血液代谢物与肺结核的相关性：双向孟德尔随机化研究

Association between Blood Metabolites and Pulmonary Tuberculosis: A Mendelian Randomization Analysis

摘要: 目的：利用双向双样本孟德尔随机化研究揭示了特定血液代谢物对肺结核的潜在因果效应。方法：工具变量来源于全基因组关联研究(GWAS)。应用五种不同的回归拟合方法进行双样本MR分析，主要分析方法为逆方差加权法(Inverse-variance weighted, IVW)，MR-Egger、Weighted median、Simple mode、Weighted mode作为补充方法；此外，还考虑了连锁不平衡和弱工具变量引起的潜在偏差。为保证结果的可靠性，还进行了敏感性分析：水平多效性分析(MR-Egger intercept检验)和异质性分析(Cochran’s Q检验和Funnel plot检验)均不符合标准的代谢物被认为对结果没有实质性的因果效应；同时应用Leave-one-out分析保证结果稳健性。结果：研究证实42种血液代谢与肺结核有关，其中包括13种风险因素(5-羟基吲哚硫酸盐的风险比最高，OR = 1.3035，95% CI：1.1074~1.5344，P = 0.0014)和29种防御因素(磷酸盐与甘油的比值最高，OR = 0.7512，95% CI：0.6296~0.8964，P = 0.0015)。为了评估肺结核对这些血液代谢物是否有反向因果关系，我们进行了反向MR分析。结果表明两者之间没有反向因果关系。结论：遗传学证据表明，5-羟基吲哚硫酸盐水平等13种血液代谢物是肺结核的风险因素，磷酸盐与甘油的比值等29种血液代谢物是肺结核的防御因素。

Abstract: Objective: To evaluate the causal relationship between blood metabolites and pulmonary tuberculosis (PTB) using a bidirectional two-sample Mendelian randomization (MR) approach. Methods: Instrumental variables were derived from Genome-Wide Association Studies (GWAS). Five distinct MR methods were applied for two-sample MR analysis: inverse-variance weighted (IVW) as the primary method, supplemented by MR-Egger, weighted median, simple mode, and weighted mode. Potential biases due to linkage disequilibrium and weak instrumental variables were also considered. To ensure the reliability of the results, sensitivity analyses were conducted. Metabolites that did not meet the standards in horizontal pleiotropy analysis (MR-Egger intercept test) and heterogeneity analysis (Cochran’s Q test and funnel plot test) were considered to have no substantial causal effect on the outcome; Leave-one-out analysis was used to ensure robustness of results. Results: Elevated levels of 42 blood metabolites were associated with PTB risk, comprising 13 risk factors (e.g.,5-hydroxyindole sulfate, highest OR = 1.3035, 95%CI: 1.1074~1.5344, P = 0.0014) and 29 protective factors (e.g., ratio of phosphate to glycerol, Lowest OR = 0.7512, 95%CI: 0.6296~0.8964, P = 0.0015). To assess whether there was a reverse causal relationship between pulmonary tuberculosis and these blood metabolites, we performed a reverse MR analysis. The results showed no reverse causal relationship. Conclusion: Genetic evidence suggests that 13 blood metabolites, including 5-hydroxyindole sulfate, are risk factors for pulmonary tuberculosis, while 29 blood metabolites, including the phosphate-to-glycerol ratio, are defensive factors against pulmonary tuberculosis.

1. 引言

由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的结核病(Tuberculosis, TB)是一种主要传染病，仍然是一个全球性的公共卫生问题，肺结核(Pulmonary Tuberculosis, PTB)是最为典型和常见的形式。全球三分之一的人口感染了MTB [1]，但<10%的人口会发展为活动性结核病(Active Tuberculosis, ATB)，而大多数人将保持健康[2]-[6]。潜伏性结核病感染(LTBI)通常是一种无症状、影像学未被发现的过程。如果MTB克服免疫系统的限制并繁殖，就会进展为ATB。确定疾病风险的生物标志物，识别TB高危感染者将有助于早期预防和治疗TB。Chen等人发现代谢物与PTB之间存在关联[7]。组氨酸、丙氨酸和色氨酸等代谢物与PTB发病呈正相关，而皮质醇等代谢物与PTB发病呈负相关[8]。Deepak Tripathi等人进一步证实，代谢物醋酸脱氧皮质酮通过调节先天性免疫反应发挥抗结核功能[9]。然而，代谢物与PTB风险之间的遗传关联在很大程度上仍然未知。孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)应用遗传工具变量(Instrumental Variables, IVs)来确定暴露与结果之间的遗传关系，从而减少反向因果关系和混杂因素。本研究旨在采用双向双样本MR分析法探讨血液代谢物与PTB之间的因果关系。我们从遗传层面系统地研究了血液代谢物对PTB的影响，以及PTB对血液代谢物的潜在影响。

2. 研究方法

2.1. 总体设计

本研究使用的所有数据来自公开访问的全基因组关联研究(GWAS)，每项研究均获得了相应伦理委员会的批准，因此无需进一步的伦理审批。基于GWAS数据筛选出符合条件的IVs，进行双样本MR分析，研究血液代谢物与PTB的因果关系(见图1)。本研究严格遵循MR分析的三个假设：(1) 选择的IVs与暴露强相关；(2) IVs与任何混杂因素无关；(3) IVs只能通过暴露来影响结果。

Figure 1. Schematic illustration of the MR analysis

图1. MR分析示意图

2.2. 全基因组关联研究(GWAS)数据来源

血液代谢物[10]和PTB的全基因组关联研究(GWAS)摘要数据分别来自GWAS目录 (https://www.ebi.ac.uk/gwas/)，数据的详细信息见表1。

2.3. 工具变量(IVs)的选择

根据最近的研究，IVs的筛选标准是P < 1 × 10⁻⁵，linkage disequilibrium R² < 0.001，clumping distance = 10,000 kb，F statistics > 10 [11]-[13]。最初，我们确定了与暴露因素相关的1294个代谢物的单核苷酸多态性(SNPs)。为了剔除与PTB有内在联系的SNPs，基于以往荟萃分析研究得出可能导致肺结核发病的混杂因素(见表2)，我们在Pheno Scanner (http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/)上进行了搜索，并剔除了与混杂因素有关的54个SNPs。最终确定1240个SNPs为IV。

Table 1. GWAS study data information

表1. GWAS数据库研究数据信息

暴露/结局	作者，出版时间	样本量n	病例数	对照数	人群	GWAS ID	PMID
1400种血液代谢物	Yiheng Chen等，2023	-	-	-	欧洲	GCST90199621-90201020	36635386
肺结核	Sakaue等，2021	477,386	895	476,491	欧洲	GCST90018892	34594039

注：数据来源：https://www.ebi.ac.uk/gwas。

Table 2. Confounding factors identified from previous meta-analysis studies as potentially contributing to the onset of pulmonary tuberculosis

表2. 基于以往荟萃分析研究得出的可能导致肺结核发病的混杂因素

暴露	混杂因素	作者	PMID
PTB	吸烟	Alexander L Chu等	34049397
	酒精	Sameer Imtiaz等	28705945
	糖尿病	Jung Eun Yoo等	34546370
	BMI	Peng Lu等	34217872
	AIDS	Faiz Ahmad Khan等	22820541

注：PTB：肺结核；BMI：身体质量指数；AIDS：获得性免疫缺陷综合征。

2.4. 统计分析

逆方差加权法(Inverse-variance weighted, IVW)作为主要方法估计血液代谢物与PTB之间的因果关系[14]。此外，本研究还使用了MR-Egger、Weighted median、Weighted mode和Simple mode作为补充方法[15] [16]。使用Cochran’s Q统计量评估SNPs的异质性[17]。横向多效性是通过MR-Egger回归得到的截距来评估的。为了验证分析结果的稳健性，还使用了“leave-one-out”方法进行了敏感性分析，确认每个SNP对总体因果估计的影响[15] [17]。所有分析均使用Two Sample MR软件包和R编程语言进行。

3. 结果

3.1. MR分析

我们采用IVW方法分析了这些血液代谢物对PTB风险的影响，结果发现78个血液代谢物可能对PTB有影响(见表3)。随后，我们使用五种方法(MR Egger、加权中位数、逆方差加权、简单模式和加权模式)进一步筛选出了具有一致比值(OR)方向的代谢物，并确定了43个血液代谢物(见图2)。其中，14个血液代谢物被确定为PTB的风险因素，如5-羟基吲哚硫酸盐水平(OR = 1.3035, 95% CI = 1.1074~1.5344, P = 0.0014)、半胱氨酸与丙氨酸比值(OR = 1.1919, 95% CI = 1.0702~1.3275, P = 0. OR = 0.7512, 95% CI = 0.6296~0.8964, P = 0.0015)，1-棕榈酰-2-亚油酰-GPI (16:0/18:2)水平(OR = 0.7952, 95% CI = 0.7117~0.8886, P < 0.001)等29种血液代谢物被认为是保护因素。

Table 3. 78 blood metabolites with potential effects on pulmonary tuberculosis

表3. 对肺结核有潜在影响的78种血液代谢物

ID	P-value	血液代谢物
GCST90199672	0.007717679	Oxalate (ethanedioate) levels
GCST90199691	0.046885685	1-methylhistidine levels
GCST90199715	0.008012883	Myristoleate (14:1n5) levels
GCST90199727	0.016819323	1-oleoyl-GPC (18:1) levels
GCST90199738	0.019967442	Stachydrine levels
GCST90199793	0.03134883	1-linoleoyl-GPE (18:2) levels
GCST90199800	0.031320536	Carnitine C5:1 levels
GCST90199819	0.009714864	Tryptophan betaine levels
GCST90199824	0.016448665	4-vinylphenol sulfate levels
GCST90199829	0.001701626	3-methyladipate levels
GCST90199844	0.04663961	1-palmitoyl-2-linoleoyl-GPE (16:0/18:2) levels
GCST90199846	0.005116351	Glycosyl-N-stearoyl-sphingosine (d18:1/18:0) levels
GCST90199848	0.031305837	Succinylcarnitine levels
GCST90199865	0.028360224	2-hydroxyglutarate levels
GCST90199906	0.034553761	1-(1-enyl-palmitoyl)-GPE (p-16:0) levels
GCST90199990	0.041565662	3-hydroxypyridine sulfate levels
GCST90199998	0.024071315	Propyl 4-hydroxybenzoate sulfate levels
GCST90200037	0.003540205	1-stearoyl-2-linoleoyl-gpc (18:0/18:2) levels
GCST90200039	0.03135841	1-stearoyl-2-linoleoyl-GPE (18:0/18:2) levels
GCST90200050	0.005174926	5-hydroxyindole sulfate levels
GCST90200074	0.045491772	1-linoleoyl-GPG (18:2) levels
GCST90200075	0.023443846	1-(1-enyl-palmitoyl)-2-linoleoyl-GPE (p-16:0/18:2) levels
GCST90200078	0.005213426	1-myristoyl-2-arachidonoyl-GPC (14:0/20:4) levels
GCST90200082	0.014080798	1-oleoyl-2-linoleoyl-GPE (18:1/18:2) levels
GCST90200100	0.015191429	Perfluorooctanesulfonate (PFOS) levels
GCST90200101	0.037899489	Pimeloylcarnitine/3-methyladipoylcarnitine (C7-DC) levels
GCST90200104	0.037055057	Hexadecadienoate (16:2n6) levels
GCST90200160	0.0176299	Trans-2-hexenoylglycine levels
GCST90200168	0.015265002	Hydroxyasparagine levels
GCST90200174	0.026906852	3-hydroxybutyroylglycine levels
GCST90200193	0.003538056	Ethyl beta-glucopyranoside levels
GCST90200199	0.042625531	Ascorbic acid 3-sulfate levels
GCST90200243	0.012958988	Hydroxypalmitoyl sphingomyelin (d18:1/16:0(OH)) levels
GCST90200314	0.010761188	N-acetylneuraminate levels
GCST90200328	0.034285774	3-methoxytyrosine levels
GCST90200332	0.000235436	1-palmitoyl-2-linoleoyl-GPI (16:0/18:2) levels
GCST90200333	0.018393607	Taurocholic acid levels
GCST90200383	0.048033549	Cystathionine levels
GCST90200392	0.030828318	Orotate levels
GCST90200437	0.026527691	Fructose levels
GCST90200452	0.036946443	Plasma free asparagine levels
GCST90200506	0.043366726	X-12812 levels
GCST90200508	0.002988338	X-12738 levels
GCST90200516	0.004619955	X-12847 levels
GCST90200529	0.021376201	X-16397 levels
GCST90200537	0.041976386	X-16087 levels
GCST90200583	0.001617854	X-21807 levels
GCST90200604	0.033260739	X-23276 levels
GCST90200611	0.013369487	X-23636 levels
GCST90200656	0.027001934	X-25371 levels
GCST90200664	0.038728822	X-25810 levels
GCST90200674	0.013575181	Androsterone sulfate levels
GCST90200685	0.006699329	1-stearoyl-2-arachidonoyl-gpc (18:0/20:4) levels
GCST90200688	0.027795564	Androsterone glucuronide levels
GCST90200691	0.025493961	N-delta-acetylornithine levels
GCST90200692	0.006077635	1-palmitoyl-2-arachidonoyl-gpc (16:0/20:4n6) levels
GCST90200695	0.044565934	2'-o-methyluridine levels
GCST90200700	0.01913446	Decadienedioic acid (C10:2-DC) levels
GCST90200725	0.020012219	Adenosine 5'-diphosphate (ADP) to creatine ratio
GCST90200740	0.00503361	Arachidonate (20:4n6) to oleate to vaccenate (18:1) ratio
GCST90200756	0.037426408	Glycine to pyridoxal ratio
GCST90200757	0.046693968	Glycine to alanine ratio
GCST90200764	0.007908104	Phosphate to uridine ratio
GCST90200786	0.004696625	Cysteine to alanine ratio
GCST90200794	0.026776394	Oleoyl-linoleoyl-glycerol (18:1 to 18:2) [2] to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [1] ratio
GCST90200795	0.026102701	Oleoyl-linoleoyl-glycerol (18:1 to 18:2) [2] to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [2] ratio
GCST90200836	0.017425527	Glycerol to glycerol 3-phosphate ratio
GCST90200845	0.033180446	Adenosine 5'-monophosphate (AMP) to citrate ratio
GCST90200902	0.026184213	Phosphate to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [2] ratio
GCST90200903	0.002006806	Phosphate to glycerol ratio
GCST90200908	0.022499189	Retinol (Vitamin A) to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [2] ratio
GCST90200918	0.010215493	N-palmitoyl-sphingosine (d18:1 to 16:0) to N-palmitoyl-sphinganine (d18:0 to 16:0) ratio
GCST90200926	0.028058428	N-stearoyl-sphingosine (d18:1 to 18:0) to N-palmitoyl-sphinganine (d18:0 to 16:0) ratio
GCST90200929	0.005414896	Glycerol to carnitine ratio
GCST90200961	0.046091686	Adenosine 5'-diphosphate (ADP) to ornithine ratio
GCST90200965	0.029227711	Glutamate to 5-oxoproline ratio
GCST90200979	0.004408218	Arachidonate (20:4n6) to linoleate (18:2n6) ratio
GCST90200994	0.017555245	Glutamine to alanine ratio

注：我们从孟德尔分析结果中选取P值小于0.05的血液代谢物，并将逆方差加权法(Inverse-variance weighted, IVW)作为主要分析方法。

Figure 2. Forest plot of the MR analysis between 43 blood metabolites and PTB

图2. 43种血液代谢物与PTB之间的MR分析的森林图

MR估计了43种血液代谢物对PTB风险的遗传预测效应，并将IVW视为主要方法。红框中突出显示的血液代谢物是最高风险和防御因素。乙基beta-吡喃葡萄糖苷水平血液代谢物随后被排除在下一步分析之外。SNPs：分析的SNP数量；P-value (P值)：统计显著性阈值设置为P < 0.05；OR，比值比：OR > 1表示风险增加，OR < 1表示风险降低；CI，置信区间。

3.2. 敏感性分析

接下来，我们进行了敏感性分析(基因多效性检验：MR-Egger，异质性检验：Cochran’s Q)，结果没有发现血液代谢物与肺结核之间存在基因多效性和异质性(P值均大于0.05) (见表4)。我们还利用漏斗图和leave-one-out分析进一步评估了敏感性。在leave-one-out分析中，除了血液代谢物乙基beta-吡喃葡萄糖苷(Ethyl beta-glucopyranoside levels)在剔除SNP (rs181558)时效应估计值(小于0)及置信区间发生显著变化(总体效应估计值大于0)外，其他42个代谢物leave-one-out分析显示，结果均有稳健性。剔除任一单个SNP后，效应估计值均未发生显著改变(均大于0或均小于0)，这说明分析结果不受任何单一IV的影响。在漏斗图(Funnel plot)分析中，SNPs的分布与IVW和MR-Egger线对称，进一步支持血液代谢物和肺结核之间的因果关联。

为了进一步验证去除乙基beta-吡喃葡萄糖苷中离群SNP后的因果效应，我们进行了MR分析，发现乙基beta-吡喃葡萄糖苷与PTB风险之间没有显著的因果关系(IVW P值大于0.05)。

此外，为了评估PTB对这些血液代谢物是否有因果关系，我们进行了反向MR分析。结果表明它们之间没有反向因果关系。

Table 4. Test results for heterogeneity and pleiotropy between various blood metabolites and pulmonary tuberculosis

表4. 各种血液代谢物对肺结核之间存在异质性及多效性关系的检验结果

血液代谢物	ID	Cochrane’s Q	df	P for heterogeneity^a	Egger_intercept	SE	P for pleiotropy^b
Oxalate (ethanedioate) levels	GCST90199672	13.77662969	21	0.879001298	−0.016239559	0.014267236	0.268471547
1-oleoyl-GPC (18:1) levels	GCST90199727	11.55079359	12	0.482395747	−0.019801725	0.031744443	0.545486532
1-linoleoyl-GPE (18:2) levels	GCST90199793	35.258068	28	0.162479291	−0.004540853	0.010281366	0.662253414
Carnitine C5:1 levels	GCST90199800	13.50181411	20	0.854831002	0.001186838	0.012131187	0.923089124
Tryptophan betaine levels	GCST90199819	47.2637487	34	0.064819286	0.001811226	0.009503573	0.85001939
3-methyladipate levels	GCST90199829	16.24621032	16	0.435913181	−0.014065029	0.015893873	0.390157459
Glycosyl-N-stearoyl-sphingosine (d18:1/18:0) levels	GCST90199846	26.70362649	27	0.479869708	0.004977033	0.011848347	0.677891774
1-(1-enyl-palmitoyl)-GPE (p-16:0) levels	GCST90199906	12.84709567	20	0.883847632	−0.004908461	0.014529535	0.739197922
Propyl 4-hydroxybenzoate sulfate levels	GCST90199998	16.41904002	23	0.836752127	0.007150888	0.01606559	0.660591953
1-stearoyl-2-linoleoyl-gpc (18:0/18:2) levels	GCST90200037	11.52220939	21	0.951628272	0.014370173	0.011708637	0.233955658
5-hydroxyindole sulfate levels	GCST90200050	11.6711604	12	0.472437354	0.015289681	0.034722934	0.668222909
1-(1-enyl-palmitoyl)-2-linoleoyl-GPE (p-16:0/18:2) levels	GCST90200075	15.7432729	17	0.542101992	0.030572887	0.016537942	0.083074253
1-myristoyl-2-arachidonoyl-GPC (14:0/20:4) levels	GCST90200078	26.75442633	18	0.083718133	−0.013722965	0.012970456	0.304850719
1-oleoyl-2-linoleoyl-GPE (18:1/18:2) levels	GCST90200082	30.70700162	28	0.330243639	−0.000594996	0.009608601	0.951080092
Perfluorooctanesulfonate (PFOS) levels	GCST90200100	16.99920858	19	0.589921442	−0.021831997	0.027140307	0.431655689
Pimeloylcarnitine/3-methyladipoylcarnitine (C7-DC) levels	GCST90200101	27.78652325	23	0.223962103	−0.006586847	0.013893727	0.640108703
Hexadecadienoate (16:2n6) levels	GCST90200104	11.39289332	14	0.654932723	0.024013508	0.02625266	0.376999522
Hydroxyasparagine levels	GCST90200168	18.49332639	19	0.489743684	−0.001399588	0.021536114	0.948899919
Ethyl beta-glucopyranoside levels	GCST90200193	18.06675683	14	0.203757282	−0.012574898	0.010398162	0.248067281
Hydroxypalmitoyl sphingomyelin (d18:1/16:0(OH)) levels	GCST90200243	16.4605003	25	0.900423691	0.016715462	0.009942212	0.10568177
N-acetylneuraminate levels	GCST90200314	24.55033406	29	0.701356373	−0.001148049	0.012611624	0.928116055
1-palmitoyl-2-linoleoyl-GPI (16:0/18:2) levels	GCST90200332	14.46232901	15	0.490793018	0.027462073	0.016375307	0.115710765
Orotate levels	GCST90200392	22.43518006	21	0.374815281	0.004169978	0.00820789	0.616979419
Fructose levels	GCST90200437	13.62453737	23	0.937121029	−0.006709654	0.012176571	0.587166262
X-12847 levels	GCST90200516	7.767236978	13	0.858426682	−0.005902409	0.025626778	0.821721262
X-16397 levels	GCST90200529	13.02830143	13	0.445627971	0.000935333	0.040462766	0.981937767
X-21807 levels	GCST90200583	18.49101059	19	0.4898958	−0.004668121	0.016918071	0.785748471
X-23636 levels	GCST90200611	14.33967441	14	0.424723814	0.008115827	0.031807599	0.80259658
X-25810 levels	GCST90200664	27.46139894	31	0.648812581	−0.002420938	0.007212816	0.739475418
Androsterone sulfate levels	GCST90200674	26.17567262	28	0.563388806	0.005037254	0.008839784	0.573498224
1-stearoyl-2-arachidonoyl-gpc (18:0/20:4) levels	GCST90200685	27.96537245	31	0.622952093	0.003862696	0.006080352	0.530065184
Androsterone glucuronide levels	GCST90200688	17.10541628	23	0.804046621	−0.003027979	0.008629166	0.729000927
1-palmitoyl-2-arachidonoyl-gpc (16:0/20:4n6) levels	GCST90200692	30.10063113	25	0.220543118	−0.014994211	0.008135908	0.077719848
Decadienedioic acid (C10:2-DC) levels	GCST90200700	15.66180555	18	0.616136833	−0.004452808	0.011224108	0.696511163
Phosphate to uridine ratio	GCST90200764	22.40103825	25	0.612494472	0.005718598	0.017921421	0.752416809
Cysteine to alanine ratio	GCST90200786	17.77871047	24	0.81360931	−0.001421756	0.016134704	0.930545736
Oleoyl-linoleoyl-glycerol (18:1 to 18:2) [2] to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [1] ratio	GCST90200794	18.90494262	20	0.528012374	−0.003596263	0.01021807	0.728748198
Oleoyl-linoleoyl-glycerol (18:1 to 18:2) [2] to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [2] ratio	GCST90200795	27.48803621	23	0.235762517	0.004631867	0.008633552	0.596999701
Phosphate to glycerol ratio	GCST90200903	14.89259847	14	0.385535756	0.001797696	0.029486427	0.952312896
N-stearoyl-sphingosine (d18:1 to 18:0) to N-palmitoyl-sphinganine (d18:0 to 16:0) ratio	GCST90200926	33.22693609	27	0.189683675	0.012030104	0.01721843	0.490957416
Glycerol to carnitine ratio	GCST90200929	22.97200917	21	0.34547265	0.007342357	0.008172007	0.37962139
Glutamate to 5-oxoproline ratio	GCST90200965	20.72700899	20	0.413354313	−0.038544973	0.023013584	0.110338906
Arachidonate (20:4n6) to linoleate (18:2n6) ratio	GCST90200979	16.8098428	22	0.773767813	−0.001646849	0.00923666	0.860200212

注：a：异质性检验的P值是通过Cochrane’s Q检验得出的，若P值小于0.05，则表明可能存在异质性。b：多效性检验的P值是通过MR-Egger检验得出的，若P值小于0.05则表明可能存在多效性。Df：代表自由度SE：代表标准误。

3.3. 血液代谢物分类结果

为进一步确定42种代谢物的类别，参考KEGG通路数据库(KEGG PATHWAY Database)及人类代谢组数据库(Human Metabolome Database)等[18] [19]，按类别(如脂类、有机酸类)分层。脂类占比最高(28.57%，12/42)，其次为代谢物比值(21.43%, 9/42)，提示脂代谢和通路平衡在本研究中的重要性。完整数据见补充表S1。

4. 讨论

本研究是第一个系统评估血液代谢物与PTB之间因果关系的孟德尔随机化研究。该MR研究显示，PTB风险与42种血液代谢物之间存在遗传关联，包括13种风险因素和29种防御因素。敏感性分析进一步证实了42种血液代谢物与PTB之间的关系。OR值(比值比，Odds Ratio)是用于衡量暴露因素与疾病关联强度的重要指标。OR = 1：表示暴露因素与疾病无关联，即该因素对疾病的发生没有影响；OR > 1：表明暴露因素与疾病呈正相关，是疾病的危险因素，暴露人群患疾病的风险高于非暴露人群；OR < 1：提示暴露因素与疾病呈负相关，是保护因素，暴露人群患疾病的风险低于非暴露人群。OR值的大小反映暴露因素与疾病关联的紧密程度。OR值越大，关联越强；OR值越小，关联越弱。基于OR值，我们得出5-羟基吲哚硫酸盐和磷酸盐甘油比值的增加分别表现出最高的风险和防御性。在这42种代谢物中，脂类代谢物占比最高。此外，本研究未观察到反向关联。

PTB是由MTB引起的传染病，对于全球公共卫生事业带来巨大的挑战，潜伏性结核感染(LTBI)是一种针对结核分枝杆菌的持续免疫状态，没有活动性肺结核(ATB)的典型症状[20]。据估计，全球有30%的人口患有LTBI，其中5%~10%的患者在接触结核分枝杆菌的前2年发展为ATB [21] [22]。宿主因素(如代谢状态)对发病的影响机制不清，因此，我们想研究血液代谢物对PTB的潜在影响，揭示宿主–病原体之间相互作用的可能代谢机制，发现新型的生物标志物，并识别高危人群和治疗靶点。

甘油是甘油三酯的重要代谢产物，其产生过程是MTB休眠及复苏期间的主要能量来源，且与药物耐受性及毒力改变相关[23]。在最近的一项研究中揭示了高脂饮食(HFD)-链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病小鼠的血浆中甘油水平升高显著增强了MTB的增殖与毒力，从而进一步加重TB [24]。还有研究表明，利用二甲双胍(TB的主要宿主导向治疗候选药物)减弱脂肪细胞释放甘油的能力来缓解TB的症状，这进一步证实了甘油代谢针对TB的治疗意义[25]。Claire Healy等研究表明[26]，MTB在酸性环境(pH < 5.8)中的生长停滞受磷酸盐(Pi)饥饿反应调控[27]。MTB在酸中的生长可以通过Pi饥饿反应调节因子regX3的过表达并增强甘油利用来恢复，因此，磷酸盐(Pi)与甘油比值升高(即Pi相对充足而甘油相对受限)可能会强化MTB在酸性环境中的生长停滞，但这仍需进一步研究。

本研究表明5-羟基吲哚硫酸盐(5-hydroxyindole sulfate, 5-HIS)作为TB的一个重要风险因素。5-HIS与色氨酸有直接且重要的生物代谢关系。它是色氨代谢途径中血清素(5-羟色胺)分解的终末产物。色氨酸是人体必需氨基酸[28]，无法由人体合成，需从食物中摄[29]。到目前为止，关于色氨酸摄入不足对人类疾病如脑损伤[30]、癌症、和自身免疫性疾病[31]的影响有许多研究。在一些色氨酸代谢和TB的研究中，将低色氨酸脑脊液水平与改善结核性脑膜炎的生存结果联系起来[32]。这与我们的研究结果一致。色氨酸经色氨酸羟化酶催化，合成5-羟色氨酸，5-羟色氨酸经芳香族L-氨基酸脱羧酶作用，脱羧形成血清素(5-羟色胺)，血清素是重要的神经递质，调节情绪、睡眠、食欲等。5-HIS是血清素代谢的主要排泄形式[33]。最近的一项非靶向代谢组学研究[34]，辅以转录组学分析，从TB和健康对照组之间的33种差异代谢物中选择了包括5-羟基吲哚乙酸在内的7种潜在的TB诊断生物标志物。硫酸吲哚衍生物，已被鉴定为AhR配体[35]。AhR是一种在免疫细胞中广泛表达的转录因子，其激活会以配体依赖性方式改变先天性和适应性免疫反应。目前没有直接的证据表明5-HIS与TB存在特定的直接关联，但我们的结果表明5-HIS是TB的一个重要风险因素，具体机制需要进一步的研究。

在我们所发现的42种代谢物中，脂类代谢物占比最高。其中，PTB的防御因素包括：糖基-N-硬脂酰鞘氨醇(d18:1/18:0)、1-棕榈酰基-2-亚油酰基甘油磷酸肌醇水平等9种代谢物。PTB的风险因素包括：1-肉豆蔻酰基-2-花生四烯酰基甘油磷酸胆碱(14:0/20:4)水平，1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基甘油磷酸胆碱(18:0/20:4)水平，1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基甘油磷酸胆碱(16:0/20:4n6)水平。这3种风险血液代谢物都是含花生四烯酸的磷脂酰胆碱(Glyceryl phosphorylcholine, GPC)。9种防御血液代谢物可能通过抗氧化、膜稳定和直接抗菌作用，增强宿主防御，减少MTB的存活。我们在遗传学上确定了糖基-N-硬脂酰鞘氨醇(d18:1/18:0)对PTB的防御作用，这种作用可能通过促进巨噬细胞吞噬体与溶酶体的融合，增强对病原体的杀灭效果[36] [37]。与我们的研究一致，1-亚油酰基甘油磷酸乙醇胺(18:2)是溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine, LPE)中的一种，LPE对维持吞噬细胞膜动态平衡和吞噬功能具有重要作用[38]。1-(1-烯基–棕榈酰)–甘油磷酸乙醇胺(p-16:0)属于乙醇胺缩醛磷脂，缺乏膜乙醇胺缩醛磷脂的细胞对调理酵母聚糖颗粒的吞噬能力显著降低[39]。另外，乙醇胺缩醛磷脂是细胞膜的组成成分，部分由其修饰的磷脂分子具有抗氧化能力，能帮助保护细胞膜免受氧化应激的损伤，维持细胞膜结构稳定[40]。尽管有研究表明，花生四烯酸代谢驱动炎症反应，早期利于控制感染，但长期可能被病原体利用，导致免疫抑制和组织损伤，并抑制巨噬细胞的吞噬作用[41]-[43]。但是，我们证明3种含花生四烯酸GPC作为PTB的风险因素，具体机制仍需要进一步的研究。

总之，我们的研究结果揭示了血浆代谢物与PTB之间的风险和防御关系。但是，在这项研究中需要考虑几个限制。第一，尽管该研究基于大样本量并表现出很强的普遍性，但是，大多数参与者是欧洲血统，因此需要进一步验证其他种族群体的适用性。第二，本研究在获取工具变量与暴露和结局的数据时，尽管尽量使用了独立的样本库，但不能完全排除部分样本存在重叠的可能性。已知的或未知的样本重叠可能会引入过度拟合，并导致血液代谢物与肺结核关联的标准误被低估，从而使得置信区间变窄、P值偏向于显著，增加了第一类错误的风险，这有待于未来更大规模、协作性的数据发布。第三，本研究主要反映了遗传变异在个体成年期(即GWAS样本采集的平均年龄)的累积效应，应考虑发育补偿以及生命阶段效应的影响。第四，尽管这项研究建立了统计相关性，但阐明具体的生物学机制需要额外的探索。未来的研究可以在不同祖先人群中进行跨种族MR分析、利用纵向队列数据探索生命历程中的因果效应动态、以及结合多组学数据来阐明潜在的生物学机制，并在细胞和动物模型水平上验证这些血液代谢物与PTB之间的关联。尽管其应用存在一定的局限性，但本研究可为揭示宿主-MTB之间相互作用的代谢机制，发现新型的生物标志物，并识别高危人群和治疗靶点提供重要参考。

利益冲突

所有作者声明无利益冲突。

作者贡献声明

张艳灵：研究设计，论文撰写；孙书芳：数据分析与整理，文章撰写；李庆海：数据处理与可视化，文章校对及修改；于新娟：数据分析与整理，文章修改；王瑶瑶：数据获取、清洗与初步分析，文章校对；郝万明：研究指导，文章定稿，资金支持。

基金项目

山东省医药卫生科技重点项目(202403020661)。

附 件

Supplementary Table S1. Detailed classification information of 42 blood metabolites

补充表S1. 42种血液代谢物的详细分类信息

主类	血液代谢物	数量	占比
脂质	1-oleoyl-GPC (18:1) levels	12	28.57%
	1-linoleoyl-GPE (18:2) levels
	1-stearoyl-2-linoleoyl-GPC (18:0/18:2) levels
	1-myristoyl-2-arachidonoyl-GPC (14:0/20:4) levels
	1-oleoyl-2-linoleoyl-GPE (18:1/18:2) levels
	1-stearoyl-2-arachidonoyl-GPC (18:0/20:4) levels
	(1-palmitoyl-2-linoleoyl-GPI) levels
	1-palmitoyl-2-arachidonoyl-GPC (16:0/20:4n6) levels
	1-(1-enyl-palmitoyl)-GPE (p-16:0) levels
	1-(1-enyl-palmitoyl)-2-linoleoyl-GPE (p-16:0/18:2) levels
	Glycosyl-N-stearoyl-sphingosine (d18:1/18:0) levels
	Hydroxypalmitoyl sphingomyelin (d18:1/16:0(OH)) levels
有机酸类	Oxalate (ethanedioate) levels	4	9.52%
	3-methyladipate levels
	Orotate levels
	Decadienedioic acid (C10:2-DC) levels
酰基肉碱类	Carnitine C5:1 levels	2	4.76%
	Pimeloylcarnitine/3-methyladipoylcarnitine (C7-DC) levels
氨基酸及其衍生物	Tryptophan betaine levels	4	9.52%
	Hydroxyasparagine levels
	5-hydroxyindole sulfate levels
	N-acetylneuraminate levels
硫酸盐/酯类	Propyl 4-hydroxybenzoate sulfate levels	2	4.76%
	Androsterone sulfate levels
糖类	Fructose levels	1	2.38%
全氟化合物	Perfluorooctanesulfonate (PFOS) levels	1	2.38%
代谢物比值	Cysteine to alanine ratio ratio	9	21.43%
	Phosphate to uridine ratio ratio
	Phosphate to glycerol ratio ratio
	N-stearoyl-sphingosine (d18:1/18:0) to N-palmitoyl-sphinganine (d18:0/16:0) ratio
	Glycerol to carnitine ratio
	Glutamate to 5-oxoproline ratio
	Arachidonate (20:4n6) to linoleate (18:2n6) ratio
	Oleoyl-linoleoyl-glycerol (18:1 to 18:2) [2] to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [1] ratio
	Oleoyl-linoleoyl-glycerol (18:1 to 18:2) [2] to linoleoyl-arachidonoyl-glycerol (18:2 to 20:4) [2] ratio
其他/未分类	X-12847 levels	7	16.67%
	X-16397 levels
	X-21807 levels
	X-23636 levels
	X-25810 levels
	Androsterone glucuronide levels
	Hexadecadienoate (16:2n6) levels

注：分类信息参考KEGG通路数据库(KEGG PATHWAY Database)及人类代谢组数据库(Human Metabolome Database)等。

NOTES

^*通讯作者。