摘要: 目的：探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本-1 (Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1, MALAT1)在颅内动脉瘤(Intracranial aneurysm, IA)炎症反应的表达效应及潜在作用。方法：收集临床IA患者的组织标本，并建立大鼠IA实验模型，通过荧光定量PCR检测MALAT1表达水平及WB检测相关炎症因子(MyD88, IL-6, TNF-
α, NF-
κB)，系统分析MALAT1及这些炎症因子在IA组织与非IA组织中的差异表达特征。结果：人体组织中，与非IA组相比，IA组MALAT1表达显著上调(
P = 0.0005)；动物实验模型中，与假手术组比较，模型组大鼠IA组织MALAT1表达水平升高(
P = 0.001)，且MyD88、IL-6、TNF-
α、NF-
κB炎症因子在动物实验模型中的表达较正常血管组织显著上调(
P < 0.0001,
P = 0.0132,
P = 0.0006,
P = 0.0005)。结论：MALAT1在IA组织中高度表达，并与MyD88等炎症因子在颅内动脉瘤中的表达水平呈正相关，这表明MALAT1可能参与了IA炎症反应的表达调控。
Abstract: Objective: To investigate the expression effects and potential roles of the long non-coding RNA MALAT1 in the inflammatory response of intracranial aneurysm (IA). Methods: Tissue specimens from clinical IA patients were collected, and a rat IA experimental model was established. The expression levels of MALAT1 were detected by qPCR, and related inflammatory factors (MyD88, IL-6, TNF-α, NF-κB) were measured by Western blot (WB). Systematic analysis was conducted to compare the differential expression characteristics of MALAT1 and these inflammatory factors between IA and non-IA tissues. Results: In human tissues, MALAT1 expression was significantly upregulated in the IA group compared to the non-IA group (P = 0.0005). In animal experimental models, MALAT1 expression levels were elevated in the IA tissues of rats in the model group compared to the sham surgery group (P = 0.001), and the expression levels of inflammatory factors such as MyD88, IL-6, TNF-α, and NF-κB inflammatory factors were significantly up-regulated in the animal experimental model compared with normal vascular tissue (P < 0.0001, P = 0.0132, P = 0.0006, P = 0.0005). Conclusion: MALAT1 is highly expressed in IA tissue and positively correlates with the expression levels of inflammatory factors such as MyD88 in intracranial aneurysms, suggesting that MALAT1 may be involved in the expression regulation of the inflammatory response in IA.
1. 引言
颅内动脉瘤(Intracranial Aneurysm, IA)是神经外科常见的脑血管病变，其特征为颅内动脉壁在血流动力学应力作用下发生的病理性扩张[1]。目前IA的发病机制尚未完全阐明，但近年研究表明，炎症反应通过影响血管内皮功能、细胞外基质重塑等过程，在IA的发生发展中起关键调控作用[2]。深入解析IA的炎症调控机制，将为开发药物靶向治疗策略提供重要理论依据。长链非编码RNA肺腺癌转移相关的转录因子1 (Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)定位于染色体11q13，其转录本长度超过8000 nt，该分子不仅在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)等恶性肿瘤中异常表达[3]，近年来的研究表明MALAT1在血管性疾病的发病过程中均可起到重要的调节作用。基于上述证据，本研究通过收集人体IA组织并构建大鼠IA实验模型，进一步检测IA组织中MALAT1及相关炎症因子的表达情况，探究MALAT1在IA炎症反应中的表达效应，为探究IA的发病机制及药物治疗靶点提供依据。
2. 材料和方法
2.1. 研究对象
选取在赣南医科大学第一附属医院经影像学检查(CTA、DSA等)明确诊断为IA的患者7例，并经外科手术夹闭后取部分IA组织设为IA组，并选取同一时间段经脑外伤需去骨瓣减压术的患者2例，取部分颞浅动脉组织设为非IA组。
2.2. 实验动物与建模方法
选用SPF级Sprague-Dawley (SD)大鼠18只(雄性，8周龄)，于SPF级屏障环境中适应性饲养7天。饲养条件：恒温(22 ± 2)℃、相对湿度(55 ± 15)%，自由摄食饮水。将SD大鼠分为随机分成假手术组(Sham组)和模型组(Model组)，每组各9只大鼠。Model组：腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，经背肋缘下纵切口分离双侧肾动脉后支，并用6-0丝线结扎双侧肾动脉后支，用丝线结扎左侧颈总动脉，术后1%生理盐水代替饮用水，升高大鼠的血压提高IA造模的成功率，12周内每周记录大鼠鼠尾动脉压。Sham组：经背肋缘下纵切口分离双侧肾动脉后支但不结扎，常规饮用水喂养。术后12周麻醉后，4%多聚甲醛溶液心脏灌注处死大鼠，开颅取脑，在显微镜下观察颅底右侧动脉环尤其右侧的大脑前动脉–嗅动脉(ACA-OA)段并将其剥离，迅速置入4%多聚甲醛溶液中固定。
2.3. HE染色
动物组织石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，用苏木素染液染色3~5 min，流水冲洗后，用1%盐酸酒精分化，反蓝液反蓝，伊红染色3~5 min后，切片脱水，封片，在显微镜(BX43, Olympus)下观察组织学形态验证动物实验模型造模成功，并进一步明确IA组织与正常血管组织的组织学形态差异。
2.4. 透视电镜观察
动物组织取样后迅速放入电镜固定液室温固定2 h，再转移至4˚保存。用2.5%戊二醛固定及磷酸缓冲液固定后，经脱水、包埋、聚合、固化后，用超薄切片机切片厚度70~90 nm，3%醋酸铀–枸橼酸铅双染色后使用透射电镜观察、拍片。
2.5. 荧光定量PCR (qPCR)
采用Trizol试剂从组织中分离组织中的总RNA，使用RNA超纯提取试剂盒总RNA进行纯化处理。使用紫外可见分光光度计对总RNA样本进行定量分析与纯度评估。采用RNA特异性逆转录试剂盒将纯化后的总RNA转化为cDNA，采用荧光PCR定量仪进行扩增检测，反应步骤如下：预变性95℃，10 min；变性95℃，10 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，30 s；40个循环。选用GAPDH作为标准化参照物，基于2−ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1所示。
Table 1. qPCR primer sequences
表1. qPCR引物序列
引物 |
序列 |
GAPDH-F |
5’-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3’ |
GAPDH-R |
5’-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3’ |
MALAT1-F |
5’-CTATGCTGTTGGCACGACA-3’ |
MALAT1-R |
5’-TCCTGAGGTGACTGTGAACC-3’ |
2.6. WB检测
取各组组织样品，加入裂解液，设置65 HZ、60 s条件使用研磨仪充分研磨，12,000 r/min离心10 min。取上清液，移至新的EP管(BCA测定)，弃沉淀。小心吸取上清液，加入缓冲溶液，煮沸5 min，即得总蛋白，−20℃保存。利用BCA试剂盒检测细胞上清中蛋白质浓度，绘制标准曲线。制作SDS-PAGE胶，上样，进行蛋白电泳，转膜。3%的脱脂牛奶封闭液封闭1 h。内参一抗：Mouse Anti-β-Actin (HC201, TransGen Biotech, 1/2000)，二抗：HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (GB23301, Servicebio, 1/2000)，目的一抗：Rabbit Anti NF-κB (10745-1-AP, Proteintech, 1/500), 目的一抗：Mouse Anti MyD88 (67969-1-lg, Proteintech, 1/2000)，目的一抗：Rabbit Anti IL-6 (21865-1-AP, Proteintech, 1/500)，目的一抗：Mouse Anti TNF-a (60291-1-lg, Proteintech, 1/1000)，二抗：HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (GB23303, Servicebio, 1/2000)。孵育2小时，洗膜3次。用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像，检测相应指标蛋白含量。
2.7. 统计学分析
应用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验重复3次，定量结果采用均数 ± 标准差(SD ± X)表示。两组之间定量数值比较采用独立样本T检验。检验水准α = 0.05，P < 0.05表示具有统计学差异。
3. 结果
3.1. 人体组织MALAT1的表达
与非IA组相比，IA组的MALAT1的表达增加，差异有统计学意义(P < 0.05) (见图1)。
Figure 1. Expression of MALAT1 in human IA tissues
图1. 人体IA组织MALAT1的表达
3.2. 大鼠IA组织HE染色及透射电镜结果
模型成功标准判定：采用HE染色观察动脉瘤，(1) 颅内动脉瘤形成前期，即有内弹力层断裂但无动脉壁的膨出；(2) 颅内动脉瘤形成早期，即内弹力层完全断裂，动脉壁向外膨出，但扩张的长度小于动脉瘤颈远心和近心端之间距离的1/2；(3) 颅内动脉瘤进展期，即内弹力层完全断裂，动脉壁扩张长度大于动脉瘤颈远心和近心端之间距离的1/2。
HE染色结果显示，Sham组内弹力层、平滑肌层以及外模层细胞排列规则，无明显病变(图2(A))；Model组出现内弹力层完全断裂，动脉壁向外膨出等病变现象(图2(B))。透射电镜结果可见Sham组内皮细胞和内弹力层排列整齐，结构完整(图2(C))；Model组的超微结构主要表现为大部分内皮细胞消失，内部弹力层严重断裂，平滑肌细胞严重受损和退化，血管外膜的严重紊乱(图2(D))。
注：图A为Sham组HE染色结果；图B为Model组HE染色结果；图C为Sham组透射电镜结果；图D为Model组透射电镜结果。
Figure 2. HE staining and transmission electron microscopy results of rat IA tissues
图2. 大鼠IA组织HE染色及透射电镜结果
Figure 3. MALAT1 expression in rat IA tissues and normal arterial tissues by qPCR
图3. qPCR检测大鼠IA组织MALAT1的表达水平
3.3. 大鼠IA组织中MALAT1和炎症因子的表达情况
取大鼠动脉瘤样本(n = 9)及正常血管组织(n = 9)行qPCR检测组织中MALAT1的表达情况，结果如图3所示，与Sham组相比，Model组中MALAT1表达显著升高(P = 0.0001)。
并取动脉瘤样本行WB检测组织中MyD88、NF-κB、IL-6和TNF-α蛋白表达情况，结果如图4所示，与Sham组相比，Model组中MyD88、NF-κB、IL-6和TNF-α蛋白表达均显著升高(P < 0.0001, P = 0.0005, P = 0.0132, P = 0.0006)。结果表明在颅内动脉瘤模型中炎症通路被激活。
Figure 4. Expression of MyD88, NF-κB, IL-6 and TNF-α in rat IA tissues and normal arterial tissues by western blot analysis
图4. WB检测大鼠IA组织的MyD88、NF-κB、IL-6以及TNF-α的表达水平
4. 讨论
IA形成和破裂的病理生理基础是血管壁扩张和异常血流的相互作用，导致炎症、氧化应激、最终细胞死亡和血管壁结构完整性丧失等一系列反应[4]。IA的发病机制通常始于血流动力学应激诱导的内皮功能障碍，随后引发炎症反应和动脉瘤内血管平滑肌细胞的表型转化，这种病理进展最终通过蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶)导致细胞外基质降解，并最终导致凋亡细胞死亡，共同损害血管结构的完整性[5]。在人体IA的进展过程中，可以发现动脉血管壁中存在明显的巨噬细胞浸润现象，并且破裂的IA瘤壁中也会有大量的以巨噬细胞为代表的白细胞充斥现象，这充分地显示了血管的炎症反应与颅内动脉瘤的发生、发展和破裂具有密切的关联性。炎症反应在IA中的作用机制包括内皮功能障碍或损伤、大量的炎症反应、血管平滑肌细胞表型调制、血管外基质重塑和之后的细胞死亡以及血管壁退化[2]。目前的证据表明，IA的发病机制涉及一系列炎症介质，其中关键的促炎细胞因子包括白介素-1β (Interleukin 1β, IL-1β)、白介素-6 (Interleukin 6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α (tumornecrosis factor α, TNF-α)、转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β) [6]。
长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是指转录本长度超过200个核糖核苷酸(nt)且不具备蛋白质编码功能的RNA分子[7]。尽管缺乏蛋白质编码潜力，其通过染色质重塑、转录干扰和转录后调节表现出多方面的调控能力。因此，越来越清楚的是，lncRNA可以通过多种模式发挥作用，并且是细胞中的关键调节分子[8]。
MALAT1在恶性肿瘤中呈现异常高表达特征，其表达失调普遍存在于肺癌、乳腺癌及结直肠癌等实体肿瘤中。分子机制研究显示，该分子通过表观遗传调控、转录后修饰等多重作用途径，对肿瘤细胞的增殖加速、凋亡抑制、侵袭增强及远端转移等恶性生物学行为发挥核心调控作用。现有证据表明，MALAT1在血管疾病的发病和进展、调节炎症反应、内皮功能障碍和细胞外基质重塑中起着关键的调节作用。据报道，MALAT1在多种疾病的炎症反应调节中起着重要作用。MALAT1也可通过类风湿性关节炎中CTNNB1启动子的甲基化来阻止成纤维细胞样滑膜细胞的炎症反应，Geng X等人的研究表明，MALAT1 可以通过调节miR-23b-3p来促进α-突触核蛋白的表达，从而诱导小胶质细胞自噬障碍和导致多巴胺能神经元凋亡的炎症反应[9]。此外，MALAT1通过上调microRNA-19b来改善小鼠软骨形成ATDC5细胞中LPS诱导的炎症损伤，DNA低甲基化修饰可促进lncRNA MALAT1的表达，进而通过调节胆固醇代谢和炎症反应的NF-κB信号通路促进动脉粥样硬化性心血管疾病进展[10]。并有研究表明，抑制MALAT1可通过NF-κB信号通路减少LPS或IL-17A诱导的人中耳上皮细胞的炎症反应[11]。这些均表明MALAT1可以调控炎症信号通路。本研究中发现人体及大鼠IA组织中的MALAT1表达相较于非IA组织均是显著升高的，且与MyD88、NF-κB、IL-6、TNF-α这些炎症因子的表达呈正相关。
本课题组前期的研究工作发现MALAT1基因在颅内动脉瘤患者的外周血和颅内动脉瘤组织中表达量是升高的，且表达水平与疾病的严重程度和预后密切相关[12]。Prasanth等人[13]发现，MALAT1通过活化淀粉样蛋白抗原3 (Serum amyloid A3, SAA3)而上调葡萄糖诱导的炎性介质TNF-α和IL-6，从而调节糖尿病视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和体外血管的生成，研究表示MALAT1的低表达可作为糖尿病相关的微血管并发症的标志。Yan W等人[14]发现，IL-6可以通过ERK通路介导MALAT1的表达，从而影响人主动脉内皮细胞中NOX2的表达，在人主动脉瘤的发病机制中起到重要调节作用。Lino Cárdenas等人[15]发现，HDAC9-MALAT1-BRG1组成的复合物在人胸主动脉瘤的血管平滑肌功能障碍中起重要调节作用。Zhang Xuejing的研究[16]表明，MALAT1通过抑制血管内皮细胞的凋亡和炎症反应在缺血性脑卒中的发病机制中可以起到保护作用。总的来说，这些发现证实了MALAT1在IA、糖尿病视网膜病变、主动脉瘤以及缺血性脑卒中等血管性疾病的发病过程中均可起到重要的调节作用。
髓样分化因子88 (Myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88)是一种重要的转接蛋白，可与Toll样受体4 (TLR4)结合，导致IL-1R相关激酶(IRAK)的激活和促炎细胞因子的下游表达[17]。TLR4在被活化后可通过MyD88依赖性途径激活NF-κB信号通路。在细胞静息状态下，NF-κB信号通路通常以非活性三聚体形式存在于细胞质中，其抑制蛋白IκB通过形成稳定的NF-κB/IκB复合体维持该通路的失活状态。当IκB被外界刺激磷酸化降解后，NF-κB被释放进入细胞核启动相关基因的转录，刺激炎症因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-a的释放，引发炎症反应刺激免疫应答，同时释放的炎症因子如IL-l、TNF-a等也可激活NF-κB，从而形成反馈机制[18]。本研究通过WB检测了MyD88、IL-6、TNF-α、NF-κB的表达，与正常血管组织相比，这些炎症因子在人体大鼠IA组织中的表达均高于正常组织，这进一步证实了IA组织中的炎症信号通路进一步激活。
综上所述，炎症反应在颅内动脉瘤的发生发展中起着重要作用且MALAT1在IA等血管性疾病中可起到重要的调节作用。本文发现MyD88、IL-6、TNF-α、NF-κB炎症因子在IA组织中的表达均显著升高，这进一步证实IA的发生发展与炎症反应密切相关。且MALAT1在IA中的表达也较正常血管组织显著升高，且与MyD88等相关炎症因子的表达呈正相关，这表明MALAT1可能参与了IA炎症反应的表达调控。但本研究临床样本量(n = 7)相对有限，可能影响统计效力，未来需要扩大临床样本量以提高结论的普适性，并需要进一步的研究全面阐明MALAT1相关信号通路对IA炎症反应的作用。
道德声明
本研究获得赣南医学院伦理委员会批准(审批号：2020081)。
基金项目
江西省卫生健康委员会，科技计划项目：MALAT1基因在颅内动脉瘤炎症反应中的表达效应研究(202210888)。
NOTES
*通讯作者。