1. 引言
隆起糜烂性胃炎(raised emsive gastritis, REG)是一种特殊类型的慢性胃炎，具有高度的癌变倾向[1] [2]，通常采用抗幽门螺旋杆菌感染药物、抑制胃酸分泌药物等西药、内镜介入手术治疗。健脾清化散瘀饮是基于柯晓主任多年的临床治疗REG经验拟定的验方，福建中医药大学附属第二人民医院制剂中心现将其开发制成院内制剂健脾清化散瘀颗粒，建立起质量标准研究体系是保证中药制剂在研究、生产、临床使用中质量的关键环节[3] [4]。
2. 材料
试验主要的仪器及设备如下表1。
Table 1. Main instruments and equipment
表1. 主要的仪器及设备
仪器 |
型号 |
厂家 |
高效液相色谱仪-2998PDA检测器 |
Waters e2695 |
美国Waters公司 |
高效液相色谱仪–光二极管阵列检测器 |
Dionex U3000 |
美国Thermo Fisher Scientific公司 |
超声波仪 |
SCLEAE01 |
宁波新芝生物科技股份有限公司 |
电子天平 |
EX125ZH |
奥豪斯仪器(常州)有限公司 |
超纯水制造设备 |
RO-2T |
四川卓越水处理设备有限公司 |
高速离心机 |
H17.5 |
上海卢湘仪离心机仪器有限公司 |
电子天枰 |
AL-104 |
梅特勤-托利多仪器(上海) |
药物与试剂
对照品橙皮苷(批号：110721-201818)、丹酚酸B (批号：111562-201917)、健脾清化散瘀颗粒(批号：202310018)由福建中医药大学附属第二人民医院制剂中心生产提供、色谱纯乙腈、甲醇，超纯水。
3. 方法与结果
3.1. 健脾清化散瘀颗粒中橙皮苷含量测定
3.1.1. 色谱条件
色谱柱：Acclaim 120-C18 (4.6 × 250 nm, 5 μm)，流动相：乙腈(22)-水(78)；等度洗脱，柱温30℃；检测波长为283 nm；进样量：10 μL。
3.1.2. 对照品溶液的制备
取橙皮苷对照品，加甲醇配制成2.0 mg/mL的对照品母液。
3.1.3. 供试品溶液的制备
精密称取健脾清化散瘀颗粒粉末3 g，加25 mL甲醇，300 W超声处理30分钟，甲醇补重后0.22 μm滤过，取续滤液。
3.1.4. 缺陈皮阴性供试品溶液的制备
取缺陈皮的健脾清化散瘀颗粒阴性样品，按“2.1.3”项下方法制得阴性供试品溶液。
3.1.5. 系统适应性考察
1) 专属性
取橙皮苷对照品、健脾清化散瘀颗粒供试品溶液及缺陈皮阴性供试品溶液进行测定。二者的保留时间、峰形、光谱图均一致，专属性良好(图1)。
2) 线性
用“2.1.2”项下法制备质量浓度20.00~80.00 μg/mL的对照品溶液，以“2.1.1”项下法测定峰面积，如图2建立线性回归方程，Y = 13771X + 44602，r = 0.9993。表明橙皮苷在以上浓度范围内线性良好。
3) 精密度
Table 2. Precision inspection results
表2. 精密度考察结果
序号 |
成分 |
峰面积(微伏*秒) |
RSD (%) |
1 |
橙皮苷 |
821,592 |
1.9 |
2 |
825,492 |
3 |
790,085 |
4 |
793,935 |
5 |
799,838 |
6 |
797,338 |
Figure 1. Adaptability of orange peel glycoside component system. (1) Orange peel (A) Comparison product (B) Sample of spleen-strengthening and dispelling stasis granules (C) Negative samples of missing skin
图1. 橙皮苷成分系统适应性。(1) 橙皮苷 (A) 对照品 (B) 健脾清化散瘀颗粒样品 (C) 缺陈皮阴性样品
Figure 2. Orange peel glycosides standard curve
图2. 橙皮苷标准曲线图
精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液适量，在“2.1.1”项条件下连续进样6次，结果(见表2)表明仪器精密度良好。
4) 稳定性
按“2.1.3”项下制备供试品溶液，室温下于0，2，4，6，8，12，24 h进样，结果(见表3)表明供试品溶液在24 h内稳定。
Table 3. Effect of placement time on hesperid content
表3. 放置时间对橙皮苷含量的影响
成分 |
温度 |
时间(h) |
峰面积(微伏*秒) |
均值 |
RSD (%) |
橙皮苷 |
室温 |
0 |
538,498 |
535097 |
2.4 |
2 |
513,236 |
4 |
538,980 |
8 |
536,394 |
12 |
545,590 |
24 |
541,284 |
5) 重复性
称取同一批健脾清化散瘀颗粒6份，按“2.1.3”和“2.1.1”项下方法测定，结果(表4)表明该方法重复性好。
Table 4. Repetitive inspection results
表4. 重复性考察结果
序号 |
取样量(g) |
含量(mg/g) |
含量均值(mg/g) |
RSD (%) |
1 |
3.0465 |
0.2887 |
0.2845 |
2.3 |
2 |
3.0469 |
0.2866 |
3 |
3.0461 |
0.2723 |
4 |
3.0460 |
0.2903 |
5 |
3.0363 |
0.2856 |
6 |
3.0366 |
0.2838 |
6) 加样回收率
Table 5. Sample recovery rate test results (n = 6)
表5. 加样回收率试验结果(n = 6)
样品 |
取样量(g) |
原有量(mg) |
加入量(mg) |
测得量(mg) |
回收率(%) |
平均回收率(%) |
RSD (%) |
1 |
1.5233 |
0.4334 |
0.3000 |
0.7323 |
99.62 |
99.36 |
2.0 |
2 |
1.5235 |
0.4335 |
0.3000 |
0.7324 |
99.65 |
3 |
1.5231 |
0.4333 |
0.3000 |
0.7195 |
95.36 |
4 |
1.5230 |
0.4333 |
0.3000 |
0.7343 |
100.32 |
5 |
1.5182 |
0.4320 |
0.3000 |
0.7353 |
101.11 |
6 |
1.5183 |
0.4320 |
0.3000 |
0.7323 |
100.09 |
精密称定同批次健脾清化散瘀颗粒样品6份，每份1.5 g，按照重复性结果近似1:1加入橙皮苷对照品，再按“2.1.3”和“2.1.1”项下方法检测，结果(加样回收率95.36%~101.11%，RSD2.0) (表5)表明，该方法准确性良好。
7) 样品含量的测定
精密称定3批健脾清化散瘀颗粒3 g，按上述方法制备溶液并检测计算橙皮苷的含量(见表6)。
Table 6. The content of orange peel glycosides in three batches of samples (mg/g, n = 3)
表6. 三批次样品中橙皮苷成分的含量(mg/g, n = 3)
批次 |
含量(mg/g) |
平均含量(mg/g) |
RSD (%) |
1 |
0.2739 |
0.2652 |
0.9 |
2 |
0.2661 |
3 |
0.2555 |
3.2. 健脾清化散瘀颗粒中丹酚酸B含量测定
3.2.1. 色谱条件
色谱柱：NanochromCore-300，流动相：乙腈(22)-0.1%磷酸(78)溶液；柱温25℃；检测波长286 nm；流速1.2 mL/min；进样量：10 μL。
3.2.2. 对照品溶液的制备
取丹酚酸B对照品，加甲醇配制成1.375 mg/mL的对照品母液。
3.2.3. 供试品溶液的制备
精密称取健脾清化散瘀颗粒粉末3 g，加80%甲醇25 mL，300W超声处理30分钟，80%甲醇补重后0.22 μm滤过，取续滤液。
3.2.4. 缺丹参阴性供试溶液的制备
取缺丹参的健脾清化散瘀颗粒阴性样品，按“2.2.3”项下法制得阴性供试品溶液。
3.2.5. 系统适应性考察
1) 专属性
取丹酚酸B对照品、健脾清化散瘀颗粒供试品溶液及缺丹参的健脾清化散瘀颗粒阴性供试品溶液进行测定。二者的保留时间、峰形、光谱图均一致，表明专属性好。(图3)
Figure 3. High-performance liquid chromatography of spleen-strengthening and clearing and dissipating stasis granules. (1) Danphenolic acid B. (A) Control product (B) Sample of spleen-strengthening and clearing and stasis granules (C) Negative samples of Danshen deficiency
图3. 健脾清化散瘀颗粒高效液相色谱图。(1) 丹酚酸B (A) 对照品 (B) 健脾清化散瘀颗粒样品 (C) 缺丹参阴性样品
2) 线性
用“2.2.2”项下法制备质量浓度34.38~343.75 μg/mL的对照品溶液，以“3.2.1.1”项下法测定峰面积，如图4建立线性回归方程：Y = 0.1193X + 0.8529，r = 0.9994，表明丹酚酸B在以上浓度范围内线性良好。
Figure 4. Standard curve of phenolic acid B
图4. 丹酚酸B标准曲线图
3) 精密度
精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液适量，在“2.1.1”项条件下连续进样6次，结果(见表7)表明仪器精密度良好。
Table 7. Precision inspection results
表7. 精密度考察结果
序号 |
成分 |
峰面积(mAU) |
RSD (%) |
1 |
丹酚酸B |
21.97 |
0.9 |
2 |
21.98 |
3 |
22.03 |
4 |
22.47 |
5 |
22.02 |
6 |
22.01 |
4) 稳定性
按“3.2.2.3”项下制备供试品溶液，室温下于0，2，4，8，12，24 h进样，结果(见表8)表明供试品溶液在24 h内稳定。
Table 8. Effect of placement time on phenolic acid B content
表8. 放置时间对丹酚酸B含量的影响
成分 |
温度 |
时间(h) |
峰面积(mAU) |
均值 |
RSD (%) |
丹酚酸B |
室温 |
0 |
15.07 |
15.08 |
0.2 |
2 |
15.07 |
4 |
15.03 |
8 |
15.09 |
12 |
15.10 |
24 |
15.10 |
5) 重复性
精密称取健脾清化散瘀颗粒6份，按照“2.2.3”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下方法测定，结果(见表9)表明该方法重复性好。
Table 9. Repetitive inspection results
表9. 重复性考察结果
序号 |
取样量(g) |
含量(mg/g) |
含量均值(mg/g) |
RSD (%) |
1 |
3.0091 |
0.9924 |
0.9976 |
0.4 |
2 |
3.0068 |
0.9998 |
3 |
3.0056 |
1.0028 |
4 |
3.0108 |
0.9993 |
5 |
3.0125 |
0.9986 |
6 |
3.0065 |
0.9925 |
6) 加样回收率
精密称定同批次健脾清化散瘀颗粒样品6份，每份1.5 g，按照重复性结果近似1:1加入丹酚酸B对照品，再按“2.2.3”和“2.2.1”项下方法检测，结果(加样回收率99.92%~102.09%，RSD0.8%) (表10)表明该方法准确性良好。
Table 10. Sample recovery rate test results (n = 6)
表10. 加样回收率试验结果(n = 6)
样品溶液 |
取样量(g) |
原有量(mg) |
加入量(mg) |
测得量(mg) |
回收率(%) |
平均回收率(%) |
RSD (%) |
1 |
1.5005 |
1.4968 |
1.4900 |
3.0015 |
100.99 |
101.37 |
0.8 |
2 |
1.5098 |
1.5061 |
1.4900 |
2.9949 |
99.92 |
3 |
1.4982 |
1.4946 |
1.4900 |
3.0105 |
101.74 |
4 |
1.4995 |
4.4959 |
1.4900 |
3.0073 |
101.44 |
5 |
1.4992 |
1.4956 |
1.4900 |
3.0166 |
102.09 |
6 |
1.5005 |
1.4968 |
1.4900 |
3.0173 |
102.05 |
7) 样品含量的测定
精密称定3批健脾清化散瘀颗粒3 g，按上述方法制备溶液并检测，结果(见表11)。
Table 11. The content of phenolic acid B in three batches of samples (mg/g, n = 3)
表11. 三批次样品中丹酚酸B成分的含量(mg/g, n = 3)
批次 |
含量(mg/g) |
平均含量(mg/g) |
RSD (%) |
1 |
0.9973 |
0.9953 |
0.9 |
2 |
1.0032 |
3 |
0.9853 |
4. 讨论
4.1. 指标成分的选择
党参、鳖甲为处方君药，但查阅《中国药典》均无“含量测定”项。臣药中，白术、茯苓、法半夏同样缺乏含量测定指标性成分，暂不进行含量测定，故本实验指标成分上选择了橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、小檗碱以及丹酚酸B。预实验结果表明，厚朴酚、和厚朴酚、小檗碱在处方中含量较低，色谱图下出峰不明显，且峰形不好。最终选取橙皮苷、丹酚酸B作为含量测定指标成分。
陈皮中所含黄酮类主要为橙皮苷，现代药理研究认为陈皮对肠平滑肌的作用是双向的，既能抑制胃肠运动，又能兴奋胃肠运动；Attia等[5]研究发现陈皮提取物与NaNO2的组合对蜡状芽孢杆菌、葡萄球菌具有协同抗菌活性，而单独使用橙皮苷对蜡状芽孢杆菌和铜绿假单胞菌具有协同作用，对金黄色葡萄球菌具有累加作用。
丹参含迷迭香酸、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、原儿茶醛、多糖和丹酚酸[6]，现代药理研究认为丹参具有明显的抗氧化以及加快组织修复的作用。其中酚酸是丹参的主要有效成分，具有心脑血管保护作用、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗纤维化等作用。
4.2. 供试品溶液制备条件的考察
陈皮供试品溶液制备中，对超声提取时间分别为30分钟、45分钟的供试品溶液中的橙皮苷含量进行比较，结果较为相近，故选择超声提取30分钟制备陈皮供试品溶液；丹参供试品溶液制备中，考察不同提取溶剂的提取效果，分别采用纯水、甲醇(20%, 50%, 80%, 100%)进行对比实验，80%甲醇提取效果最好。
4.3. 最大吸收波长的选择
经对橙皮苷对照品进行全波长扫描，结果显示在200 nm左右有最大吸收，但由于在此处易受溶剂吸收波长影响，同时橙皮苷成分在283 nm处也具有明显吸收，与药典及文献中一致[7] [8]故选择在283 nm波长下进行橙皮苷的含量测定。
4.4. 色谱条件的考察
本实验对橙皮苷含量测定实验中20℃、25℃、30℃共3个柱温系统进行了研究，结果显示当30℃作为柱温时，所得到的色谱峰峰形及分离效果是三者之间最好的；丹酚酸B含量测定中，本实验对乙腈−0.1%磷酸溶液、乙腈−0.2%磷酸溶液、乙腈−0.3%磷酸溶液共3个流动相系统进行了研究，结果显示当采用乙腈−0.1%磷酸溶液作为流动相系统时，所得特征峰分离度、对称性最好，且能明显缩短成分洗脱时间。
5. 小结
综上，建立了测定健脾清化散瘀颗粒中橙皮苷、丹酚酸B含量的HPLC法，并经过专属性、重复性、加样回收率、精密度、稳定性验证，表明本方法稳定性好，准确度高，重现性好，可用于健脾清化散瘀颗粒质量标准的定量分析。本研究通过两个组分来评价健脾清化散瘀颗粒的质量，具有一定局限性，下一步拟尝试建立指纹图谱结合化学计量学与多个成分定量方法，并引入熵权-TOPSIS综合评价模型，为健脾清化散瘀颗粒的质量标准提升建立奠定更深更广的研究基础。
基金项目
福建省科技厅高校产学合作项目(2023Y4010)。
NOTES
*通讯作者。