1. 引言
自从最近出现超分辨率显微镜以来，对超过光学衍射极限的亚细胞结构进行成像的能力已经彻底改变了我们对细胞的看法，超分辨率显微镜通过图案化照明(如受激发射耗尽(STED)) [1] [2]或通过图像重建(如光活化定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM))来实现[3] [4]。依赖于单分子定位的PALM/STORM几乎达到了细胞中分子定位的最终空间分辨率，由目前可用的荧光探针确定。然而，最近引入了最小光子通量(MINFLUX) [5]纳米显微镜，它结合了STED和PALM/STORM的特定优势。在MINFLUX纳米显微镜中，通过将中心强度最小的甜甜圈形激发光束主动引导至荧光团并对其进行三角测量来确定单个荧光团的定位。到目前为止，MINFLUX可以更有效地利用荧光团的有限光子预算，并在1~5 nm范围内实现迄今为止已知的所有纳米显微镜方法中最高的定位精度。然而，这一技术对荧光探针的性能提出了极高要求，特别是在闪烁行为的可控性、发光稳定性以及与标记体系的适配性方面。目前常用的光开关型有机染料如Alexa Fluor 647 [6]、CF660C等已广泛用于DNA-PAINT [7]与免疫标记体系中，但其依赖特殊缓冲液[8]实现受控闪烁，且易出现漂白与伪定位问题。自发闪烁型染料(如SiR-amine) [9]虽实现了部分缓冲液独立性，但其闪烁行为仍受限于分子结构设计，成像速率和信噪比提升空间有限。
半导体量子点(QDs) [10]因其小尺寸(通常为<10 nm)、高量子产率、窄且可调的发射光谱和抗漂白能力在生物系统中的单分子成像方面具有很大的前景。特别是，QDs也是超分辨率荧光成像的合适候选者。这主要得益于在大多数量子点中观察到的自然闪烁现象[11]。实际上，基于量子点闪烁的超分辨率最早是在2005年报道的[12] [13]。量子点与4Pi显微镜一起使用，以实现100 nm的轴向分辨率[14]。量子点闪烁已被用于在称为超分辨率光学波动成像(SOFI)的技术中将空间分辨率提高到50 nm，由此通过不同阶数的相关函数来评估记录帧的开–关波动[15]。CdSe QDs还用于通过利用其自然闪烁或增强闪烁特性与超分辨率光学波动成像来增强空间分辨率，在具有三维成像的量子点闪烁技术(QDB3)中，具有闪烁QDs的3D超分辨率成像通过减去后续帧来提取各个QDs的PSF来实现，再次利用QDs的随机闪烁[16]。Hoyer等人[17]使用生物结合的CdSe/ZnS QDs获得了12 nm单点大小的分辨能力。Wang等[18]报道了一种具有纳米分辨率的3D成像技术新方法，在x-y平面上实现了8至17 nm的成像分辨率，在z方向上实现了58至81 nm的成像分辨率。
然而，尽管QDs半导体量子点在生物领域的应用潜力和成功，但最具代表性的CdSe/ZnS QDs闪烁行为的短时间“关闭”和长时间“打开”状态成为研究难点之一，尤其是在CdSe/ZnS QDs核壳体系中因表面缺陷和电荷俘获更易观测闪烁现象。这种特性限制了在PSF的区域内可以区分的QDs的数量，从而使得难以利用自然QDs闪烁进行单分子超分辨率成像。但是，对于MINFLUX，它是理想的每个荧光探针的关断时间比on-time限制处于on状态的荧光基团的数量在单个成像帧内。为了解决低闪烁QDs的问题，CdSe/ZnS QDs的蓝化已被用于微管的超分辨率成像，如同使用两种尺寸的QDs对微管和线粒体进行双色QSTORM成像一样(QD 705 nm和QD 565 nm) [19]。此外，在MINFLUX的定位精度范围内，探针的大小对于超分辨成像也是尤为重要的。商业CdSe/ZnS QDs通常涂有厚壳和聚合物涂层，这使它们的大小达到15~20 nm。这用于生物标记是相对较大的。这些涂层，虽然提供更高的亮度和化学稳定性，往往还可以减少闪烁，以便QDs大部分时间都位于ON状态，并且处于OFF状态的时间相当短，这是可取的适用于大多数生物成像应用。但对于MINFLUX，每个分子的关闭时间必须远大于开启时间。
在本报告中，通过采用了一定壳厚比例并通过羧基封端的聚乙二醇配体对CdSe/ZnS QDs进行钝化，使其表现出低占空比和每次开关事件高光子输出的闪烁行为。这一光物理特性使得量子点能够在MINFLUX成像中实现有效的单分子定位，实现高灵敏度的量子点成像。结果表明，QDs荧光探针能够在约1.2 nm的定位精度下分辨高度密集堆积的粒子，并组装得到高密度的超分辨率图像。本研究首次证明了QDs在MINFLUX中的可行性，为其作为新型荧光探针在高精度成像领域的进一步应用提供了实验依据。
2. 方法
2.1. 材料
对于细胞培养与样品制备，所用MEM培养基、胎牛血清以及非必需氨基酸均购自Gibco；还原剂硼氢化钠购自Sigma-Aldrich；固定剂多聚甲醛与戊二醛由Electron Microscopy Sciences提供。免疫荧光标记实验中，所采用的一抗为以CdSe/ZnS QDs标记的生物素化小鼠抗α微管蛋白抗体，二抗为由CdSe/ZnS QDs标记的山羊抗小鼠IgG抗体。
2.2. CdSe/ZnS QDs的表征
高分辨率透射电子显微镜(HR TEM)图像和选定区域电子衍射(SAED)光谱在Philips FEIT ecnaiG220S-TWIN仪器上进行。简而言之，将稀释的CdSe/ZnS QDs溶液滴到400铜网格上，过量的溶剂立即蒸发，然后将样品放到显微镜中进行观察。
2.3. CdSe/ZnS QDs与山羊抗小鼠IgG的偶联
CdSe/ZnS QDs在甲醇(30 μL, 50 mg/mL)中与EDC (100 mg/mL)和NHS (100 mg/mL)室温反应30 min，活化后的CdSe/ZnS QDs与山羊抗小鼠IgG二抗(PBS中2.5 mg/mL)混合反应4 h以上，甲醇用量低于总反应体积的4%~5%。使用分子量(MW)截止值为100 kDa的过滤膜对PBS缓冲液进行反复超滤。最后将纯化的IgG-CD偶联物保存在4℃以供进一步使用。采用荧光相关光谱法(FCS)和动态光散射法(DLS，ZEN3600，Malvern仪器公司，英国)评估CdSe/ZnS QDs与IgG的结合。
2.4. 细胞培养
BSC-1细胞(ATCCCCL-26, BeNa Culture Collection, China)在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中进行维持，使用MEM培养基(11095-080, Gibco)，并补充10%胎牛血清(FBS, 10099-141, Gibco)及1%非必需氨基酸(NEAA, 11140-050, Gibco)。细胞悬液接种于预先包被14 mL-多赖氨酸(L-PLL)涂层盖玻片的12孔板中，培养持续48小时后进行后续固定处理。
2.5. 样品制备
为实现细胞结构的初步固定，使用PBS轻轻润湿细胞一次，在室温下以预热的提取缓冲液(含0.1 MPIPES、1 mM EGTA、1 mM MgCl2和0.2% TritonX-100)处理60秒以去除细胞膜。提取后迅速抽除溶液，并立即加入预热至37 ℃的固定液(4%多聚甲醛[157-8, Electron Microscopy Sciences]和0.1%戊二醛[16220, Electron Microscopy Sciences])，在室温下孵育10分钟以实现化学交联固定。固定完成后以PBS冲洗三次，用含10 mM硼氢化钠(71320, Sigma)的PBS溶液处理5分钟以降低醛类残留自发荧光。再次以PBS清洗至完全无气泡残留。为封闭非特异性结合位点，将细胞在室温下置于封闭液中孵育20 min。封闭液配方为50%BSA (由10%BSA在PBS中稀释)、5%驴血清和10%TritonX-100的混合溶液。之后以PBS清洗30分钟。二抗染色步骤中，细胞与稀释于含1%BSA的PBS缓冲液中的二抗(1:50)在室温下孵育45分钟。进行6次PBS清洗，每次持续5分钟，以充分去除未结合抗体。将样品与金颗粒溶液共同孵育20分钟，以PBS冲洗两次，去除未结合的金颗粒，以降低其在后续成像中的干扰。处理完成后，样品储存在4 ℃条件下直至成像。
3. 光学设置
3.1. MINFLUX的原理
本研究中采用了MINFLUX超分辨显微成像系统[20] (图1(A))。该系统的核心组件包括：用于激发量子点的642 nm连续波激光器、高数值孔径物镜(NA = 1.4，100×油浸物镜)、象限型单光子雪崩二极管(SPAD)探测器阵列，以及基于声光调制器(AOM)的快速光束整形模块。为了实现纳米级的定位精度，系统通过迭代优化环形(donut-shaped)激发光场完成分子定位。首先，采用高斯光束进行粗略聚焦(图1(B)步骤1)；随后，系统切换至二维环形激发光场(图1(B)步骤2~4)，在预设的四个坐标点(蓝色、紫色、红色和黄色)进行扫描，以采集荧光光子计数的空间分布。最终，目标量子点的精确位置通过最大似然估计(MLE)算法实时确定。图1(C)显示不同维度的不同成像效果。在每一次迭代过程中，荧光强度与目标坐标之间的空间相关性显著增强(图1(D)，颜色梯度)。本实验采用的MINFLUX二维迭代序列，其关键参数详列于表1。
3.2. 数据采集
样品固定于高精度玻片中，在配备NA = 1.4，100×的Abberior MINFLUX显微镜(Abberior×如前所述，油性物镜。使用642 nm激发在2D MINFLUX成像模式下采集图像激光(60.7 μWcm–2)。测量激光功率使用Thorlabs在物镜背焦平面的位置配备S100C传感器头的PM120D功率计。所有MINFLUX图像显示导出的文件仅由记录的有效本地化参数组成，不包括任何丢弃或无效的本地化记录。此外，对于所有计算，仅使用来自MINFLUX的最终迭代(2D中的第四次迭代)。并使用Imspector和ImageJ渲染和采集(版本16.3.11657，Abberior)，在直方图模式下具有4 nm像素大小。
为增强成像稳定性，样品预先在10%金纳米棒(A12-40-980-CTAB-DIH-125, Nano Stone Inc)的PBS缓冲液中孵育15分钟，随后经PBS充分洗涤。在成像前，启动系统的主动稳定模块，漂移控制精度可达亚纳米级(<1 nm)。于共聚焦图像中选定感兴趣区域，并在软件中调节激光功率和针孔大小后启动MINFLUX采集。激发波长设定为642 nm，功率为3%，检测波段设置为650~685 nm。随后选择适当序列进行高精度定位数据的采集。对于微管半高宽值的测定，利用Imspector软件中的线分析函数对图像进行高斯拟合。将获得的结果导出到Origin 2021，以确定半高宽。
Figure 1. Schematic of the MINFLUX system. (A) Optical layout of the system. (B) The excitation beam sequentially targets four predefined coordinates to achieve iterative x–y localization; these coordinates form a tetrahedral calibration pattern (TCP; violet, red, yellow, and green indicate the beam positions). The localization procedure involves focus stabilization (Step 1) and two-dimensional donut-beam scanning (Steps 2~4). Typical photon count readouts for each iteration step are shown, with color coding corresponding to the target coordinates. (C) Imaging performance in different spatial dimensions. (D) Conceptual illustration of the MINFLUX nanoscopy principle
图1. 自MINFLUX系统示意图。(A) 系统光路示意图。(B) 激发光束依次对准四个预设坐标，实现迭代式x–y定位，这些坐标点构成四面体校准图样(TCP；紫、红、黄、绿四个光束位置)。定位过程包括焦点稳定(步骤1)以及二维环形光束扫描(步骤2~4)。图中展示了各迭代步骤的典型荧光计数结果，并以目标坐标颜色标注。(C) 不同维度下的成像效果。(D) MINFLUX纳米显微成像的原理示意图
Table 1. Key parameters of the MINFLUX 2D iteration sequence
表1. MINFLUX二维迭代序列的关键参数
2D imaging |
Center frequency
ratio limits
(CFR) |
Dwell time(ms) |
L-size (nm) |
Minimal Photon count |
Laser
power
factor |
TCP |
Pattern repeat |
Background Threshold (kHz) |
Pre-scan |
Off |
≥1 |
288 |
160 |
1 |
Hexagon |
1 |
15 |
1stiteration |
0.5 |
≥1 |
288 |
150 |
1 |
Hexagon |
5 |
10 |
2nditeration |
Off |
≥1 |
151.2 |
100 |
2 |
Hexagon |
5 |
10 |
3rditeration |
0.8 |
≥1 |
75.6 |
100 |
4 |
Hexagon |
5 |
10 |
4thiteration |
Off |
≥1 |
39.6 |
150 |
6 |
Hexagon |
5 |
10 |
3.3. 数据导出
实验数据由Abberior MINFLUX显微镜(Abberior Instruments)结合Imspector软件采集并处理。每组MINFLUX成像数据均通过Imspector软件导出，所得数据文件包含全部有效定位事件的参数记录，同时保留了因信号质量不足而被排除的无效定位尝试的相关信息。
4. 实验结果与分析
4.1. 结构与光学表征
众所周知，富含羧基会使得QDs上闪烁循环减少[21]。基于此，设计了一种颗粒表面羧基比例大于胺基的结构。其中，少量胺基基团的保留产生了更多的表面状态，以通过胺–硫醇偶联结合单价抗体片段。通过使用EDC和NHS作为零长度交联剂，QDs的羧基基团容易与抗体表面的氨基基团反应(详细过程如图2(A)所示，图未按比例绘制)，这样QDs就更容易与蛋白质缀合。图2(B)和图2(C)分别显示了透射电子显微镜(TEM，高分辨率)图像和QDs的尺寸分布。QDs的尺寸主要集中在1~4 nm范围内，平均直径约为1.8 nm，表现出较窄的分布特征。通常情况下，较小的荧光探针尺寸更有利于在生物成像中的应用，因为其能够在保持荧光性能的同时，最大程度减少对生物体系的空间干扰。图2(D)显示出QDs的吸收和辐射荧光光谱显示出300至700 nm范围内的宽光学吸收，第一个激子峰值约为650 nm。激发后，在约705 nm处表现出一个尖锐的荧光发射峰。激发–发射矩阵显示了两个中心为520和590 nm的主要激发区(图2(D))。
Figure 2. Structural design and optical properties of the prepared QDs. (A) Schematic illustration of QDs labeling microtubules. (B) Transmission electron microscopy (TEM) image of the QDs. (C) Size distribution of the QDs. (D) Absorption and photoluminescence spectra of the QDs
图2. 制备的QDs的结构设计和光学特性。(A) 设计QDs标记微管蛋白的示意图；(B) QDs的透射电子显微镜(TEM)图像；(C) QDs的尺寸大小分布；(D) QDs的吸收和辐射荧光光谱
4.2. QDs的闪烁特性
接下来，对未处理QDs培养物连续10,000帧的成像进行分析。实验使用642 nm的激光进行激发，预期QDs在可见光中会呈现明显的闪烁。图3(A)显示出了在激光激发下沿着时间轴的每个像素的最大强度投影。在单帧成像(1帧)时即可观察到清晰的数据信号；当累积至1000帧时，大部分荧光探针进入关闭状态。在延长至10,000帧后，仍可发现绝大多数量子点保持活跃的荧光闪烁，且未出现显著的光漂白或永久性猝灭现象。这一现象表明，QDs的表面修饰可能通过钝化表面缺陷态或抑制电荷分离，有效增强了其抗光漂白能力，这可以证明QDs的闪烁状态。同时，图3(B)显示的QDs修饰后的闪烁数据表明其非常适合MINFLUX成像应用。
Figure 3. Blinking properties of QDs. (A) Time-lapse imaging of QDs over 10,000 consecutive frames. (B) Blinking characterization of surface-modified QDs
图3. QDs的闪烁特性。(A) QDs培养物连续10,000帧的成像图。(B) 修饰后的QDs的闪烁表征图
4.3. QDs的MINFLUX成像
4.3.1. 溶液中的QDs
为了验证QDs在MINFLUX成像中的适用性，首要步骤是对单个QDs的定位精度进行系统表征。在图4(A)中对QDs的定位精度进行表征。定位精度计算公式为：
其中S是PSF的标准差(SD)，a是给定像素的尺寸(在设置中为130 nm)，b是背景噪声(通过分析图像中不包含量子点的像素)，N是从荧光团收集的光子数。图4(B)是QDs的MINFLUX的成像结果图，利用这些图像，发现量子点的平均定位精度为3.42 nm (未排除无效数据)。显然，在这些理想条件下，QDs可以定位到更高的精度，这主要是由于他的亮度要高得多。目前<5 nm的定位精度用于基于MINFLUX的超分辨率成像的许多其他荧光团相当或更好。如图4(C)所示，单颗粒半高宽达到35 nm，显著优于传统共聚焦成像。超分辨放大图像图进一步表明，MINFLUX技术能够解析QDs的亚衍射极限空间分布，即使在高密度标记区域(白框内)亦可清晰区分相邻纳米颗粒。
4.3.2. 微管蛋白上的QDs
在本研究中，我们应用固定的U-2OS细胞中对微管蛋白进行MINFLUX成像验证性实验。通过最大视野成像获得了细胞内完整的微管网络分布(图5(A))，在此基础上，进一步选取局部区域进行范围成像(图5(B))，以便放大观察局部纤维结构。在MINFLUX模式下，获得了QDs标记下的微管图像(图5(C))，尽管整体成像的连续性和清晰度仍有待提升，但依然能够辨识出纤维状的细胞骨架轮廓。值得注意的是，这是QDs首次在MINFLUX系统中实现对细胞内骨架蛋白的成像，结果表明QDs具备作为该类超分辨技术荧光探针的应用潜力。进一步地，实验对成像的定位精度进行了统计，结果显示QDs在MINFLUX下能够实现约1.2 nm的定位精度(图5(D)-(E)。这一结果充分说明，整体图像的清晰度已经接近有机染料或商业化探针，表明QDs作为荧光团在MINFLUX中展现出了极高的空间分辨能力。结合其优异的光稳定性和可调控的发光特性，QDs在MINFLUX成像领域具有独特优势和进一步优化的可能性。
Figure 4. Localization precision of QDs. (A) Confocal image of QDs in solution. (B) MINFLUX image of QDs with a magnified view of the selected region (inset shows the intensity profile along the dashed line). (C) Histogram of QD localization precision in the lateral (x–y) direction. (D) Histogram of QD localization precision in the axial (z) direction
图4. QDs的定位精度测试。(A) QDs在溶液中confocal成像图。(B) QDs的MINFLUX成像图以及区域放大图像(插图为虚线部分的强度曲线图)。(C) QDs在XY轴方向的定位精度直方图。(D) QDs在Z轴方向的定位精度直方图
5. 总结
本文设计了一种特定壳层比例的QDs，在642 nm激发下表现出稳定且连续的荧光间歇性，首次实现了QDs在MINFLUX技术中的应用。该方法在PBS缓冲液中即可观察到清晰的信号波动，无需额外的特殊缓冲液。结合抗体标记制备的纳米探针，实现了对固定U-2OS细胞中微管蛋白的2DMINFLUX成像。实验结果表明，基于QDs的纳米探针能够实现约1.2 nm的定位精度(原始数据中位数)，并展现出良
Figure 5. MINFLUX imaging of QDs-labeled microtubules. (A) Overview image showing the maximal microtubule region. (B) Selected region of interest. (C) MINFLUX reconstruction of the selected area. (D) Display σx = 1.3 nm, σy = 1.1 nm. (E) Localization precision map
图5. QDs标记微管的MINFLUX成像结果。(A) 微管最大区域显示图。(B) 选取区域图。(C) MINFLUX对选取区域的成像图。(D) 显示σx = 1.3 nm, σy = 1.1 nm。(E) 定位精度图
好的空间分辨能力。从获得的MINFLUX图像可以看出，所使用的量子点具备成为优良成像探针的潜力。尽管存在表面修饰(PEG、羧基)或轻微的团聚的现象，使可结合位点减少或变得不均匀导致部分QDs可能粘附在非靶标位置或被遮蔽，影响了图像连续性。另外，在数据处理过程中，严格的峰值筛选、位点合并和高光子数阈值会把低光子事件(真实但弱的QDs发光)剔除，放大“断裂”现象。为进一步改善成像连续性，后续工作将聚焦于优化偶联条件和表面配体比例，采用短链共价连接策略以减小空间位阻，并通过离心分级与膜过滤消除微量聚集体，同时结合单粒子闪烁动力学统计与时序重建算法，提高弱信号事件的回收率。但本研究已验证了QDs在MINFLUX平台上的可行性。未来，通过进一步改进表面修饰与化学特性，QDs也有望扩展至活细胞超分辨成像。凭借其优异的光稳定性、较小的尺寸以及超高分辨率，量子点在MINFLUX及其他纳米显微成像技术中具有广阔的发展前景。
NOTES
*通讯作者。