南方红豆杉8个NAC低温响应转录因子的生物信息学分析

Bioinformatic Analysis of Eight NAC Cold-Resistant Transcription Factors in Taxus chinensis var. mairei

摘要: 为揭示南方红豆杉NAC抗逆因子的分子机制提供理论依据，本研究以南方红豆杉的转录组测序数据为基础，利用生物信息学方法，对8条响应冷胁迫表达量高的南方红豆杉NAC蛋白序列的氨基酸组成、理化性质、系统进化、motif分析、亚细胞定位以及二级和三级结构开展预测和分析。研究结果表明：8个NAC转录因子的氨基酸数目差距较大，但在疏水性和稳定方面差异不大；二级结构预测中，8条氨基酸序列的结构主要由α-螺旋、β-转角与无规则卷曲组成。三级结构中各个结构均有差异，但是部分序列三维结构相似。系统进化树和蛋白互作分析结果进一步验证了转录组测序中关于转录因子功能注释的可靠性。本研究结果为南方红豆杉NAC转录因子的进一步研究提供了理论依据。

Abstract: This study provides a theoretical basis for revealing the molecular mechanism of stress resistance factors of NAC in southern Taxus chinensis var. Mairei. Based on transcriptome sequencing data of southern Taxus chinensis var. Mairei, bioinformatics methods were used to predict and analyze the amino acid composition, physicochemical properties, phylogeny, motif analysis, subcellular localization, and secondary and tertiary structures of eight NAC protein sequences with high expression levels in response to cold stress. The research results indicate that there is a significant difference in the number of amino acids among the 8 NAC transcription factors, but there is not much difference in hydrophobicity and stability; in secondary structure prediction, the structure of the 8 amino acid sequences is mainly composed of alpha helix and beta angle and random coil. Each structure in the tertiary structure has differences, but some sequences have similar three-dimensional structures. The results of the phylogenetic tree and protein interaction analysis further validated the consistency of transcription factor functional annotations in transcriptome sequencing. The results of this study provide a theoretical basis for further research on NAC transcription factors in southern Taxus chinensis var. Mairei.

1. 引言

NAC家族是一类广泛存在于植物中的转录因子，其在发育调控、胁迫应答、抗病性调控、次生生长调节和激素类信号转导等过程中均有重要作用。NAC转录因子的对应表达基因最早从矮牵牛(Petunia Juss) [1]中分离得到，随后在拟南芥的基因序列中也有类似结构发现。NAC转录因子的C端为转录调控区，为一段高度变异序列，兼具转录激活和转录抑制活性，N端为保守结构域，由160个左右的氨基酸组成，又可细分为A、B、C、D、E 5个亚域，其中A、C、D亚域的保守性较强，C和D亚域与DNA结合相关；B和E亚域的保守性较差[2]，可能与NAC结构域的不同功能有关。

目前已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tabacum)中发现了多个(>100) NAC基因[3]-[7]。作为植物中特有的一类调节蛋白，NAC转录因子不仅影响细胞形成、生长发育以及器官衰老等植物生长过程，在响应非生物胁迫时也有着非常重要的调控作用[8]，其中有20%~25%的NAC基因响应至少一种类型的非生物胁迫[9]，如人参(Panax ginseng C. A. Mey)的PgNAC05-2 [10]，长叶紫荆木(Madhuca longifolia)的MINAC026、MINAC077等在低温胁迫下表达量增加[11]；冷胁迫可显著诱导巴西橡胶树(Hevea brasiliensis) HbNAC26和HbNAC11的表达[12]；花生AtNAC3亚家族和拟南芥ANAC072基因均受到干旱和ABA的双重诱导[13]，且与ABA信号途径的调控密切相关[14]。

当前已有多种植物的NAC转录因子得到克隆与鉴定，但红豆杉的NAC相关转录因子的研究仍较少。在前期转录组学研究[15]中发现，NAC为低温诱导南方红豆杉(Taxus chinensis var. Mairei)表达上升转录子所属最多的转录因子家族。尽管NAC转录因子分布广泛且保守性较高，但编码氨基酸种类和数量差异较大，导致其作用机制或行使功能可能不尽相同。加之NAC家族在提高植物抗逆性中的重要地位，其中部分基因已在作物抗逆性基因改良育种中展现其巨大潜力。随着生物信息学方法的日趋成熟[16]，使得在转录组水平上开展南方红豆杉中重要转录因子的预测与分析成为可能。当前对于NAC的研究主要集中于拟南芥[17] [18]、水稻[19]等草本模式植物，而对强抗逆木本植物中NAC抗逆境因子的研究则相对较少，加之南方红豆杉为珍稀药用植物[20]，紫杉醇产量受低温影响显著，但其抗寒分子机制尚未明确。故有必要就红豆杉中的NAC家族转录因子的结构和功能展开研究，以期为南方红豆杉NAC转录因子基因家族的分子调控机制提供理论依据，并为南方红豆杉的抗逆境遗传改良提供科学可信的候选基因资源。

2. 材料与方法

2.1. 数据来源

本次试验选定NAC转录因子进行生物信息学分析，本实验数据来源于南方红豆杉低温胁迫的转录组学分析结果[15]，从中选择8个NAC家族的转录因子并按照其在拟南芥中cDNA表达量的顺序将其命名为TcNAC001~TcNAC008。

2.2. NAC蛋白一级结构预测与系统发生树的构建

首先将相应的cDNA序列提交至BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)平台，获得相应的氨基酸序列，再采用NCBI下的CD-Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对红豆杉NAC家族基因的蛋白序列的氨基酸数目、分子量、疏水性和等电点等理化性质进行分析。运用MEGA软件选用模型为poisson model的相邻连接法，将来自于红豆杉和拟南芥的NAC家族成员的蛋白序列构建系统进化树，并对构建的系统发育树进行自检(Boot-strap)，重复设定为1000。空位或缺失位点均当作部分删除(partial deletion)处理，其中运用MEGA内置的MUSCLE软件的IUB积分矩阵进行多重比对分析。

2.3. NAC蛋白二级结构特性分析

通过SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在线软件对NAC蛋白二级结构预测，分析其中的螺旋、转角及无规则卷曲的数量。基于已知南方红豆杉NAC基因的cDNA序列，利用MEME (https://meme-suite.org/meme/)对提取到的红豆杉NAC家族基因的蛋白序列进行保守基序(motif)的分析，设定参数motif序列进行分析搜索得到的保守域数目上限为12，保守域氨基酸残基的数量为6~60，其他为默认值，然后再用TBtools进行可视化处理；运用上海交大的Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在线平台[21]完成亚细胞定位。

2.4. NAC蛋白三级结构特性与蛋白互作分析

运用ExPaSy提供的PHYRE2 (https://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) [22]完成NAC蛋白的三级结构预测。运用ExPaSy提供的STRING12.0子平台(https://cn.string-db.org/)完成蛋白质互作分析，参考物种为Arabidopsis thaliana，互作置信度阈值设为0.7，隐藏无互作关系的节点。

3. 结果与分析

3.1. 南方红豆杉NAC蛋白一级结构分析

通过多序列拼接结果筛选得到8个南方红豆杉NAC家族的cDNA序列，根据注释cDNA结果[15]出现的顺序依次命名为TcNAC001~TcNAC008，8个南方红豆杉NAC抗冻蛋白的理化特性(表1)分析结果表明：蛋白质长度范围在604~3583个氨基酸之间；蛋白质理论等电点差异不大，均介于4.84~5.26之间；蛋白的GRAVY (平均疏水性)均为正值，表明8个抗逆境蛋白都为疏水蛋白，且GRAVY值均高于0.5，表明8个蛋白的疏水性都较强；氨基酸不稳定指数介于39~50之间，其中TcNAC005、TcNAC006、TcNAC008的不稳定性指数小于40，为稳定蛋白，其余5个蛋白均小于40。

Table 1. Physicochemical properties of eight NAC proteins from Taxus chinensis var. Mairei

表1. 8个南方红豆杉NAC蛋白的理化性质

名称	GI	cDNA长度	AA长度	分子质量/Da	理论等电点	平均疏水性	不稳定指数
TcNAC001	AT1G79580.1	1384	1384	113818.96	5.02	0.802	42.17
TcNAC002	AT5G61430.1	1877	1877	156907.3	4.89	0.822	46.53
TcNAC003	AT5G61430.1	2198	2060	172104.82	4.88	0.794	44.91
TcNAC004	AT5G61430.1	2093	2093	176067.63	4.86	0.842	50.08
TcNAC005	AT3G03200.1	3500	3500	291793.9	4.84	0.696	38.13
TcNAC006	AT5G04410.1	3271	965	78383.63	5.12	0.709	39
TcNAC007	AT1G65910.1	3583	537	44148.58	5.18	0.864	43.85
TcNAC008	AT2G17040.1	604	429	34422.99	5.26	0.743	39.27

3.2. 南方红豆杉二级结构预测及亚细胞定位分析

8个南方红豆杉NAC蛋白的二级结构分析结果(表2)显示：只有TcNAC007蛋白的α-螺旋数量高于无规则卷曲；所有蛋白β-转角的数量都远小于α螺旋或无规则卷曲。进一步比对分析发现，除TcNAC003和TcNAC004的二级结构参数较为接近，可能为相同结构类型蛋白外，其余蛋白参数则差异较大，推测其在空间结构上的相似性不高，应为不同类型蛋白。炎细胞定位结果显示除TcNAC007位于细胞膜上外，其余NAC蛋白均位于细胞核中。

Table 2. Prediction of the secondary structure of NAC protein in Taxus chinensis var. mairei

表2. 南方红豆杉NAC蛋白二级结构预测

名称	α-螺旋	β-转角	无规则卷曲	亚细胞定位
TcNAC001	87	18	283	细胞核
TcNAC002	171	61	227	细胞核
TcNAC003	214	55	257	细胞核
TcNAC004	183	56	252	细胞核
TcNAC005	311	69	545	细胞核
TcNAC006	286	60	524	细胞核
TcNAC007	460	86	290	细胞膜
TcNAC008	58	9	98	细胞核

3.3. 南方红豆杉TcNAC基因结构和保守结构域分析

对南方红豆杉8个抗逆因子的cDNA进行基因结构分析，结果显示(图1)：除TcNAC007外，其余7个cDNA均含有完整的NAM保守序列，结合前期转录组学分析结果显示，这些cDNA均可注释，表明TcNAC007的cDNA可能为不完整序列，在后续的体外扩增与表达研究时应补全使其完整。在其余完整的7个cDNA序列中，TcNAC001、TcNAC004、TcNAC005和TcNAC006的NAM序列均较长，TcNAC002和TcNAC002略短，TcNAC004最小。

Figure 1. Structural analysis of TcNAC gene in Taxus chinensis var. mairei

图1. 南方红豆杉TNAC基因结构分析

保守基序分析结果显示(图2)：motif1、motif2、motif4为8个TcNAC基因所共有；motif3为7个TcNAC基因所共有，有6个TcNAC (TcNAC001、TcNAC002、TcNAC003、TcNAC004、TcNAC006、TcNAC007)基因的未知motif3均处于参与花器发育的motif1前端，且这6个TcNAC均含有motif1、motif2、motif4，推测它们主要参与导致植物合成/利用淀粉能力不足时的花器发育调节；motif8、motif10为4个TcNAC基因(TcNAC002、TcNAC003、TcNAC004、TcNAC005)所共有；TcNAC002、TcNAC003、TcNAC004均含有所有的保守基序，应为较完整的cDNA序列，且能够响应包括激素调节、淀粉合成代谢、花器发育、GA合成与耐受性调控等在内的全部应答元件。

Figure 2. Analysis of conserved motifs of TcNAC gene in Taxus chinensis var. mairei

图2. 南方红豆杉TcNAC基因保守基序分析

3.4. 南方红豆杉NAC蛋白三级结构预测

南方红豆杉的8个抗逆境蛋白的三级结构预测结果如图3所示：这些蛋白的三维空间结构基本可分为两种类型，即条带状和盘旋状。TcNAC001、TcNAC002、TcNAC003、TcNAC004和TcNAC008以条带状为主，其中TcNAC004较TcNAC003多出一部分β-螺旋 + 无规则卷曲结构外，其余主体结构高度相似，推断可能属同源蛋白；TcNAC008结构最为简单；TcNAC005、TcNAC006、TcNAC007则相对复杂，整体结构基本相似，且TcNAC006结构更显紧凑。

Figure 3. The tertiary structure of eight NAC low-temperature response proteins in Taxus chinensis var. mairei

图3. 8个南方红豆杉NAC低温响应蛋白三级结构

3.5. 南方红豆杉NAC蛋白系统进化树分析

选用8个NAC转录因子和blast选定的61条同源序列共同构建系统进化树，结果(图4)显示：这8个cDNA分别属于五个亚族：TcNAC001、TcNAC006和TcNAC008分别单属一个亚族；TcNAC002、TcNAC003、TcNAC004属于同一个亚族；TcNAC007和TcNAC005属一个亚族。TcNAC001与藜属(Chenopodium) NAC43蛋白家族最为接近，推测TcNAC001为NAC43蛋白家族成员，尽管TcNAC002、TcNAC003、TcNAC004蛋白在Arabidopsis thaliana中的注释结果[15]分别命名为NAC100、NAC092、NAC098，结合系统发生树可以看出这三个蛋白与睡莲(Nymphaea)、南瓜(Cucurbita moschata)中NAC100蛋白最接近，推测这三个蛋白属于NAC100蛋白家族成员；TcNAC006与苦荞麦(Fagopyrum tataricum) NAC8蛋白最为接近，推断TcNAC006是NAC8蛋白家族成员；TcNAC007和TcNAC005分别与罂粟属(Papaver) NAC86和拟南芥NAC86相似度最高，推测两个蛋白均属NAC86蛋白家族成员；TcNAC008与马尾松(Pinus massoniana Lamb) NAC83最接近，推测TcNAC008为NAC83蛋白家族成员，上述进化树分析结果与注释结果一致。

Figure 4. Evolutionary tree of plant NAC protein system

图4. 植物NAC蛋白系统进化树

3.6. 南方红豆杉8个抗寒NAC转录因子蛋白互作分析

注：蛋白质在COG、NOG、KOG注释体系中的编号：TcNAC001 (COG1902、NOG010531、NOG010367)、TcNAC002 (KOG0017)、TcNAC003 (KOG0017)、TcNAC004 (KOG0017)、TcNAC005 (COG1505、NOG009424)、TcNAC006 (COG1505、NOG010747)、TcNAC008 (NOG008970、NOG008956)。

Figure 5. NAC protein interaction network association diagram

图5. NAC蛋白质互作网络关系图

对逆境响应的8个NAC蛋白展开互作分析，结果(图5)显示：TcNAC007未呈现，可能与其为不含完整NAC保守结构域有关；除TcNAC005在NOG注释时呈现出独立性外，7个TcNAC蛋白(TcNAC001~TcNAC006和TcNAC008)之间均展现出较高的互作关系，表明在应对冷胁迫时这些逆境响应蛋白之间存在高度的关联性，其中注释为NOG008956 (TcNAC001)、KOG0017 (TcNAC004)、NOG008956 (TcNAC008)的表达与其他蛋白关联程度最高，通过注释[15]比对可知这些蛋白在以模式植物Arabidopsis thaliana为参照系中的注释结果分别为SMB蛋白(SOMBRERO蛋白，转录调控因子) NAC098 (CUP-SHAPED COTYLEDON 2，STM和KNAT6的激活因子)、NAC transcription factor 29 (老黄酶OYE家族蛋白)，这些均为重要的信号通路调控蛋白，而抗逆境响应过程与植物损伤修复、渗透压调节、细胞凋亡、胚胎发育、ROS (活性氧)清除系统等均相关，故这些转录/调控/激活因子在植物遭受低温胁迫时能够呈现出较高的表达量与关联作用。

4. 讨论

冷害是除水之外，限制植物生产率及地理分布的第一重要环境因素[23]，为应对冷/低温胁迫，植物已进化出数种生理及分子适应机制，通过调节其代谢途径使植物耐寒性获得最大限度的提升。南方红豆杉作为紫杉醇的重要药源植物，挖掘其抗逆关联基因并解析其功能，可为南方红豆杉抗逆相关分子机制的研究提供优良的基因资源，也为后期的分子改良育种提供理论依据。本研究首次对南方红豆杉的8个抗逆境响应的NAC家族蛋白展开生物信息学分析，通过氨基酸序列、理化性质、保守基序的比对显示，这些蛋白在结构上与其他植物NAC转录因子[24]的结构一致；对应二级结构参数和三级结构蛋白质折叠的空间构象均展示出较高的保守性，且与其他物种的NAC蛋白结构规律[25]一致，如TcNAC006与小黑麦NAC转录因子TwNAC01十分接近[26]，推测TcNAC006在功能上除可响应低温胁迫外，也可以在遭受干旱胁迫时起调节作用。

结合进化树及蛋白质互作分析结果，进一步验证了前期功能注释的可信度，如TcNAC001与NAC43、TcNAC004与NAC098、TcNAC008与NAC83，这些蛋白在进化树中的亲缘关系最近且与其它蛋白关联程度很高，这与其分别标注为SOMBRERO蛋白[27]、CUC2 [28]、老黄酶OYE家族蛋白[29]的结果非常吻合。综上，这8个NAC转录因子在南方红豆杉的生长发育、激素调节和抗逆境胁迫等方面可能发挥重要作用，除TcNAC007的cDNA链明显不完整外，其余转录因子的cDNA均可作为研究抗逆境胁迫响应的候选基因，本研究可为南方红豆杉的抗逆性改良及良种培育提供候选基因。

基金项目

湖南省科技厅2023年省市联合自科基金项目南方红豆杉2个抗逆性关联NAC转录因子的功能研究(公示号2682)资助。