摘要: 目的：基于网络药理学方法，系统探讨桑白皮–葶苈子治疗分泌性中耳炎(SOM)的潜在作用机制。方法：依托TCMSP平台分析，筛选出桑白皮与葶苈子中满足“OB ≥ 30% + DL ≥ 0.18”条件的活性成分及它们的作用靶点。通过GeneCards、OMIM网站获取SOM靶点。利用Cytoscape软件分析得出“桑白皮 + 葶苈子–成分–靶点–SOM”图，识别关键活性成分。借助String网站分析并完成PPI网络图，最终分析出核心基因。运行R语言对交集基因完成GO与KEGG分析。结果：筛选出桑白皮–葶苈子共有44个活性成分，171个对应靶点。SOM疾病靶点有2731个。两者取交集后得出89个基因。网络分析显示槲皮素、山奈酚、异鼠李素、光果甘草酮、天竺葵素等可能是核心活性成分；PPI网络提示MYC、TP53、AKT1、TNF、IL6、HSP90AA1等为关键靶点。GO富集分析表明，生物过程主要集中在对脂多糖、对细菌来源分子及对肽激素的反应等；KEGG通路富集分析提示NF-
κB信号通路、MAPK信号通路等可能为桑白皮–葶苈子治疗SOM的重要通路。结论：本研究初步揭示了桑白皮–葶苈子可能通过多成分、多靶点、多通路机制干预SOM，为深入阐释该药对的药理机制提供了理论依据，也为中药复方治疗SOM的现代研究提供了新思路。
Abstract: Objective: To systematically investigate the potential mechanisms of action of Sang Bai Pi and Ting Li Zi in the treatment of secretory otitis media (SOM) based on a network pharmacology approach. Method: Based on the analysisusing the TCMSP platform, the active components that meet the criteria of “OB ≥ 30% + DL ≥ 0.18” and their corresponding therapeutic targets were screened out from Sang Baipi and Ting Li Zi. Obtain the targets of SOM through the GeneCards and OMIM databases. The “Sangbaipi and Tinglizi-Ingredient-Target-SOM” network diagram was generated and analyzed using Cytoscape software, and the key active components were identified. The PPI network diagram was analyzed and constructed using the String database, and the core genes were finally identified through subsequent analysis. R language was used to perform GO and KEGG enrichment analyses on the intersecting genes. Results: Forty-four common active components and 171 corresponding targets were screened out from Sang Baipi and Ting Li Zi. there are 2731 disease-related targets for SOM. Eighty-nine genes were obtained after taking the intersection of the two gene sets. Network analysis showed that quercetin, kaempferol, isorhamnetin, glabrone, pelargonidin, and other compounds may be the core active components; the PPI network indicated that MYC, TP53, AKT1, TNF, IL6, HSP90AA1, and other genes are the key targets. GO enrichment analysis showed that the biological processes are mainly focused on responses to lipopolysaccharides, responses to bacterial-derived molecules, and responses to peptide hormones, among others; KEGG pathway enrichment analysis indicated that pathways such as the NF-κB signaling pathway and the MAPK signaling pathway may be important pathways for Sang Baipi and Ting Li Zi in the treatment of SOM. Conclusion: This study preliminarily reveals that the Sang Bai Pi-Ting Li Zi herb pair may treat Secretory Otitis Media (SOM) through a multi-component, multi-target, and multi-pathway mechanism. It provides a theoretical basis for further elucidating the pharmacological actions of this herb pair and offers new perspectives for the modern research of TCM compounds in SOM treatment.
1. 引言
分泌性中耳炎(Secretory Otitis Media, SOM)是以鼓室积液(鼓膜完好)和听力减退为主要特点的中耳非化脓性炎性疾病。本病各个年龄段均可发病，以冬、春两季最为常见。目前其发病机制并不明确，西医多以抗生素、激素、抗组胺药、粘液促排剂等药物干预或手术治疗为主，虽能快速、有效改善病症，但长期或不当使用可能会出现并发症及不良反应，如较难愈合的鼓膜穿孔、抗生素耐药等情况[1]。
祖国医学将本病称为耳胀、耳闭[2]。纵观医史，诸位医家于“耳胀、耳闭”的论治中，皆阐发了独具匠心的学术见解，如明代医家方隅提出耳胀是清窍闭塞所致，故有“气闭耳聋”的说法，金元时期，刘完素提出“耳聋治肺”的观点[3]。桑白皮，性甘寒，归肺经，功效宣肺平喘、利水消肿，促进耳窍内多余积液排出；葶苈子，性辛苦大寒，归肺、膀胱经，功效泻肺平喘、利水消肿，药力较桑白皮强，对于病程较久、积液顽固的情况，可增强通窍利水之力；二药合用，一宣一泻，既通气闭，又除积液。为探究桑白皮–葶苈子药对治疗SOM的作用机制，本研究运用网络药理学方法，系统分析该药对的作用通路及靶点，以期为后续相关研究提供参考依据。
2. 材料与方法
2.1. 桑白皮–葶苈子成分及作用靶点筛选
在TCMSP网站(https://tcmsp.91medicine.cn/#/database)以“OB ≥ 30% AND DL ≥ 0.18”为标准检索桑白皮、葶苈子活性成分及对应靶点。进一步运用UniProt网站(https://www.uniprot.org/)选择“Reviewed (Swiss-Prot)、Human”，整合药对成分对应靶点的相关数据。将所得数据保存为“allTargets及allTargets.symbol”文件。运用R语言去除重复值后得出药物作用靶点。
2.2. SOM基因获取及“药对–疾病”共同靶点韦恩图
运用MeSH Browser(https://meshb.nlm.nih.gov/)查询分泌性中耳炎最常用的英文名称，以“Otitis Media with Effusion”为关键词，在GeneCards、OMIM数据库查询疾病基因，将两个数据库检索出的疾病基因，运用R语言去除重复的基因后将结果保存为“Disease”文件，将此文件与2.1得到的“allTargets.symbol”运用R语言获取交集基因并绘制韦恩图。
2.3. “桑白皮 + 葶苈子–成分–靶点–SOM”网络构建
将“allTargets.symbol”与“Disease”文件中的信息运用Excel表格整合为“net.network、net.type”，将整合的文件导入Cytoscape绘制“桑白皮 + 葶苈子–成分–靶点–SOM”网络图。
2.4. 蛋白互作网络(PPI)及筛选核心基因
将2.2得到的结果(89个交集靶点)导入STRING网站分析，将生物物种定为“Homo sapiens”，置信度 > 0.9，从而得到PPI。将PPI得出的结果运用Cytoscape软件分析，借助CytoNCA插件进行打分，分析导出结果文件，运用Excel表格，根据设定的阈值(大于中位值)进行筛选，最终得出核心基因。
2.5. GO和KEGG富集分析
将89个交集基因运用R语言进行GO和KEGG分析，并绘制柱状图及气泡图，探究其相关基因在GO功能与KEGG通路上的作用机制。其中GO功能分析包含分子功能(Molecular Function, MF)、细胞组分(Cellular Component, CC)及生物过程(Biological Process, BP)。
3. 结果
3.1. 桑白皮–葶苈子活性成分及作用靶点
经检索获得桑白皮活性成分32种，对应靶点397个；葶苈子活性成分12种，对应靶点314个。药物活性成分共计44种，作用靶点共计711个，经Uniprot转化为Symbol，去除重复值后，最终得到作用靶点171个。
3.2. SOM基因获取及“药对–疾病”共同靶点韦恩图
在GeneCards、OMIM两个数据库输入“Otitis Media with Effusion”查询，分别得到1496个、1514个疾病基因，经去重处理后，最终得到2731个疾病基因。将药对靶点与疾病基因取交集并绘制韦恩图(见图1)，共获得89个交集基因。
Figure 1. Venn diagram of intersecting genes between Sangbaipi-Tinglizi and SOM
图1. 桑白皮–葶苈子与SOM交集基因韦恩图
3.3. “桑白皮 + 葶苈子–成分–靶点–SOM”网络构建
将药物、活性成分、作用靶点处理后，将其导入Cytoscape获得“桑白皮 + 葶苈子–成分–靶点–SOM”网络图(见图2)。图中共117个节点，231条边。将Degree数值从大到小排序后取前5，结果是：quercetin (槲皮素)、kaempferol (山奈酚)、isorhamnetin (异鼠李素)、Glabrone (光果甘草酮)、pelargonidin (天竺葵素)，这代表着它们可能是桑白皮–葶苈子药对治疗SOM的核心成分，在治疗机制中起着重要作用。
Figure 2. “Sangbaipi and Tinglizi-ingredient-target-SOM” network diagram
图2. “桑白皮 + 葶苈子–成分–靶点–SOM”网络图
3.4. 蛋白互作网络(PPI)
运用STRING数据库分析89个交集基因，构建PPI网络图(见图3)。采用Cytoscape软件及Excel表格进行分析，最终得到核心基因6个，分别为MYC (癌基因)、TP53 (一种抑癌基因)、AKT1 (蛋白激酶B)、TNF (肿瘤坏死基因)、IL6 (白介素-6)、HSP90AA1 (位于人类14号染色体q32.2区域的基因)。
Figure 3. PPI network of shared genes between Sangbaipi-Tinglizi Herb Pair and SOM
图3. 桑白皮–葶苈子药对与SOM交集基因的PPI网络图
3.5. GO富集分析及KEGG通路分析
运行R语言针对89个交集基因完成GO功能富集分析并绘制柱状图(见图4)，结果涵盖1984项BP，如对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对肽激素的反应等；包含49个CC相关内容，如膜筏、膜微域、质膜外侧等；涉及197个MF，如DNA–转录因子结合位点、泛素–蛋白质连接酶、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。在R语言环境下完成KEGG通路分析并绘制气泡图(见图5)，共得到167条信号通路，包含NF-κB signaling pathway、MAPK signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等。结果提示桑白皮–葶苈子药对可能通过调节这些通路发挥治疗SOM的作用。
Figure 4. Gene Ontology (GO) enrichment analysis
图4. GO富集分析
Figure 5. KEGG pathway enrichment analysis
图5. KEGG通路富集分析
4. 讨论
祖国医学将分泌性中耳炎归于“耳胀、耳闭”范畴，多由风邪侵袭、气血瘀阻、邪犯耳窍所致[4]，其临床表现主要为耳内胀闷不适、听力下降伴鼓室积液，治疗上应宣肺化湿开窍利水[5]。《名医别录》载“去肺中水气”指桑白皮可通调水道，行肺之功，输布津液[6]，中国古籍记载葶苈子具有泻肺利水的功效，现代药理学发现桑白皮、葶苈子均具有抗炎作用[7] [8]。
本研究筛选出桑白皮–葶苈子主要活性成分有槲皮素、山奈酚、异鼠李素、光果甘草酮、天竺葵素。王月田等[9]基于大鼠模型实验发现，槲皮素能够有效缓解SOM的发生与发展。进一步机制研究表明，该保护作用可能是通过抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路，进而减轻其所介导的炎症反应来实现的。陈丹[10]通过动物实验发现山奈酚能够有效减轻急慢性炎症性疼痛，MrgprD可能在其中发挥了重要的作用。
通过PPI网络分析，了解到MYC、TP53、AKT1、TNF、IL6、HSP90AA1是桑白皮–葶苈子治疗SOM的关键靶点。TNF是一种由效应细胞分泌的多效性细胞因子[11]，是炎症反应的关键介质[12]，能够促进炎症因子的释放。IL-6是一种多效性细胞因子，广泛参与免疫调节、炎症反应、代谢调控[13]。苏吉利等[14]通过建立分泌性中耳炎大鼠，灌胃桑白皮进行治疗，治疗后大鼠耳黏膜细胞肿胀情况好转，炎症细胞浸润减少，血清中IL-6、IL-β和TNF-α炎症因子表达降低。
根据GO和KEGG分析，桑白皮–葶苈子治疗SOM主要涉及对脂多糖、对细菌来源分子及对肽激素的反应等生物过程，NF-kappa B信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等可能是参与调控的信号通路。刘水霞等[15]研究表明，泽兰叶黄素能够缓解SOM的症状。其作用靶点可能是p38MAPK信号通路。p38 MAPK是MAPK蛋白激酶家族的一员，通常会在机体受到环境应激或炎症因子刺激时被激活。桉柠蒎可减少鼓室积液，缓解中耳损伤，作用机制与抑制NF-κB信号通路的激活、降低中耳灌洗液中TNF-α、IL-6的水平有关[16]。当中耳受细菌病毒感染、咽鼓管功能障碍等刺激时，NF-κB被激活后进入细胞核，一方面通过调控COX-2基因转录，促进前列腺素类促炎介质大量释放，放大局部炎症反应，加重黏膜充血水肿；另一方面通过上调iNOS表达增加一氧化氮生成，进一步损伤中耳黏膜上皮屏障，同时直接结合MUC5AC基因启动子，驱动黏液糖蛋白过度合成与分泌，导致中耳腔内黏液性积液潴留。
综上所述，本研究从新的视角阐释了桑白皮–葶苈子药对治疗分泌性中耳炎的作用机制，揭示了其通过多靶点、多通路协同作用的治疗潜力，为后续分泌性中耳炎的治疗及研究提供理论依据。