1. 引言
近年来我国人群心血管病(Cardiovascular Diseases, CVD)的患病率处于持续上升阶段，据推算我国心血管病人3.3亿，我国≥18岁居民CVD的粗发病率为600.9/10万(年龄标化发病率为411.8/10万)，2020年，IHD、出血性脑卒中和缺血性脑卒中是中国CVD死亡的三大主因[1]。扩张冠脉、溶栓、冠脉搭桥以及介入等再灌注疗法是治疗缺血性心脏病最主要的治疗手段，但在这些治疗措施产生疗效的同时，也会引起潜在的缺血再灌注(Ischemia-Reperfusion, I/R)损伤，直接影响患者的预后[2]。心肌缺血再灌注损伤机制研究发现，缺血再灌注期间细胞内产生的大量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)是引起细胞损伤的关键[3]。
银杏树在生物演化的漫长历史长河中，被赋予了“活化石”的美誉。传统药方记载银杏的药用部分为叶片，银杏叶具有活血、止咳、扩张冠状动脉血管、降低血胆固醇、抗抑郁等多种功效[4]。银杏叶及其有效成分是《中华人民共和国药典》收录的传统中药，已制成针剂等制剂用于临床。临床研究发现银杏叶提取物对预防心肌缺血再灌注损伤具有较显著的作用[5]。
银杏叶提取物(Ginkgo Biloba Extract, EGb)是将银杏的有效成分加以分离、富集后制成的一种标准制剂，其有效成分主要由黄酮类和萜内酯类构成[6]，其中黄酮类起清除自由基作用，萜内酯类起抗脂质过氧化作用，二者协同阻止氧自由基反应和脂质过氧化反应的病理加剧，直接发挥抗氧化作用。它可作为一种天然的自由基清除剂，具有明显增加超氧化物歧化酶[7]和过氧化氢酶的活性和含量，增加谷胱甘肽水平，降低丙二醛，抑制髓过氧化物酶活性[8]，有效地清除超氧阴离子[7]及抑制诱发的脂质过氧化反应[9]等作用。但以往研究多集中于通过加入外源性氧化剂以观察银杏叶提取物的抗氧化作用，但对于银杏叶提取物对心肌缺血再灌注条件下内源性活性氧造成的心肌保护作用如何研究甚少。
传统草药有着悠久的临床使用历史，以其“多成分、多靶点、多途径”的特点而闻名[10]。银杏叶提取物(Ginkgo biloba Extracts, EGb)的主要化学成分由黄酮类物质与萜类内酯化合物构成。在药理方面，GB展现出多样且重要的作用，比如能扩张血管，有效提升血流量，还可清除氧自由基，发挥抗炎功效。现行标准规定银杏叶提取物中黄酮醇苷含量不少于24%、萜内酯含量不少于6% [11]。由于银杏叶成分复杂，关于GB抗氧化应激的关键成分及关键靶点仍不明确，关于多成分多靶点的GB治疗氧化应激的具体机制仍未见报道，建立其作用机制具有挑战性。为了克服这一挑战，李等提出了一种网络药理学策略[12]。通过药理学和系统生物学的综合应用，结合多药理学、生物信息学和计算机模拟，网络药理学可以系统地解释中药的多组分和多靶点作用机制[13] [14]。在这项研究中，我们采用网络药理学的方法筛选出GB抗氧化应激的潜在靶点和通路，并结合细胞缺氧/复氧实验进行验证，以期为临床使用GB抗氧化应激提供更多的实验依据。
2. 材料与方法
2.1. 银杏叶提取物化学成分获取和靶点预测
通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP, https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)以“银杏叶”为关键词进行中药成分检索，由于许多文献表明黄酮醇苷和银杏内酯是银杏叶提取物主要起作用的活性成分，因此对检索出的成分筛选出属于黄酮醇苷和银杏内酯的成分，并以此评估中药活性成分的重要指标：口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(Drug Likeness, DL) ≥ 0.18作为筛选条件，最后获得银杏叶的主要活性成分。利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，输入活性成分的化合物名称获得其2D结构或SMILES号并导出结果，将获得的化合物的2D结构或SMILES号在SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库中上传，将物种限定为“Homo sapiens”，依据Probability > 0的条件对预测的靶点进行筛选。在Super-PRED数据库
(https://prediction.charite.de/index.php)中输入化合物2D结构或SMILES号进行靶点筛选，在HERB数据库(http://herb.ac.cn/)中以化合物名称为关键词检索其相关靶点。将所有获得的有效靶点进行标准统一并去重，获得银杏叶有效成分的作用靶点。
2.2. 氧化应激相关靶点的获取
使用GeneCards和OMIM数据库平台，以“oxidative stress”为关键词筛选氧化应激相关的靶点。其中在GeneCards中设定Score > 1的筛选条件，获得疾病的相关靶点。将两个数据库获得的结果导出并合并去重。
2.3. 药物和疾病交集靶点的获取
利用Venny 2.1.0平台，上传获得的有效成分靶点和氧化应激相关靶点并取二者交集，即为银杏叶活性成分抗氧化应激作用的靶点。
2.4. 蛋白质互作网络(Protein-Protein Interaction Networks, PPI)的构建及核心靶点的筛选
通过STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，上传交集基因信息，将模式设置为“Multiple Proteins”，蛋白质种属设置为“Home Sapiens”，将置信度“minimum required interaction score”设置为“medium confidence”默认为0.400作为筛选标准，其他参数为默认值，分析并绘制蛋白质–蛋白质相互作用网络，即protein-protein interaction，PPI。将输出的文件和图片结果分别以TSV格式和PNG格式导出保存。
采用Cytoscape 3.9.1，将PPI分析结果TSV文件导入软件，进一步通过Centiscape 2.2插件对潜在靶点的关键参数进行拓扑分析，取度值排名靠前的靶点作为核心靶点，同时构建网路图。
2.5. GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
使用DAVID数据库(https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp)的GO基因注释分析功能和KEGG通路分析功能对交集基因进行富集分析，限定物种为“Homo sapiens”，导出分析结果。将获得的结果通过调整FDR (False Discovery Rate)来校正，按照FDR值的大小升序排序，GO富集分析从上述的三方面均筛选FDR值较小的前10条绘制GO富集柱状图，KEGG富集分析筛选FDR值较小的前20条绘制KEGG富集气泡图。
3. 实验结果
3.1. 银杏叶活性成分及靶点
通过TCMSP数据库筛选得到银杏叶活性化合物共27个，利用SwissTargetPrediction、HERB、Super-PRED数据库预测并整合去重后得到银杏叶活性成分有效靶点共340个。
3.2. 氧化应激相关靶点
在GeneCards和OMIM数据库以“oxidative stress”为关键词筛选氧化应激相关靶点，分别获取到402、206个氧化应激相关靶点，将以上靶点整理去重后得到氧化应激相关靶点基因556个。
3.3. 银杏叶活性成分抗氧化应激潜在靶点的蛋白互作网络的构建与分析
利用Venny 2.1.0平台对筛选后的银杏叶活性成分相关靶点和氧化应激相关靶基因取交集，绘制Venn图，得到共有靶点共49个(图1)。
Figure 1. Venn diagram of Ginkgo biloba leaf extract-oxidative stress cross-targets
图1. 银杏叶提取物–氧化应激交集靶点Venn图
利用STRING数据库分析筛选并构建PPI网络(图2)，通过软件Cytoscape对导出的PPI网络进行分析并优化，得到PPI网络图(图3)。该网络由49个节点和420条边组成。将节点颜色设置从浅绿色到红色连续变化，代表节点的度值(Degree)由小至大的变化。网络中度值即度中心性，是计算与该节点直接相连的边的数量，度值的大小反应了该节点的重要性。因此，根据我们设定的颜色，节点的颜色越红，说明该节点在网络中的重要性越高。
利用Cytoscape软件中的CentiScaPe插件进行拓扑分析，计算网络中各蛋白的度值并进行排名，筛选度值大小 ≥ 30的靶点作为核心靶点，共7个，依次为TNF、AKT1、ESR1、BCL2、HIFI1、PPARG、PTGS2。构建核心靶点PPI网络(图4)，网络中节点颜色越红，表示该靶点在网络中的重要性越高。
Figure 2. PPI network diagram of potential targets (STRING version)
图2. 潜在靶点的PPI网络(STRING版本)
Figure 3. PPI network diagram of potential targets (Cytoscape edition)
图3. 潜在靶点的PPI网络(Cytoscape优化版)
Figure 4. PPI network diagram of core target
图4. 核心靶点PPI网络
3.4. GO和KEGG富集分析
Figure 5. GO enrichment analysis results
图5. GO富集分析结果柱状图
运用DAVID数据库对银杏叶活性成分和氧化应激的交集靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析结果共437条，其中生物学过程(Biological Processes, BP) 311条，细胞组分(Cellular Components, CC) 44条，分子功能(Molecular Functions, MF) 82条。将得到的结果按FDR升序排名，分别取排名前10的结果并绘制柱状图进行结果可视化(图5)。结果显示从生物学过程方面主要富集于基因表达的正负调控、miRNA转录的负调控、对外源物质刺激的响应、细胞对活性氧的响应等部分；分子功能方面主要涉及酶结合、血红素结合、相同蛋白结合、JUN激酶活性、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性、蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析结果共133条，取排名前20的结果，作气泡图(图6)，气泡颜色越红，大小越大，说明富集程度越高。分析结果显示，信号通路主要富集在C型凝集素受体(CLRs)信号通路、脂质代谢与动脉粥样硬化、活性氧、流体剪切应力和动脉粥样硬化、神经营养因子信号通路等。
Figure 6. Results of KEGG enrichment analysis
图6. KEGG富集分析结果气泡图
4. 讨论
氧化应激是心肌缺血再灌注损伤过程中的关键环节[15]，它的诱发主要起源于再灌注期间活性氧物质(ROS)的爆发性产生[16]。研究表明，生理状态下由于细胞内存在完善的抗氧化防御系统，使体内产生的ROS不断被清除，仅有1%~2%的氧生成ROS；但在I/R损伤等病理状态下，ROS的爆发性产生使保护酶活性受抑制，破坏了机体氧化–抗氧化平衡，使细胞处于氧化状态，造成ROS生成与清除这一动态平衡被打破，机体累计过多的ROS而引起的一系列损伤。
银杏叶提取物是从银杏叶中提取的有效药用成分，主要为黄酮及萜内酯，它具有清除氧自由基，降低脂质过氧化物的形成，提高抗氧化酶的活性；降低Ca2+内流，减少细胞内钙超载；舒张血管，改善微循环；调节血脂；抑制血小板活化因子(PAF)与其受体结合而减少血小板聚集，抗血栓形成等作用。众多研究表明，EGb具有还原性羟基功能团，可直接发挥抗氧化作用，清除超氧阴离子，增加超氧化物歧化酶(SOD) [7]和过氧化氢酶的活性和含量，增加谷胱甘肽水平，降低丙二醛(MDA)含量，抑制髓过氧化物酶(MPO)活性[8]，可有效地对抗二苯三硝基苯肼(DPPH)自由基的损伤、抑制脂质过氧化反应[17]，下调环氧化酶-2 (COX-2)基因的表达[18]、增加诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达[19]。
在本研究中基于网络药理学探讨银杏叶提取物抗氧化应激的作用机制，确定银杏叶的主要活性成分27个，获取银杏叶抗氧化应激的潜在靶标49个，通过构建蛋白互作网络与核心靶点网路图，最终获得TNF、AKT1、ESR1、BCL2、HIFI1、PPARG、PTGS2等7个核心靶点。其中TNF为度值最高的靶点，其作为TNF通路中ERK1/2的上游调控因子，在脑缺血病理状态下，TNF被大量分泌，并与受体结合引起下游的级联反应，包括损坏血脑屏障、加剧局部炎症、激活下游的ERK1/2等[20]，脑梗后高水平的ERK1/2会加剧血脑屏障通透性，诱导炎症反应及促进神经元凋亡，最终加重脑梗死和神经功能缺损，而通过抑制ERK1/2的活化对脑缺血损伤发挥保护作用[21]。而AKT1已被证明调节许多生物过程，凋亡、存活和血管生成[22]。这是普遍接受的氧化应激(自由基)导致线粒体功能障碍以及细胞损伤[23]，这反过来又导致疲劳。很多的研究证明，线粒体特别容易受到氧化应激和线粒体氧化应激反过来又促进氧化应激诱导的细胞损伤[24]。根据Afolayan AJ报道，AKT1可能是线粒体的关键调节因子氧化应激和血管功能[25]。动物实验已经证明AKT1的激活可以保护细胞免受氧化应激有效方法，靶向TNF和AKT1可以减轻氧化应激，提高抗心肌缺血再灌注损伤效应。本研究的GO功能富集分析结果显示银杏叶拮抗脑缺血的关键靶点主要集中在基因表达的正负调控、miRNA转录的负调控、对外源物质刺激的响应、细胞对活性氧的响应等生物过程。KEGG富集分析显示银杏叶可能通过C型凝集素受体(CLRs)信号通路、脂质代谢、活性氧、流体剪切应力和神经营养因子信号通路等信号通路调节发挥其调节清除自由基和调节凋亡等过程。
综上所述，本研究预测EGb可能通过27种活性成分协同作用，调控TNF、AKT1、ESR1和BCL2等多个关键靶点，通过C型凝集素受体(CLRs)信号通路、脂质代谢和活性氧等多种途径，从不同环节干预氧化应激的发生和发展，这显示出EGb通过多成分、多靶点、多环节抗氧化应激的整合调节特点，为中药在抗氧化应激的应用提供了新的研究思路和策略。本研究不足之处：本研究主要依赖度值排名筛选核心靶点，仅从网络药理学角度探讨了EGb干预氧化应激的可能机制，未引入介数和紧密中心性等多种拓扑参数进行综合评估，亦未使用MCODE等插件进行模块分析以挖掘功能相关的靶点簇，并且未进行实验验证。虽然EGb抗氧化应激方面具有多种生物活性，但需从关键节点和功能模块两个层面进一步深入地理解其作用机制，并通过细胞或动物层面的实验研究进行验证，对于开发EGb新制剂用于治疗氧化应激损伤至关重要。
基金项目
江西省教育厅科技项目(GJJ201509)。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。