1. 引言
油菜(Brassica napus)是全球重要的油料作物，其种子可用于食用油和生物柴油生产，压榨后的菜籽饼可作为优质饲料和有机肥[1] [2]。在我国，油菜产业市场需求巨大，提升产量和品质是油菜育种的重点，但受气候条件限制、种植技术及品种抗逆性不足等因素影响，生产潜力尚未充分发挥，规模化推广面临显著挑战[3]。尤其是干旱胁迫严重制约油菜产量，因此利用基因工程技术选育抗旱新种质，已成为油菜生物技术育种的重要方向。
果聚糖(Fructan)是一类由蔗糖经果糖基转移酶催化合成的功能性多糖，因其结构多样，使得该类水溶性化合物能发挥多种生理功能，如增强植物的耐旱性与耐寒性[4]。另外，果聚糖降解生成的单糖可增加液泡内的溶质浓度，从而提升植物对多种逆境胁迫的耐受能力。在含果聚糖植物的分布具有明显的地域差异——仅约15%的被子植物及冷季型牧草以其作为主要储存碳水化合物，且这类植物更多分布于干旱和寒冷地区，在热带、多雨或水生环境中则相对稀少[5] [6]。果聚糖在植物体内以蔗糖为底物，经由蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)、果聚糖：果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)和蔗糖：果聚糖6-果糖基转移酶(6-SFT)等关键酶催化合成，并储存于液泡中，由果聚糖外水解酶(FEH)主导降解[7]。
研究证实，自1995年大麦6-SFT基因被成功克隆以来[8]，研究人员通过将不同来源的果聚糖合成关键基因导入非积累型植物，显著增强了作物的抗逆能力。在抗寒方面，果聚糖通过酶解释放果糖，降低细胞冰点，减少冰晶形成，从而保护细胞膜完整性[9]。早期，转枯草芽孢杆菌果聚糖酶合成基因(sacB)的番茄表现出良好的抗寒性状[10]；转Lr-6-SFT [11]、CMM-6-SFT [12]、HS-6-SFT [13]的烟草均提高对寒冷胁迫的抵御能力，表现为可溶性蛋白和抗氧化酶活性提高。在抗旱方面，转菜蓟1-SST/1-FFT基因的马铃薯抗旱性增强且脯氨酸含量上升[14]；转莴苣1-SST的烟草[15]及转冰草AC1-FFT的黑麦草[16]也均表现出更高的果聚糖积累与抗旱能力；小麦的Ta6-SFT转入油菜在干旱胁迫下增强了转基因植株的抗旱性[17]。此外，果聚糖还参与耐盐碱[18] [19]、耐缺氧[20]及耐重金属[21]等胁迫响应，通过调控抗氧化酶活性和信号通路系统性诱导植物的广谱抗性[22]。综上，果聚糖通过合成与降解的动态平衡，在植物应对干旱、寒冷等多种非生物胁迫中发挥核心作用，为作物抗逆遗传改良提供了有效途径。
菊芋是一种强耐旱植物，主要原因是果聚糖含量高。本研究将从抗旱性强的植株菊芋“青芋1号”中克隆的果聚糖：果聚糖-1-果糖基转移酶基因Ht1-FFT转入综合性状优良的甘蓝型油菜XY15自交系材料，通过35S启动子的调控使Ht1-FFT在转基因油菜中过表达，对Ht1-FFT转基因油菜进行抗旱性分析，为提高油菜抗旱性和扩大其栽培进行有益探讨。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
甘蓝型油菜材料“湘油15”种子来自于湖南农业大学作物表观遗传调控与发育重点实验室。菊芋材料“青芋1号”来自青海大学农林科学院青海省蔬菜遗传与生理重点实验室。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101，大肠杆菌(Escherichia coli)感受态DH5α菌株，植物表达载体pFGC5941，由作物表观遗传与发育重点实验室保存。
2.2. 试验方法
2.2.1. 引物设计
从NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查询菊芋1-FFT基因的CDS序列，自起始密码子ATG开始到终止密码子TAA全长1848bp，根据CDS序列和pFGC5941载体上常用酶切位点分析，选取NcoI和BamHI作为双酶切位点，利用诺唯赞在线网站(https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html)单片段克隆模式设计带有载体同源序列的扩增引物，使用Primer Premier5.0软件设计各种PCR检测引物(表1)。
Table 1. Primer sequences used in plasmids construction and RT-PCR
表1. 载体构建和RT-PCR所需引物序列
引物名称Primer names |
引物序列(5’-3’) Primer sequence (5’-3’) |
目的Aims |
1-FFT-F |
TTACATTTACAATTACCATGGATGCAAACCCCTGAACCCTT |
目的片段克隆
Target fragment cloningt |
1-FFT-R |
CTCTAGACTCACCTAGGATCCTTAAAAAGGGTATTGATGAATTGGTG |
BnaActin2-F |
GTCTTCTCTGCTCTTCTCA |
RT-PCR内参 |
BnaActin2-R |
CCATTCCAGTTCCATTGTC |
RT-PCR reference |
RT1-fft-F |
GTATCGGGTTACGGTGCGAT |
RT-PCR引物 |
RT1-fft-R |
TTCCTCAACGGGCCAATGAA |
RT-PCR primer |
35S-F |
CTATCCTTCGCAAGACCCTTC |
检测表达框 |
OE1-FFT-R |
TTCCTCAACGGGCCAATGAA |
Detection expression frame |
PPT-F |
CTGTGCCTCCAGGGACT |
检测PPT元件 |
PPT-R |
CGACCTCGTCCGTCTGC |
To detect PPT fragments |
2.2.2. pFGC5941-1-FFT质粒构建
以菊芋叶片为材料，用总RNA提取试剂盒Eastep® Super Total RNA Extraction Kit提取RNA，使用反转录试剂盒反转录成cDNA。以cDNA为模板，使用诺唯赞的高保真DNA聚合酶，1-FFT-F和1-FFT-R引物进行产物扩增，扩增得到Ht1-FFT基因的CDS序列。电泳切胶通过胶回收试剂盒回收目标片段，将回收片段连接到pEASY-Blunt，通过热激法转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行PCR检测，选取阳性克隆具有卡那霉素(Kan)抗性的单菌落摇菌12 h，提取质粒送公司测序。并同时用NcoLI和BamHI酶对pFGC5941载体进行双酶切，回收得到线性化目的载体。使用诺唯赞同源重组试剂将目的片段与线性化载体50℃，5 min进行连接后立即置于冰上冷却，将连接产物通过热激法转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取PCR检测为阳性克隆的菌落，扩大培养，用质粒试剂盒提取质粒一份保存一份送公司进行测序，对比分析测序结果，如无误得到pFGC5941-1-FFT质粒，测序由长沙有康生物技术公司完成。
2.2.3. 根癌农杆菌转化
采用电击转化法，将过表达载体pFGC5941-1-FFT质粒转化至根癌农杆菌GV3101中，加入无抗性的YEB培养液复苏2~3 h后，将菌株涂布于含有50 µg/mL卡那霉素、50 µg/mL利福平和50 µg/mL庆大霉素的YEB培养基上，将平板放置于28℃培养箱中培养2~3 d后，挑取单个菌落进行阳性克隆的PCR鉴定。
2.2.4. 油菜下胚轴的遗传转化
将油菜(XY15)的种子经酒精和升汞表面消毒后，均匀播种于发芽培养基中，于黑暗条件下培养6~7 d。取生长后的下胚轴，切取约0.8 cm长的下胚轴外植体作为遗传转化的外植体。用携带pFGC5941-1-FFT质粒的农杆菌GV3101 (OD600值介于0.3~0.5)菌液浸泡下胚轴外植体15 min，之后弃去菌液，将外植体置于无菌滤纸上仔细吸干表面残留菌液。随后，将下胚轴置于共培养培养基表面，在24℃下黑暗培养40~48 h。共培养结束后，将外植体转移至愈伤组织诱导培养基，置于24℃、16 h光照/8 h黑暗的培养室中培养21 d左右，期间每一周更换一次新鲜的愈伤组织诱导培养基。待愈伤组织形成后，将其转入分化培养基中诱导芽再生，每两周更换一次分化培养基，直至分化出新生叶芽。将生长至一定大小的芽切下，转接至生根培养基中培养15~20 d以促进生根。之后将已生根幼苗移栽至蛭石中进行炼苗，培养一周左右，最终定植于土壤中继续生长。
2.2.5 抗性苗的DNA水平与表达检测
用CTAB法从XY15和抗性苗的叶片中分别提取DNA。用正向引物35S-F，反向引物OE1-FFT-R进行转基因分子鉴定(表1)，同时用BnaActin2-F，BnaActin2-R引物检测提取的DNA质量，用PPT-F，PPT-R检测抗PPT的Bar基因。PCR扩增体系15 μL：DNA模版 1.0 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.2 μL，dd H2O 6.1 μL，Buffer 7.5 μL。PCR 反应程序：95℃，5 min；95℃，15 s；58℃，15 s；72℃，20 s；28个循环；72℃后终延伸10 min。PCR扩增产物用l.5%琼脂糖凝胶检测。油菜叶片材料使用试剂盒提取RNA，进行反转录得到cDNA。使用半定量引物RT1-fft-F，RT1-fft-R检测转基因植株叶片中Ht1-FFT基因的表达水平，同时以油菜BnaActin2作为内参基因。
2.2.6. 油菜干旱及复水处理
将转基因阳性苗从小花钵移栽到高28 cm × 15.5 cm的兰花盆中，在25℃，16 h/8 h (光/暗)光周期的生长室中培养生长12 d。选取与对照组(XY15)长势相对一致的转基因Ht1-FFT过表达油菜3株OEF-1，OEF-4，OEF-6进行干旱胁迫处理。控水开始前每个花盆均匀浇水200 mL后停止浇水，7 d后复水，每天每个花盆浇水200 mL。处理组分别在0 d，干旱7 d及复水2 d取样，进行后续测定。
2.2.7. 转基因油菜的抗旱生理指标检测
油菜样品取样后立即采用烘干法[23]测定叶片相对含水量，采用浸泡法[23]测定叶片相对电导率，使用Megazyme果聚糖试剂盒测定油菜果聚糖含量，并使用索莱宝(Solarbio)脯氨酸含量检测试剂盒、丙二醛含量检测试剂盒测定油菜脯氨酸和丙二醛含量，具体操作流程参考产品说明书。
3. 结果与分析
3.1. 植物表达载体pFGC5941-Ht1-FFT的构建
以菊芋cDNA为模板，采用引物1-FFT-F和引物1-FFT-R扩增得到带pFGC5941酶切位点同源臂的Ht1-FFT CDS片段。结果表明，扩增产物大小与预期一致，约为1848 bp (图1(A))。将扩增得到的目的片段回收产物与酶切后的pFGC5941线性化片段(图1(B))相连接，并转化大肠杆菌。利用设计好的载体特异性引物35S-F和1-FFT-R对转化的单菌落进行菌落PCR验证(图1(C))，结果显示阳性菌落的扩增片段大小与预期一致。经过测序分析，确认插入片段的序列及方向均正确，通过同源重组克隆连接的方法构建了Ht1-FFT过表达载体。
Note: (A) Amplification of the Ht1-FFT fragment, M: DS5000 DNA Marker, Lanes 1~2: Ht1-FFT fragment; (B) Double digestion of pFGC5941, M: 1 kb DNA Ladder Marker, Lanes 1~3: Linearized pFGC5941 fragment, CK+: Positive control plasmid; (C) Verification of positive colonies, M: DS5000 DNA Marker, Lanes 2, 3, 5: Positive colonies, CK: Blank control (ddH2O). 注：(A) Ht1-FFT片段扩增，M：DS5000 DNA Marker，1~2：Ht1-FFT片段；(B) pFGC5941双酶切，M：1 kb DNA Ladder Marker，1~3：pFGC5941线性化片段，CK+：阳性对照质粒；(C) 阳性菌落验证，M：DS5000 DNA Marker，2，3，5：阳性菌落，CK：空白对照(蒸馏水)。
Figure 1. Electrophoresis results of the pFGC5941-Ht1-FFT vector construction
图1. pFGC5941-Ht1-FFT载体构建电泳图
3.2. T0转基因植株的PCR检测与Ht1-FFT表达检测
Note: (A) Detection of Bar gene. CK-: negative control (XY15), CK+: as positive control (successfully constructed vector), CK: blank control (ddH2O), M: DL2000 DNA Marker; (B) Detection of the Ht1-FFT expression cassette. CK-: negative control (XY15), CK+: positive control (successfully constructed vector), CK: blank control (ddH2O), M: DL2000 DNA Marker; (C) DNA electrophoresis of BnaActin2 in resistant seedlings. CK-: negative control (XY15), CK+: positive control (successfully constructed vector), CK: blank control (ddH2O), M: DL2000 DNA Marker. 注：(A) Bar基因检测，CK-：阴性对照(XY15)，CK+：阳性对照(构建成功的载体)，CK：空白对照(蒸馏水)，M：DL2000 DNA Marker；(B) Ht1-FFT表达框检测，CK-：阴性对照，CK+：阳性对照(XY15)，CK：空白对照(蒸馏水)，M：DL2000 DNA Marker；(C) 抗性苗DNA BnaActin2电泳图，CK-：阴性对照(XY15)，CK：空白对照(蒸馏水)，M：DL2000 DNA Marker。
Figure 2. PCR detection of transgenic plant resistant seedlings
图2. 转基因植株抗性苗的PCR检测
借助农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，480个外植体，得到34株抗性油菜。进一步对34株抗性苗进行PCR分子检测(图2)，确认获得了6株转基因植株，阳性率为17.6%。为便于后续研究中表述，将这6个独立转化株系统一命名为OEF-1，OEF-2，OEF-3，OEF-4，OEF-5，OEF-6。
3.3. 转基因植株中Ht1-FFT转录水平的表达分析
为确认转基因的成功导入，在干旱处理前对选定株系进行了半定量RT-PCR分析。结果显示(图3)，Ht1-FFT基因在过表达株系OEF-1、OEF-4和OEF-6中均有转录表达，但在非转基因对照XY15中无表达。
Note: M: LD Marker 2 DNA Marker; CK: XY15 control; CK-: Blank control (ddH2O). 注：M：LD Marker 2 DNA Marker，CK：对照组(XY15)，CK-：空白对照(蒸馏水)。
Figure 3. Semi-quantitative RT-PCR analysis of transgenic Brassica napus
图3. 转基因油菜半定量RT-PCR分析
3.4. 转基因植株的抗旱性分析
3.4.1. 干旱胁迫及复水转基因植株形态变化分析
Note: DS-0 d: 0 days of drought stress; DS-7 d: 7 days of drought stress; RW-2 d: 2 days of re-watering; CK: Control group (XY15); OEF-1, OEF-4, OEF-6: Transgenic rapeseed lines. 注：DS-0 d：干旱胁迫0天；DS-7 d：干旱胁迫7天；RW-2 d：复水2天；CK：对照组(XY15)；OEF-1，OEF-4，OEF-6：转基因油菜株系。
Figure 4. Morphological changes in transgenic rapeseed under drought stress and rewatering
图4. 干旱胁迫及复水转基因油菜的形态变化
结合干旱胁迫0 d、7 d及复水2 d后转基因植株的形态变化(图4)可以看出，在正常水分条件下(DS-0 d)，各株系叶片无明显差异。干旱处理7 d后，对照组(XY15)表现出更为明显的叶片萎蔫和卷曲现象，而转基因株系(OEF-1、OEF-4、OEF-6)的萎蔫程度明显低于XY15。复水2 d后，所有植株叶片均恢复直立状态，其中转基因株系不仅恢复较快，且叶片舒展程度更好，叶色恢复更为明显，表明其具有较强的水分恢复能力。综上推测，Ht1-FFT基因的过表达有助于提高甘蓝型油菜对干旱胁迫的耐受能力，并在缓解干旱伤害及促进复水恢复中发挥积极作用。
3.4.2. 转基因植株中果聚糖含量变化
干旱胁迫处理前，转基因油菜中果聚糖含量显著高于未转基因对照材料(图5)，其中转果聚糖合成酶基因Ht1-FFT的植株在正常条件下已积累一定量的果聚糖。干旱胁迫7 d后，转基因株系果聚糖含量较0 d显著上升(p < 0.05)，增幅分别为OEF-1：108.01%、OEF-4：91.86%、OEF-6：109.70%，含量达15.36~16.09 mg/g；未转基因材料虽也上升21.29%，但与0 d无显著差异。复水2 d后，转基因植株果聚糖含量显著下降，但仍显著高于对照；未转基因材料果聚糖含量变化不显著。
Data are presented as mean ± SD (n = 3); Lowercase letters indicate significant differences (LSD, P <0.05). 数据以平均值 ± 标准差表示(n = 3)；小写字母表示差异显著(LSD, P < 0.05)。
Figure 5. The effect of drought stress and rewatering on fructan content in Brassica napus
图5. 干旱胁迫及复水对油菜果聚糖含量的影响
3.4.3. 油菜叶片生理生化指标的影响
1) 转基因植株相对电导率和丙二醛含量
Data are presented as mean ± SD (n = 3); Lowercase letters indicate significant differences (LSD, P < 0.05). 数据以平均值 ± 标准差表示(n = 3)；小写字母表示差异显著(LSD, P < 0.05)。
Figure 6. Effects of drought stress and rewatering on relative electrolyte leakage in Brassica napus
图6. 干旱胁迫及复水对油菜相对电导率的影响
干旱胁迫7 d时各转基因植株的相对电导率低于对照，且具显著差异(图6)，说明转基因植株在干旱胁迫下的细胞膜稳定性较好，膜结构没有受到严重的破坏。复水2 d后，各植株包括未转基因对照的相对电导率大幅降低，各转基因植株的相对电导率仍低于对照。
干旱胁迫7 d时，各转基因植株的丙二醛含量均显著低于对照(图7)，说明转基因株系的MDA积累均普遍低于对照，细胞膜损伤程度较低。复水2 d后，与干旱胁迫7 d时相比各植株包括未转基因对照的MDA含量降低，但与干旱0 d相比，复水2 d时所有材料的MDA含量仍显著高于初始水平，对照组MDA含量为初始值的9.5倍，转基因株系则为4.2至5.7倍，显示出转基因株系在短期复水后对MDA清除及叶片恢复能力优于对照组，但未完全恢复至初始状态，这可能与MDA对逆境胁迫响应慢有关。
Data are presented as mean ± SD (n = 3); Lowercase letters indicate significant differences (LSD, P <0.05). 数据以平均值 ± 标准差表示(n = 3)；小写字母表示差异显著(LSD, P < 0.05)。
Figure 7. Effects of drought stress and rewatering on MDA Content in Brassica napus
图7. 干旱胁迫及复水对油菜丙二醛含量的影响
2) 转基因植株相对含水量和脯氨酸含量
干旱胁迫7 d时各转基因植株的相对含水量和脯氨酸含量高于对照组，具有显著差异(图8；图9)，说明这些转基因植株在干旱胁迫下的保水效果较好，脯氨酸积累得越多。脯氨酸的大量积累可以提高植株渗透调节能力，越有利于维持较高的相对含水量，同时，相对含水量较高的植株，其生理代谢活动受干旱影响较小，也有更强的能力来合成脯氨酸保护植株的细胞结构免受氧化破坏。复水2 d后，与干旱胁迫7 d时相比各植株包括未转基因对照的相对含水量大幅升高，各转基因植株的相对含水量仍高于对照，各植株脯氨酸含量有所下降，未转基因的对照组的Pro含量由2.13 μg/g降至1.85 μg/g，降幅约13.29%，转基因组株系的下降幅度为22.79%~37.41%，说明复水后干旱得到缓解脯氨酸部分降解。
Data are presented as mean ± SD (n = 3); Lowercase letters indicate significant differences (LSD, P <0.05). 数据以平均值 ± 标准差表示(n = 3)；小写字母表示差异显著(LSD, P < 0.05)。
Figure 8. Effects of drought stress and rewatering on relative water content in Brassica napus
图8. 干旱胁迫及复水对油菜相对含水量的影响
Data are presented as mean ± SD (n = 3); Lowercase letters indicate significant differences (LSD, P < 0.05). 数据以平均值 ± 标准差表示(n = 3)；小写字母表示差异显著(LSD, P < 0.05)。
Figure 9. Effects of Drought Stress and Rewatering on Proline Content in Brassica napus
图9. 干旱胁迫及复水对油菜脯氨酸含量的影响
4. 讨论
本研究结果表明，过量表达Ht1-FFT基因可显著提高油菜果聚糖含量，并有效增强其抗旱性。具体而言，果聚糖含量与相对电导率和丙二醛(MDA)含量呈负相关，表明果聚糖有助于维持细胞膜完整性，减轻干旱引起的膜损伤。在干旱胁迫下，转基因植株中较高的果聚糖积累与较低的膜透性及氧化损伤密切相关，该结果与甜菜中的研究一致，提示果聚糖可能通过清除活性氧或直接稳定膜结构来缓解膜脂过氧化[24] [25]。值得注意的是，果聚糖含量与脯氨酸含量呈显著正相关(r = 0.844, p < 0.01)，表明两者在响应干旱胁迫中可能存在协同作用，且与相对含水量也呈正向变化趋势。这表明果聚糖可能作为渗透调节物质，与脯氨酸协同作用以维持细胞水分平衡[26] [27]。此外，果聚糖在油菜中的累积也可能通过激活脯氨酸合成通路，促进其在干旱条件下的积累，从而增强转基因植株在干旱胁迫下的组织水合状态与生理活性。尽管35S组成型启动子可实现果聚糖的持续积累并赋予广谱抗逆性，但其非特异性表达可能伴随植株生长代价。有研究表明，与35S启动子相比，rd29A等诱导型启动子能更有效提升植物的抗旱性[28]，体现出精准时空调控的优势。未来研究若能采用类似于rd29A胁迫诱导型启动子驱动Ht1-FFT，将有望实现果聚糖的“按需合成”，即在干旱胁迫时启动其合成途径，从而在维持抗逆能力的同时，优化植物在生长与防御之间的资源分配，是更具应用潜力的改良策略。
综上所述，本研究不仅从表型层面验证了Ht1-FFT基因在提高油菜抗旱性中的作用，还从机制层面将果聚糖积累与细胞膜保护及渗透调节两大核心过程联系起来，为通过基因工程定向改良作物抗逆性提供了理论依据与技术路径。
基金项目
国家自然基金委联合重点项目(U20A2028)，校级科学研究项目(25KJ004)。
NOTES
*通讯作者。