摘要: 本研究旨在探讨补阳还五汤对缺血性脑卒中患者肠道菌群的影响，并基于16S rDNA测序技术揭示其潜在改善机制。研究纳入52例符合标准的缺血性脑卒中患者，随机分为西医治疗组(33例)和补阳还五汤辅助治疗组(19例)，另选取21名健康志愿者作为正常对照组。西医治疗组接受脑梗死常规治疗(含抗血小板聚集、调脂稳斑等)，补阳还五汤辅助治疗组在上述治疗基础上加用补阳还五汤。本研究将上述三组人群的16S rDNA测序数据，与公开数据库中中国地区健康中老年人群、长寿老人及百岁老人的同类数据进行标准化处理后合并，开展肠道菌群对比分析。结果显示，与健康对照组相比，缺血性脑卒中患者肠道菌群结构存在显著差异，表现为
α多样性(如Chao1指数)升高，部分被报道与炎症相关的菌属(如
Actinomyces、
Ileibacterium、
Corynebacterium和
Desulfovibrio等)丰度呈升高趋势；而长寿老人肠道菌群中，部分产短链脂肪酸(SCFA)相关菌属(如
Coprococcus、
Alistipes、
Blautia、
Lachnospira和
Eubacterium等)丰度较高，与SCFA的益生作用特征相符。补阳还五汤为治疗中风相关病症的经典中药方剂，本研究发现其辅助治疗可改变脑卒中患者的肠道菌群结构，其中部分被认为具有潜在益生功能的菌属(如
Lactobacillus)丰度升高，且能改善肠道炎症状态，这种菌群结构的调整可能为患者神经功能恢复创造有利条件。
Abstract: This study aimed to investigate the effects of Buyang Huanwu decoction (BHD) on the gut microbiota in patients with ischemic stroke and to elucidate its potential ameliorative mechanisms using 16S rDNA sequencing. Fifty-two eligible ischemic stroke patients were enrolled and randomly assigned to either the conventional Western medicine treatment group (n = 33) or the BYHWD adjunctive therapy group (n = 19). Additionally, 21 healthy volunteers were recruited as a normal control group. The conventional treatment group received standard therapy for cerebral infarction, including antiplatelet aggregation and lipid-regulating/plaque-stabilizing agents. The BHD adjunctive therapy group received BHD in addition to the conventional treatment. The 16S rDNA sequencing data from these three groups were standardized and merged with comparable data from publicly available databases containing information on healthy middle-aged and elderly individuals, long-lived elderly individuals, and centenarians from China for comparative analysis of the gut microbiota. The results revealed significant differences in the gut microbiota structure between ischemic stroke patients and the healthy controls. The patient group exhibited increased alpha diversity (e.g., Chao1 index) and an elevated abundance of certain genera reported to be associated with inflammation (such as Actinomyces, Ileibacterium, Corynebacterium, and Desulfovibrio). In contrast, the gut microbiota of long-lived elderly individuals showed a higher abundance of short-chain fatty acid (SCFA)-producing genera (e.g., Coprococcus, Alistipes, Blautia, Lachnospira, and Eubacterium), which aligns with the beneficial characteristics of SCFAs. As a classic traditional Chinese medicine formula for stroke-related conditions, BYHWD, when used as an adjunctive therapy, was found to alter the gut microbiota structure in stroke patients. This alteration included an increased abundance of genera considered to have potential probiotic functions (such as Lactobacillus) and an improvement in intestinal inflammation status. These adjustments in the microbial community structure may create a favorable environment for the recovery of neurological function in patients.
1. 引言
近年来，随着对“肠–脑轴”及其在脑卒中病理生理学中作用的深入研究，肠道微生物群与脑卒中之间的关系受到了广泛关注。肠–脑轴是指肠道与大脑之间的双向通信网络，涉及神经、内分泌和免疫途径[1]。研究表明，肠道微生物群可通过调节神经递质的合成、影响免疫系统的功能以及产生代谢产物等方式，影响大脑功能与人体健康[2]。这种复杂的相互作用在多种神经系统疾病中发挥着重要作用，包括帕金森病、阿尔茨海默病和抑郁症，而脑卒中作为最常见的神经系统疾病之一，其与肠道微生物群的关系也逐渐受到重视[3]。
研究表明，肠道微生物群的改变不仅与缺血性脑卒中的发生发展密切相关，还可能影响其预后，并作为潜在的治疗靶点[3]。已有研究显示，健康人群中丰度较高的双歧杆菌属、乳酸菌属等菌属，因具备抗炎与神经保护作用，在脑卒中患者肠道中常呈现显著降低趋势；反之，肠道菌群的紊乱状态也被证实会通过多种途径加剧脑卒中相关病理损伤[4]。这些研究表明，肠道微生物群的组成和功能可能对脑卒中的病理生理过程产生深远影响。
肠道微生物群的代谢产物在脑卒中恢复中同样扮演重要角色。例如SCFA可通过调节免疫细胞活性减轻炎症反应，胆汁酸则能通过激活特定受体改善神经功能，二者协同作用促进脑卒中后的机体修复[4]。文献综述指出，直接调节肠道菌群的方法(包括膳食纤维补充、益生菌及粪便移植)可恢复菌群稳态，且该方法基于临床前强证据和临床初步支持，已成为减轻脑卒中损伤的潜在二级预防策略[5]。高膳食纤维的饮食已被证明可以增加有益菌群的丰度，从而改善肠道屏障功能并减少炎症反应[6]。
补阳还五汤是中医里调理气血、祛痰化瘀的经典方剂，广泛应用于缺血性脑卒中的治疗，在改善脑卒中患者神经功能缺损方面具有显著疗效[7]。本研究基于16S rDNA测序技术，通过比较缺血性脑卒中患者组、补阳还五汤辅助治疗的缺血性脑卒中患者组、健康对照组以及不同年龄段老人组之间的肠道菌群差异，筛选出与疾病和长寿状态相关的标志性菌群，探讨补阳还五汤对缺血性脑卒中患者肠道菌群的影响，并揭示其潜在改善机制。
2. 材料与方法
2.1. 材料收集及储存
缺血性脑卒中诊断标准：参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2018)》中相关诊断标准制定：急性起病；局灶性神经功能缺损，少数为全面神经功能缺损；症状和体征持续时间不限；排除非血管性病因；经头颅CT、磁共振成像(MRI)检查排除脑出血。
治疗方法：参照《中国脑梗死中西医结合诊治指南(2017)》，由重庆市中医院脑病科团队协商制订具体治疗方案，给予两组患者缺血性脑卒中常规治疗，包括重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)、尿激酶、替奈普酶等药物改善脑循环，以及抗血小板、抗凝、降脂和神经保护治疗；补阳还五汤辅助治疗组在此基础上加用补阳还五汤。
补阳还五汤剂制备及用药剂量：补阳还五汤(地龙、甘草、牛膝各10 g，赤芍、当归尾、川芎、红花、桃仁、丹参、鸡血藤各15 g，黄芪60 g)，水煎400 mL，早晚口服，200 mL/次。
样本采集：本研究于重庆市中医院(三级甲等，病例来自重庆)采集脑病科缺血性脑卒中患者粪便标本(实验组及辅助治疗组，均符合病例定义且成功留取)，标本置于无菌便盒−20℃保存。研究经该院伦理审查委员会批准(批件号：2022-DWSY-sJZ)，患者家属已签署知情同意书。粪便样品送测序公司后，进行DNA提取、16SrDNA基因V3-V4区PCR扩增(引物341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT)、Illumina测序及文库构建。
2.2. 生物信息学分析
在NCBI中检索“缺血性脑卒中”、“肠道菌群”等相关关键词的项目数据及不同年龄段人类肠道菌群数据，经人工筛选后纳入均采用16S rDNA基因测序的几组数据(不同分组以代码表示，且部分经年龄和类别分组筛选，见表1)，其中前两组为采样所得，第三组由采样与公共数据库的健康人群数据合并而成，其他则来自NCBI的SRA (标识符：PRJNA665348 [8]、PRJNA830660)。
Table 1. Data grouping information
表1. 数据分组信息表
分组代码 |
数据来源 |
数据例数 |
测序平台 |
类别 |
地区 |
ais |
采集测序 |
33 |
Illumina |
中西医治疗组 |
中国 |
treat |
采集测序 |
19 |
Illumina |
补阳还五汤辅助治疗组 |
中国 |
health |
采集测序，PRJNA830660 |
21, 30 |
Illumina |
健康对照组 |
中国 |
longevity |
PRJNA830660 |
30 |
Illumina |
85~99岁健康长寿老人组 |
中国 |
centenarian |
PRJNA665348、PRJNA830660 |
37 |
Illumina |
健康百岁老人组 |
中国 |
2.3. 数据再处理和再分析
对每项选定研究的测序数据进行重新处理[9]：使用QIIME2 [10]对测序数据进行序列质量控制；使用DADA2对数据进行质量过滤、合并、去嵌合、去引物(一步完成)，并构建ASV (扩增子序列变体)特征表；然后使用Silva [11]全长数据库作为分类数据库(https://data.qiime2.org/2020.8/common/silva-138-99-nb-classifier.qza)对数据代表序列进行分类和注释；对注释后的数据进行了过滤，以去除叶绿体、线粒体污染物以及稀有ASV；基于过滤后的数据构建进化树，并进行物种多样性分析[12]。
利用Alpha多样性分析比较生境样本内物种丰富程度，选择Shannon、Simpson、Good’s coverage、observed_species、PD_whole_tree指数进行比较；利用Beta多样性分析各组间菌群结构，选择Bray-Curtis、Jaccard、weighted UniFrac、unweighted UniFrac四种距离指数；利用MetaStat对OTU (操作分类单元)和物种组成进行差异统计分析，LEfSe (线性判别分析效应大小)软件筛选组间的差异物种。
3. 结果
3.1. 肠道菌群Alpha多样性分析
Figure 1. Alpha diversity analysis
图1. Alpha多样性分析
本研究采用Shannon指数、Simpson指数、Good’s coverage指数、observed_species指数及PD_whole_tree指数进行α多样性分析(图1)。结果显示，五组样本的Good’s coverage值均接近1，表明测序深度覆盖充分、样本数据可靠。
与健康对照组相比，长寿老人组的observed_species指数、PD_whole_tree指数及Shannon指数均显著升高且具有统计学意义(p < 0.01)。说明长寿老人组肠道菌群的丰富度和多样性较高。百岁老人组的observed_species指数与PD_whole_tree指数较长寿组略有下降，但其Shannon指数仍高于健康对照组。缺血性脑卒中组的observed_species指数较健康对照组略高，其PD_whole_tree指数高于健康组，但显著低于长寿组。缺血性脑卒中组的Shannon指数与健康对照组相近，而补阳还五汤辅助治疗组该指数略低，说明补阳还五汤治疗对肠道菌群多样性的影响较大。值得注意的是，补阳还五汤辅助治疗组的observed_species指数、PD_whole_tree指数均低于缺血性脑卒中组，且Shannon指数为五组最低，未表现出菌群多样性增加。
3.2. 肠道菌群Beta多样性分析
基于Bray-Curtis和Jaccard距离的β多样性分析(PCoA图2)显示，长寿老人组与百岁老人组样本在菌群结构上较为接近，表明两组在物种丰度和组成方面具有较高的相似性。百岁老人组表现出一定的独特聚类特征，反映其具有特异性的菌群结构。补阳还五汤辅助治疗组在Bray-Curtis和Jaccard距离下的菌群结构与健康对照组相对接近，说明其菌群组成在一定程度上趋向于健康状态。Weighted UniFrac距离的分析中，PC1和PC2主成分分别解释了30.71%和13.17%的群体变异，进一步表明各组之间系统发育结构与物种丰度存在显著差异。治疗组样本在该坐标系中位置更靠近健康对照组。
Figure 2. PCoA plot comparing Beta diversity across groups
图2. 不同类Beta多样性分析PcoA分析图
3.3. 肠道菌群物种组成的变化
Figure 3. Stacked bar plot of the relative abundance of the top 15 genera
图3. 属水平top15物种丰度堆叠图
为分析各组间菌群组成的差异，本研究基于属(Genus)分类水平，对所有样本中丰度均值排名前15的菌属进行了筛选，并采用堆叠柱状图进行可视化展示(图3)；其余已知菌属统一归为“others”，未注释物种标记为“unknown”。
结果显示，在健康对照组、缺血性脑卒中组、补阳还五汤辅助治疗组、长寿老人组与百岁老人组中，Escherichia-Shigella (埃希–志贺杆菌属)和Bacteroides (拟杆菌属)在各组中均为主要菌属，整体分布无显著差异。健康对照组中，Faecalibacterium (粪杆菌属)丰度较高。Prevotella (普雷沃氏菌属)的丰度在百岁老人组、长寿老人组、健康对照组中依次递减。缺血性脑卒中组中，Akkermansia (阿克曼氏菌属)丰度较高；Bifidobacterium (双歧杆菌属)显著高于健康对照组；Subdoligranulum (小厚壁菌属)则显著低于健康对照组。在补阳还五汤辅助治疗组中，Streptococcus (链球菌属)丰度较高；Lactobacillus (乳杆菌属)较缺血性脑卒中组显著升高；Faecalibacterium和Subdoligranulum (厚壁菌属)的丰度较健康对照组下降。长寿老人组中，Faecalibacterium的丰度较高，Streptococcus丰度较低。百岁老人组中，Streptococcus显著减少，Prevotella丰度也较低。
3.4. 肠道菌群标志物种分析
在属分类水平上，Venn图(图4)与集合图(图5)显示，五组间存在明显的物种特异性。其中，缺血性脑卒中组独有23个物种，补阳还五汤辅助治疗组1个，健康对照组19个，长寿老人组6个，百岁老人组77个。
基于LEfSe分析(LDA阈值 = 2.0，图6、图7)，识别出多个具有显著丰度差异的特征菌属。与健康对照组相比，缺血性脑卒中组显著富集的菌属包括Parabacteroides、Desulfovibrio、Monoglobus、Ileibacterium等(LDA均 > 3.0，p均 < 0.05)。健康对照组中富集的菌群包括Fecalibacterium、Prevotella等。百岁老人组富集多种潜在有益菌属，如Blautia、Romboutsia、Alistipes、Collinsella、Phascolarctobacterium等，均在LDA得分较高且具有统计学差异(p < 0.05)。
Figure 4. Venn diagram at the genus level
图4. 属分类水平的Venn图
Figure 5. OTU distribution plot
图5. OTU集合图
Figure 6. Cladogram from LEfSe analysis comparing stroke patients and healthy controls
图6. 脑卒中和健康对照LEFse分析进化分支图
Figure 7. Cladogram from LEfSe analysis comparing centenarians and healthy controls
图7. 百岁老人和健康对照LEfSe分析进化分支图
4. 讨论
研究表明，肠道微生物群通过多条机制参与脑血管疾病的发生发展，可能在卒中的免疫调节、血管功能维持和神经修复中发挥关键作用[5]。越来越多的研究指出，肠道菌群与中枢神经系统之间通过神经、免疫、代谢等多重通路建立起复杂的肠–脑轴联系[13]，肠道微生态可能在卒中后的炎症应答、组织修复及功能恢复过程中发挥重要调节作用。本研究在现有肠–脑轴理论基础上，围绕缺血性脑卒中与肠道微生物群之间的潜在关联，采用16S rDNA测序技术，对脑卒中患者常规西医治疗组、补阳还五汤辅助治疗组、健康个体及长寿和百岁人群的肠道菌群进行了系统比较，揭示了脑卒中相关微生态失衡特征，并探索了中医药干预的可能改善路径。
本研究结果显示，缺血性脑卒中患者的肠道菌群结构较健康对照显著紊乱，独有OTU数量明显升高，其中炎症相关菌属(如Parabacteroides、Desulfovibrio等)丰度上升。既往研究也发现脑卒中急性期患者菌群结构向促炎型结构转变[14]。在菌群多样性方面，补阳还五汤辅助治疗组的Shannon指数及PD_whole_tree指标未呈现明显上升，甚至在部分样本中有所下降，这一结果与“多样性高即健康”的普遍观点不完全一致。已有生态学研究指出，多样性本身并不是绝对的健康标志，而更应结合功能稳定性与宿主状态来理解这一指标的实际意义[15]。根据结果推测，补阳还五汤可能有选择地调节菌群，抑制与脑卒中相关冗余菌群与潜在致病菌的生长，从而可能提升菌群生态系统的稳定性和功能性，而非单纯增加菌群种类[16]，这一过程可能与微生物群落的稳定状态转换机制相关[17]。补阳还五汤辅助治疗后，脑卒中患者的菌群结构发生明显调整，特有OTU数量大幅下降至接近健康人群水平；Bray-Curtis与Jaccard距离分析显示，补阳还五汤辅助治疗组与健康对照组间的菌群组成相近，提示该中药方剂可能通过调节肠道微生态，有效缓解卒中相关菌群失衡[18]。
菌属层面的分析进一步揭示了补阳还五汤可能的调节机制。在补阳还五汤辅助治疗组中，双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)等益生菌的丰度升高。这些菌属被认为在维持肠道屏障功能、调节免疫反应和SCFA代谢中发挥重要作用，其机制已在动物和细胞模型中得到证实[19] [20]。因此，补阳还五汤可能通过改善菌群结构及代谢产物间接促进中枢神经功能恢复。进一步比较发现，脑卒中患者与长寿人群在菌群结构上差异显著：百岁老人群体拥有最多的特有菌，结构独特且稳定，可能与其健康长寿相关；脑卒中患者则有23个特有OTU，说明脑卒中显著扰乱了原有的肠道微生态，导致某些特殊菌群过度生长。而在补阳还五汤干预后的患者中，仅检测到1个特有OTU，表明其可能促进菌群向更健康、更稳定状态转变。
在LEfSe分析中，一些菌属在不同人群中呈现特征性富集。脑卒中患者中，Parabacteroides、Desulfovibrio、Monoglobus和Ileibacterium等菌属丰度显著升高，这些菌属与炎症、毒素代谢或免疫反应增强有关，可能会加重卒中后的肠–脑轴紊乱。健康对照组富集了Fecalibacterium和Prevotella等菌群，这些菌群与肠道健康密切相关。而百岁老人群体中富集了一些有益菌属，如Blautia、Romboutsia、Alistipes、Collinsella和Phascolarctobacterium，这些菌属在多个长寿相关研究中被认为具有调节脂类代谢[21]、降低慢性炎症水平的功能[22]。这些结果进一步强调了百岁老人群体肠道菌群在维持健康和长寿方面的独特功能。
尽管整体结果支持补阳还五汤具有潜在微生态调节功能，但仍有部分现象与预期存在差异。在α多样性分析中，虽然脑卒中组的observed_species指数高于健康组，但这并不必然代表其肠道菌群更丰富或健康。这种指数升高可能反映卒中后炎症环境导致某些条件致病菌(如肠球菌等)快速增殖，进而使观察到的菌种数量增加。补阳还五汤干预后Shannon指数下降，可能是菌群生态重构初期的短期表现。
当然，研究亦存在一定不足。首先，16S rDNA测序无法深入分析微生物功能基因和代谢产物，后续将结合宏基因组、代谢组等技术进一步揭示中药干预的功能基础；其次，未对卒中患者神经功能评分、生化指标等进行量化记录，限制了菌群变化与临床恢复的联系，未来应结合临床数据建立微生态预测模型并检验其临床价值；此外，样本量有限，未来应在更大样本、多中心基础上验证结论的稳健性。
通过系统比较缺血性脑卒中患者在补阳还五汤干预前后的菌群变化，并引入长寿人群作为参照，本研究揭示了卒中患者肠道菌群的异常变化及干预后的改善方向。结合自采数据与公共数据库数据，扩展了样本异质性并提升研究结果的普适性。这些设计增强了研究的系统性与创新性。
综合本研究的发现，补阳还五汤可能通过调节肠道菌群结构，改善卒中患者的微生态失衡，推动其向更健康、稳定的状态转变。这一发现为中医药干预脑卒中后的微生态紊乱初步提供了理论和实证支持，未来需要结合更丰富的临床数据进一步验证这一作用。
5. 结论
本研究通过16S rDNA测序技术，系统分析了补阳还五汤对缺血性脑卒中患者肠道菌群的影响，并探讨了肠道微生物群与健康长寿之间的关系。研究结果表明，缺血性脑卒中患者的肠道菌群结构与健康人群存在显著差异，表现为致病性和促炎性菌种的丰度增加，而益生菌和产SCFA菌种的丰度减少。补阳还五汤辅助治疗能够显著改善脑卒中患者的肠道菌群结构，增加益生菌的丰度，可能通过调节肠道菌群来促进神经功能的恢复。
此外，长寿老人和百岁老人的肠道菌群表现出更高的多样性和产SCFA菌种的丰度，提示肠道菌群在健康长寿中可能发挥重要作用。特别是Blautia、Collinsella等产SCFA的菌种在长寿人群中显著富集，进一步支持了肠道菌群通过代谢产物(如SCFA)影响宿主健康的机制。
综上所述，肠道菌群的失调与缺血性脑卒中的发生发展密切相关，而补阳还五汤通过调节肠道菌群结构，可能为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路。同时，肠道菌群在健康长寿中的作用也为未来的抗衰老研究提供了潜在的靶点。未来的研究可以进一步探讨补阳还五汤的具体作用机制，解析肠道菌群与脑卒中、长寿之间的分子通路，为相关疾病的预防和治疗提供更多科学依据。
基金项目
本研究得到重庆市自然科学基金面上项目(cstc2021jcyj-msxmX0848)、BSKJ2022006 (重庆市璧山科研项目)和重庆邮电大学大学生创新创业项目(S202410617021, S202510617005)资助。
NOTES
*通讯作者。