microRNA (miRNA) and cell-free DNA (cfDNA) detection in spent culture media, time-lapse imaging (TLI), and artificial intelligence (AI)-based analysis. Conventional approaches, such as morphological assessment and preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A), are widely used but limited by subjectivity and invasiveness, respectively. In contrast, non-invasive techniques ensure embryo safety while providing multidimensional evaluation from molecular, biological, and morphokinetic perspectives. Current evidence suggests their potential to improve selection accuracy, shorten time to pregnancy, and increase live birth rates. However, lack of technical standardization, inconsistent reproducibility, and unclear cost-effectiveness remain major barriers to clinical application. Future research should focus on multimodal data integration and large-scale clinical validation to promote the translation of non-invasive technologies in ART and support individualized embryo selection strategies.

1. 引言

辅助生殖技术在过去四十年中为全球数百万不孕夫妇带来希望，但活产率仍徘徊在25%~30% [1]众多因素影响着IVF/ICSI周期后的妊娠率，多数观点认为胚胎质量是主要因素[2] [3]，非整倍体可导致植入失败或早期流产[4]-[6]，现如今该问题的核心在于胚胎选择技术的局限性。

传统的胚胎选择方法主要依赖于形态学评估(如观察细胞均一性、分裂速度)和侵入性遗传学检测(如PGT-A)。形态学评估胚胎发育的缺点主要为主观性强且预测价值有限，PGT-A则需通过活检获取胚胎一部分细胞，存在损害胚胎发育潜力、引起伦理问题及费用高昂、对检测人员专业技术要求较高等弊端[2] [7] [8]。胚胎嵌合也可能会导致PGT-A的假阳性和假阴性，因为产生胎儿的内细胞团(ICM)没有被检测[7]。

由于上述原因，学界更倾向于开发和实施非侵入性胚胎选择技术，通过分析胚胎培养基中的培养液所含生物标志物或利用非侵入性动态监测手段，以实现安全、精准、可重复的胚胎评估。其次，通过发掘更精准安全的胚胎选择技术，也可减少患者移植胚胎的次数及成功妊娠所需的时间。近年基于废培养基(SECM)的miRNA分析、cfDNA检测、延时成像(TLI)及人工智能(AI)整合技术成为研究热点，但存在的优点与不足也较为明显。这些技术提供了互补的不同维度的胚胎信息，miRNA、cfDNA揭示了分子与遗传层面的状态，TLI捕捉了动态发育的形态学表型，而AI则提供了融合多模态数据、实现精准预测的计算框架。本文旨在系统综述上述无创技术的原理、应用与局限性，并探讨多种技术协同应用，以期为优化ART结局提供合理的综合方案及理论依据。

2. 基于生物学标志物的无创检测技术

2.1. 培养基miRNA分析

胚胎发育潜能的评估需要可靠的分子标记物，而长度约19~25个核苷酸的非编码RNA因其独特的生物学特性展现出显著优势。这类高度保守的短链分子不仅可作为生理/病理预测标志物调控发育的关键过程，还能通过外泌体和微囊泡的特异性包装机制保持稳定[9] [10]，在SECM中长期保存而不易降解。研究表明，其在整倍体与非整倍体胚胎中的差异表达可间接反映胚胎的染色体状态、代谢活性及发育潜能[11]，以及与胚胎干细胞未分化状态的相关性，为无创胚胎评估提供了新的研究方向。

在辅助生殖领域，miRNAs的无创检测展现出独特的临床应用价值。相较于传统蛋白质标志物，其稳定的特性允许通过标准化流程进行高效提取和精准定量，结合qRT-PCR或NGS测序技术可实现可靠分析。这种检测方法完全规避了侵入性操作的风险，在确保胚胎安全的同时，为从卵裂期到囊胚期的连续发育评估提供了可能。现有的前瞻性研究设计进一步验证了其临床实用性，使胚胎移植手术能够与分子分析在同日内完成，大大提升了诊疗效率。

尽管培养液miRNA表达谱在一定程度上可反映胚胎质量，但miRNAs标志物的选择仍未得出确定性结论。研究发现在非整倍体胚胎的SECM中存在2种miRNA，即miR-191和miR-372具有特异性，其中较高水平的miR-191与非整倍体培养基样本和失败的IVF周期相关，推测miR-191可能是胚胎非整倍体和随后妊娠失败的生物标志物[11]。miR-372虽与倍性无关，但其高浓度同样预示不良妊娠结局。进一步研究发现miR-191和miR-372在ICSI受精的培养基中表达含量更高，研究者提出可能是ICSI后引起的胚胎物理损伤或胚胎细胞应激造成更多的miRNA分泌到培养基中，因此ICSI可能改变miRNA的分泌模式，可能降低其作为普适性预测标志物的可靠性[11]，未来或许需区分IVF/ICSI来源建立独立数据库。

差异表达的miRNAs不仅是评估胚胎质量和预测妊娠结局的潜在生物标志物，更是揭示胚胎与母体着床微环境间复杂对话机制的关键介质。MiRNAs的调控角色首先体现在囊胚阶段，在SECM中鉴定出特定的miRNA群体，其中一部分被预测参与子宫内膜功能调控，为miRNA介导胚胎着床前交互提供了直接依据[12]。植入失败囊胚的SECM中hsa-miR-661、hsa-miR-21-5p和hsa-miR-372-5p显著高表达，进一步表明这些miRNAs的异常升高可能不利于着床[13]。在更早的卵裂期，成功妊娠胚胎的培养液中Hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-21-5p表达显著降低，提示其低表达可能预示良好结局[9]。也有研究报道miRNAs的表达模式与胚胎质量和妊娠结局的关联呈现出双向性，如miR-19b-3p的丰度被报道与妊娠结局显著相关[14]，而颗粒细胞来源的hsa-miR-320a-3p和hsa-miR-483-5p的高表达则与优质胚胎率和活产率呈负相关[15]。综合来看，这些在不同胚胎阶段、不同来源样本中发现且表达差异与特定结局紧密关联的miRNAs，共同构成了一个潜在的“双相表达特征”体系。不仅为无创胚胎筛选和妊娠预测提供了丰富的候选标志物，其差异表达图谱为我们未来深入解析胚胎发育潜能、着床准备状态以及两者间精密的分子对话机制开辟了新的、极具价值的研究视角。

尽管以上多项研究报道了miRNAs与胚胎发育结局相关，但研究间结论存在显著差异。导致这种不一致的关键方法学因素包括样本来源与采集时点、受精方式差异、培养基配方、是否清除颗粒细胞或精子残留、miRNA提取与定量等。此外，样本量小和单中心队列也降低了结果的可重复性。为提高可比性，未来研究建议采用明确统一的样本收集与处理流程、报告平台与方法，并在多中心队列中进行验证。

2.2. cfDNA基因检测

胚胎在体外生长过程中会向培养液中释放游离DNA，胚胎也可能通过细胞裂解、细胞凋亡、细胞碎片或分裂细胞主动释放[16]-[18]，并在释放过程中形成了胚胎来源的特征性cfDNA。2013年有研究者首次报道了SECM中存在cfDNA，并发现低形态等级胚胎的SECM中双链DNA浓度显著高于优质胚胎，且进一步分析表明这些DNA主要来源于线粒体(mt DNA)，其含量与胚胎碎片化程度正相关，提示cfDNA可能主要来自无核的细胞质碎片而非凋亡小体[19]。还有研究者进一步证实了胚胎cfDNA的这种片段化特征，他们观察到提取的cfDNA片段大小呈现双峰分布：一个主峰位于160至220 bp区间，符合典型的凋亡片段特征；另一个较宽的次峰则位于300至400 bp区间，表明cfDNA可能同时源于凋亡和非凋亡机制[20]。这一发现得到活体成像实验的支持，他们观察到滋养外胚层(TE)在扩张过程中因机械压力导致核DNA脱落[21]。

关于cfDNA的细胞来源及其代表性问题的研究取得了重要进展，但不同研究团队的结果存在明显分歧。甲基化特征分析发现培养液中的cfDNA同时来源于ICM和TE，但在检测过程中可能受到极体、精子及颗粒细胞DNA的污染[22]。整倍体与非整倍体胚胎的ICM和TE在细胞凋亡和增殖水平上存在显著差异，与非整倍体胚胎相比，整倍体胚胎的TE和ICM表现出较低的细胞增殖和凋亡水平[23] [24]。但有研究表明整倍体胚胎反而较非整倍体胚胎释放了更多的cfDNA [16]，这一发现与传统认为凋亡是非整倍体校正机制的观点相矛盾，提示我们需要重新审视cfDNA释放的调控机制。然而，以上两种观点都认同凋亡主要发生在ICM，表明若cfDNA主要来源于凋亡细胞，可能更偏向反映ICM而非整个TE的遗传信息，从而影响其代表性。

非侵入性PGT (niPGT-A)可利用囊胚液(BF)或SECM中的cfDNA评估胚胎遗传状态，但niPGT-A的临床应用潜力仍面临准确性挑战。BF虽被早期研究[25]证实含有cfDNA，但其获取需抽吸微量囊胚液[26]，本质上属于微创操作，且样本量极小因而可能导致扩增效率低下。更重要的是，关于BF-DNA与TE活检结果一致性的研究结论存在矛盾，相关报告的一致性范围极宽(37.5%~93.8%) [27] [28]，表明其作为临床可靠遗传来源的适用性存疑。相比之下，SECM中cfDNA的获取是真正无创的，且其扩增成功率通常较高(77.3%~100%) [29]-[32]。虽然基于SECM cfDNA的niPGT-A与TE活检在某些研究中显示出高度一致性，但不同研究间的一致性率波动巨大(33%~100%) [28] [32]。关于niPGT-A结果差异，大多数研究认为影响准确性的关键因素包括母体和培养基DNA污染[32] [33]、自我校正机制[34]、TE嵌合现象等。特别需要强调的是，由于cfDNA可能主要反映ICM的遗传信息，这种ICM偏向性将直接影响检测结果对整体胚胎的代表性。为澄清上述问题，开展一项多中心、前瞻、配对设计研究很有必要。研究者可以在相同囊胚上同时采集TE活检、BF与SECM样本，使用统一的提取/扩增/测序平台，盲法生信分析并报告一致性率及95%置信区间，同时预先登记并在事后按受精方式、培养天数、胚胎碎片化程度等因子做分层分析，从而可以解析各因素对研究结果一致性的贡献。

niPGT-A能否在临床中广泛应用的关键问题是SECM中DNA的检测结果是否能够反映胚胎的遗传学状态。大多数研究认为SECM结果和对照胚胎中通常发生的不一致主要归因于母体来源的cfDNA污染及培养基原有的cfDNA污染[29] [30]，囊胚期自我校正机制和TE嵌合现象等也是影响检测结果准确性的因素。此外，通过优化一致性的定义、抽样方法、分析方法等也能够提升该技术的准确性。综上，niPGT-A技术的未来发展及其临床转化一方面依赖于从源头优化胚胎培养条件以减少背景DNA释放、并建立严格标准化的SECM采集与处理流程，以最大限度降低污染风险和技术偏倚；另一方面，研究者也应在严格设计的临床研究框架下，系统性地验证优化后技术的性能，特别是在复杂背景下的稳健性。

3. 基于形态动力学的无创检测技术

3.1. 延时成像技术(Time-Lapse Imaging)

延时成像技术(TLI)的核心价值在于其能够通过完全无干扰的连续动态监测，突破传统静态形态学评估的固有局限，为胚胎发育潜能提供基于完整发育轨迹的分析。传统胚胎评估依赖胚胎学家在固定时间点对形态进行观察和评分，然而这种方法面临多重挑战，囊胚形态分级标准尚欠精细且存在解读差异，确定最佳观察时间点存在争议[35]，且胚胎状态可能在数小时内发生显著变化，关键发育事件如异常分裂、碎片化等极易发生在观察间隔期而被遗漏[36]。理论上增加观察频率可改善信息获取，但频繁移出培养箱进行人工检查会将胚胎暴露于温度、湿度和气体波动等不良变化中，潜在地损害其活力[37]。TLI技术则从根本上解决了这一矛盾，它利用集成于培养箱内的高分辨率摄像系统和计算机图像处理，在不扰动胚胎培养环境的前提下，定时自动捕获图像并合成发育视频[38]。这不仅完整记录了从受精到囊胚形成的整个连续过程，更能精准捕捉细胞分裂同步性、碎片产生与吸收、囊胚腔形成与扩张等关键动态事件的时间节点和细节特征[37] [39]。TLI超越了传统主观的“快照式”评估，通过分析这些连续影像生成的量化形态动力学参数如分裂周期时长、囊胚扩增速率等，为胚胎学家提供了反映胚胎内在发育活力的高维度动态数据集。TLI将胚胎评估从依赖有限的静态观察转向基于连续发育轨迹的客观分析，以提升体外受精的成功率。

尽管TLI为胚胎评估引入了方法论层面的革新，其临床应用仍需客观审视其面临的成本、培训要求及循证医学挑战。TLI首要的实践障碍在于昂贵的专用设备投入以及对实验室人员进行的必要专门培训，更关键的限制在于当前支持TLI广泛取代传统培养的核心临床证据尚存在分歧。部分研究直接比较了TLI培养箱与传统培养箱的临床结局，未能发现TLI在持续培养或基于形态动力学分级方面带来显著优势[40]。另一些分析则发现尽管活产率未见差异，但使用TLI可显著提高持续妊娠率和活产率并减少早期妊娠丢失[41] [42]。以上两种观点的分歧可能是由于设备灵敏度差异及关键形态动力学参数的阈值设定缺乏国际共识，导致研究间可比性降低。此外，成像技术所积累的海量动态数据高度依赖AI算法进行分析挖掘，AI不成熟也是未能充分发挥TLI的全信息潜力的重要因素之一。因此，在方法学部分应明确报告设备型号、成像频率、关键时间点定义与注释流程，且未来的验证性RCT应采用多中心随机化、盲法结局评估，并在统计分析前预先登记形态学阈值与次要分析项，以提高结论的可比性与可重复性。

3.2. 人工智能预测

AI技术代表了一种极具前景的非侵入性胚胎评估方法，其核心优势在于能够融合来自TLI的形态动力学参数与培养基中的关键生物标志物如miRNAs、cfDNA，构建胚胎发育的多维全景视图。AI算法一方面可深度解析TLI系统捕获的胚胎动态发育过程细节，另一方面又能同步整合源自同一培养环境的生物分子信息。这种对多源异质数据的综合处理能力，使AI能够生成超越单一模态的、更客观且精准的胚胎评估模型，为无创筛选提供了强大的决策支持基础。

AI驱动的胚胎评估的核心突破在于通过机器学习深度挖掘并融合形态动力学、生物分子、遗传片段，构建超越传统方法的精准预测模型。相较于依赖特定发育阶段静态形态学观察且易受观察者差异影响的手动评估[43] [44]，AI算法能够从海量数据中自主学习与胚胎发育潜能高度关联的复杂特征模式，其预测准确性已通过多项研究证实显著优于传统方法[45]-[47]。首先，AI与TLI的深度结合将TLI从单纯的发育记录仪转变为强大的预测引擎。AI算法能够解析TLI实时捕获的完整发育轨迹，包括细胞分裂时序、囊胚扩张速率等关键参数[48]，并建立这些动态特征与植入成功及持续妊娠概率的定量关联。此外AI可同步分析SECM中的关键生物标志物，例如，通过解析反映胚胎染色体状态与发育调控的miRNAs表达谱，或结合指示遗传状态的cfDNA丰度，AI能够将这些分子信息与形态动力学参数进行多模态融合。最终，这种对TLI形态学、miRNAs调控信息及cfDNA遗传片段等多维数据的综合建模能力，有望使AI能够生成更为全面、客观且精准的胚胎评估体系[49]，为优化无创胚胎筛选和提升体外受精成功率提供了革命性的决策支持工具。

尽管AI在提升胚胎评估的客观性与效率方面潜力巨大，其迈向成熟临床应用的关键瓶颈在于模型可解释性缺失与数据依赖性风险。机器学习(ML)作为AI的核心子领域，其进一步发展的分支深度学习(DL)通过构建具有多个隐藏层的人工神经网络，在复杂的识别和分析任务中展现出显著优势。然而深度学习模型的多层决策过程缺乏透明度，从而产生了“黑匣子”一词[50]。AI模型的“黑匣子”性质导致人们难以阐明特定胚胎被判定为优质的生物学依据，这严重影响了临床医生和患者对AI决策逻辑的理解与信任[51]。AI模型的可靠性高度受限于其训练数据的规模和质量，而现有模型多数基于单中心或同质化人群数据构建，因此当AI筛选胚胎技术应用于具有不同人种或患有子宫内膜异位症或多囊卵巢综合征等复杂生殖问题的患者群体时，存在因数据偏差导致误判的风险[52]。因此，构建具有广泛代表性和多样性的高质量大型数据集是开发普适性AI模型的基石，然而严格的隐私保护、数据共享壁垒以及样本获取难度都将成为现实制约。尽管AI有望成为优化胚胎选择、最终提升辅助生殖健康活产率的理想工具，但广泛落地应用的前提在于进行进一步的多中心临床验证以确认其普适性与可靠性，并通过开发可解释AI提升决策透明度，从而确保其在临床实践中的伦理合规性与技术可信度。未来关于人工智能进行胚胎选择的研究应在方法与结果中报告并比较下列性能指标：AUC、灵敏度/特异度、准确率、PPV/NPV、F1值、校准曲线、Brier分数与决策曲线分析等。此外，研究人员需提供交叉验证结果与独立外部验证结果以检验泛化能力，并采用SHAP或LIME等方法展示模型可解释性。

4. 挑战与未来方向

4.1. 共同问题

尽管以上无创胚胎选择技术展现出巨大潜力，其临床应用仍面临多重标准化与验证挑战。首先，技术流程缺乏统一标准，miRNA和cfDNA标志物的选择存在争议，如miR-191是否优于miR-372用于非整倍体筛查，TLI的关键动态参数尚未形成国际共识，而不同AI模型的算法架构与训练数据差异导致横向比较困难。其次，现有研究多局限于回顾性小样本分析，缺乏大规模前瞻性随机对照试验(RCT)验证无创技术对活产率的提升效果。niPGT-A与PGT-A的一致性在一定条件下虽然可以得到较为理想的结果，但尚无证据表明其可显著改善妊娠结局。此外，成本效益分析仍不明确：尽管无创技术避免了活检费用，高通量测序与AI平台的高昂投入可能抵消其经济优势。未来需通过多中心协作建立标准化协议，并开展相应临床试验，以明确各技术的临床价值与适用场景。

4.2. 伦理问题

随着胚胎筛选与基因编辑技术的快速发展，辅助生殖领域也面临前所未有的伦理挑战。无创胚胎选择技术的普及，虽为不孕夫妇带来希望，却也潜藏非医学目的的胚胎基因筛选等伦理危机。目前，基于PGT的胚胎遗传筛查已可识别数百种单基因疾病，若技术监管缺位，可能催生以优化智力、外貌甚至运动能力为目标的非医学目的的胚胎基因筛选，这不仅违背生物多样性原则，更将加剧社会阶层固化，富裕家庭可通过支付高昂费用选择优质后代，弱势群体被迫承受自然生育风险[53]。例如，2018年“基因编辑婴儿”事件已引发全球对技术滥用的强烈谴责。此外，胚胎基因信息的所有权与隐私风险构成另一大争议，胚胎在筛选过程中产生的基因组数据涉及未来个体的核心生物信息，但现行法律尚未明确此类数据的归属权。

面对这些挑战，亟需构建全球协同的伦理治理框架。立法限制非医学用途筛选，确立“胚胎数据主权”归属未来个体，并通过公众参与平衡技术进步与社会伦理以避免技术霸权侵蚀人文价值。

4.3. 未来突破点

展望未来，新的非侵入性方法的开发加上先进的AI算法将导致胚胎选择的预测能力得到显著提高。人工智能算法通过同步分析miRNAs、cfDNA这两类生物标志物和TLI形态学数据，可建立三维评估模型，即在同一项研究中同时采集培养基中的miRNA和cfDNA、TLI形态学数据以及患者的临床资料，包括年龄、激素水平和受精方式等，将形态学观察、分子生物学指标与临床信息进行融合。对分子信号进行质量控制和标准化处理，挑选出最有意义的指标，影像资料提取出关键的发育时间点和形态学特征，临床信息则作为额外的辅助参考。在数据整合时，可以将所有数据直接合并后建立一个统一的预测模型，或分别分析不同来源的数据再在中间环节进行交叉关联，亦或者在最后阶段把各自的预测结果综合在一起得出结论。由于样本量往往有限，研究人员还需要使用交叉验证、迁移学习或数据扩充等方法以确保结果更可靠。同时应特别注意多中心研究之间的差异、不同类型数据可能缺失的问题，以及模型结果的可解释性。明确展示每一类数据在预测中的作用，能够使结论更透明、更容易被临床采纳。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。