J、K亚型禽白血病病毒双重PCR检测方法建立及应用

Establishment and Application of Multiple PCR for Detection of Avian Leukosis Viruses Subgroup J and K

摘要: 为检测进境鸡群是否感染禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)，本研究针对主要的外源性ALV亚群ALV-J和ALV-K的基因保守区域设计引物和探针，通过体系优化，特异性、灵敏性和重复性评估，建立了可同时检测ALV-J和ALV-K的双重荧光PCR方法。结果显示，该方法与禽多种疫病无交叉反应，有较好的线性关系，ALV-J和ALV-K亚型的检测限分别为3.27 copies/μL和3.28 copies/μL。利用本研究建立的方法与传统的ELISA方法进行比对，结果表明建立的双重PCR方法检出率更高，可用于口岸禽白血病监测和疫病防控。

Abstract: In order to detect Avian leukosis virus (ALV) infection in imported chickens, primers and probes were designed for the gene-conserved regions of major exogenous ALV subpopulations ALV-J and ALV-K. Through system optimization, specificity, sensitivity and reproducibility evaluation, primers and probes were designed. A dual fluorescence PCR method was developed to detect ALV-J and ALV-K simultaneously. The results showed that there was no cross-reaction between the method and various avian diseases, and there was a good linear relationship with the detection limit of 3.27 copies/μL and 3.28 copies/μL. Compared with the traditional ELISA method, the results showed that the established dual PCR method had a higher detection rate, and could be used for avian leukemia monitoring and disease prevention at ports.

1. 引言

禽白血病是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)引起的一种禽肿瘤性疾病，该病可垂直传播，目前无疫苗用来免疫，主要通过种源净化淘汰感染鸡来控制该病的传播。国内外对ALV的检测和鉴定方法主要有病毒分离、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光检测(IFA)及基于PCR的分子生物学检测技术等[1]-[3]。病毒分离方法相对最为可靠，但检测周期长，需结合其它方法才能鉴定亚群。群特异性抗原ELISA检测方法在我国临床上应用最广，操作相对简单，有商品化试剂盒可用，但不能有效区分内源性和外源性ALV。IFA比较直观，但需要用到特异性单克隆抗体。针对ALV的PCR方法也有报道，但多为鉴定一种亚群的单一PCR或荧光定量PCR。每种检测方法各有其优缺点，加上鸡群ALV感染状态的复杂性，目前业界普遍认为没有哪种方法在任一时期绝对可靠，又因进境种鸡存在日龄低，隔离周期短，应激反应大，重复采样困难等问题，选择两种以上合适的方法组合开展检疫工作，可极大提高检出率，避免鸡群应激反应。因此，建立高效、快速的检测方法有助于提高检测效率。

本研究利用TaqMan荧光定量PCR技术对ALV-J和K亚群2种病毒株的gp85基因进行序列分析，设计并合成特异性引物和探针，成功建立了ALV-J和K亚群双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，可用于AL亚群的鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。

2. 试验材料

2.1. 病毒和细胞

ALV-J亚型病毒、ALV-K亚型病毒由扬州大学动物医学院惠赠；传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)，新城疫病毒(NDV)由南京农业大学惠赠；成纤维细胞系DF-1，购于武汉尚恩生物科技有限公司。

2.2. 样品来源

临床样品包含抗凝血及泄殖腔拭子，来源于进境种鸡和国内养殖厂。

2.3. 试验主要试剂

2 × Rapid Taq Master Mix (P222-4A)、核酸提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；ALV抗原检测试剂盒购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。DEPC水、cDNA合成试剂盒(PrimeScriptT II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、一步法荧光RT-PCR试剂盒(One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit-Perfect Real Time)、探针法荧光PCR试剂盒(PremixExTaq)均购自宝生物工程(大连)有限公司，核酸提取/纯化试剂盒购自西安天隆科技有限公司。

2.4. 主要仪器设备

自动核酸提取仪NP968-C (西安天隆科技有限公司)，Allegrax-30R高速冷冻离心机(Beckman，美国)，超微量核酸蛋白检测仪One Drop D-1000 + (NEDROB，中国)，恒温震荡金属浴(ThermoFisher Scientific，德国)，Vortex Genie 2涡旋振荡器(Scientific Industries，美国)，实时荧光PCR仪器(ABI Q5)。

2.5. 引物设计与合成

针对J、K亚型毒株GP85基因设计引物，比对在同一亚型中相对保守，在不同亚型中存在差异的区域，根据J亚型毒株GX13DF52 (登录号：KU848768.1)和K亚型毒株CH/JXDX2301 (登录号：OR670959.1)序列分别设计探针和引物，由上海生工生物工程有限公司合成(见表1)。

Table 1. Primer sequences

表1. 引物序列

引物名称	引物序列	扩增片段	病毒亚群
ALV-JF	CCGAACAGATTTTTGCCTTAGT	79	ALV-J
ALV-JR	AGGATACTGTGGAATGCCTATCAAG
ALV-JP	^FAM^−ACAGTCAGCAACCTCACCATTCCGC^−^BHQ1
ALV-KF	TACGGGCCAAACGGACTTC	80	ALV-K
ALV-KR	GGGACGGGATACCTATCAAACA
ALV-KP	^VIC^−TACACAGTCAGCCACCTCCCCCTTTCA^−^BHQ1

2.6. 标准质粒合成

将ALV-J和ALV-K亚型毒株扩增特异性片段克隆至pUC57载体中，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，作为本试验方法建立的标准质粒(pUC57-ALV-J, pUC57-ALV-K)。

3. 试验方法

3.1. 病毒分离与检测

采集无菌抗凝血样品，离心分离血浆备用；接种DF-1细胞，5% CO₂，37℃孵育2 h后，弃去培养基，用含1%胎牛血清的DMEM培养基维持培养7 d，将细胞传代1~2次继续培养7 d，收集细胞上清于−20℃反复冻融2次，利用ALV抗原检测试剂盒进行检测。

3.2. 病毒RNA提取

参照西安天隆科技有限公司的核酸提取/纯化试剂盒使用说明，配合使用全自动核酸提取仪从细胞培养上清中提取病毒RNA。

3.3. 标准质粒的拷贝数

3.3.1. pUC57-ALV-J、pUC57-ALV-K阳性质粒OD值的测定

阳性质粒分别取1~2 μL，在260 nm/280 nm波长下用紫外分光光度计进行重组阳性质粒OD值检测，选OD260 nm/OD280 nm比值为1.8~2.0范围内的阳性质粒标准品用于标准曲线的建立。

3.3.2. pUC57-ALV-J、pUC57-ALV-K阳性质粒拷贝数的计算

根据公式计算OD260 nm/OD280 nm比值在1.8~2.0范围内的阳性重组质粒。质粒拷贝数(copies/µL) = 质粒浓度(ng/µL) × 6.02×10²³/660 × 质粒总长度(bp)

3.4. TaqMan双重荧光RT-PCR检测方法条件优化

模板为10⁻³稀释的质粒标准品，引物和探针浓度分别为0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L，引物和探针最佳浓度的确定采用矩阵法。为了获得TaqMan荧光定量PCR引物和探针的最佳程序，使其具有较好的荧光增幅和扩增效率，对TaqMan实时荧光定量PCR循环进行筛选。同时，退火温度由55℃逐步递增到65℃，筛选最佳退火温度。每个样品做3次平行重复，以ddH₂O作为空白对照。同时，采用了双温循环和三温循环两种反应程序(表2和表3)。

Table 2. Standard dual-temperature cycling mode

表2. 双温循环标准模式

温度	时间	循环数
25℃	2 min (如无污染，可省略)	1
95℃	20 s	1
95℃	1 s	40
60℃	20 s/30s

Table 3. Standard three-temperature cycling mode

表3. 三温循环标准模式

温度	时间	循环数
25℃	2 min (如无污染，可省略)	1
95℃	20 s	1
95℃	1 s	40
60℃	20 s/30s
72℃	20 s/30s

3.5. 标准曲线建立

以两种质粒作为标准品，进行10倍稀释，采用优化后的反应条件及反应程序，在引物和TaqMan探针的引导下进行实时定量RT-PCR检测。以DNA拷贝数的对数作为横坐标，以循环反应中的Ct值作为纵坐标，建立标准曲线。

当质粒标准品Ct值 < 30，阴性对照无特异性扩增曲线或Ct值 > 40时，试验结果成立。反应结束后根据扩增曲线对结果进行判定，当Ct值 < 35，且存在明显的S型扩增曲线时，结果判定为阳性；无特异性扩增曲线或Ct值 > 40时，结果判定为阴性；35 ≤ Ct值 ≤ 40时的样本判定为可疑，需重新对样本进行检测，重做结果无特异性扩增曲线或Ct值 ≥ 40时，结果判定为阴性，反之为阳性。

3.6. 方法敏感性

以10⁰~10¹⁰倍稀释的标准品为模板，以超纯水代替模板作为空白对照，用优化的引物、探针浓度和程序进行TaqMan荧光定量PCR检测，检测其敏感性。

3.7. 方法特异性

分别提取NDV、IBDV、IBV、AIV毒株的DNA/cDNA，以此作为模板，以10²稀释标准品为阳性对照，超纯水代替模板作为阴性对照，进行TaqMan实时荧光定量PCR，检测其特异性。

3.8. 方法重复性

以10⁵~10⁸倍稀释的标准品为模板进行重复性试验，每个样品做3个平行重复(批内)，试验重复3次(批间)。计算所得值的变异系数。

3.9. 临床样品检测

对收集的24份临床样品，包括12份阳性，按照建立的多重PCR方法进行检测，以评价方法的适用性。

4. 结果

4.1. 反应条件优化结果

对引物浓度、退火温度和扩增程序等条件进行优化。结果显示，最佳的反应体系见表4，J亚型引物探针浓度为10 μM时，20 μL反应体系的加量均为0.4 μL；K亚型引物探针浓度为10 μM时，20 μL反应体系的加量分别为0.2 μL和0.4 μL；最佳退火温度为60℃，选择双温循环程序结果最优(表5)。

Table 4. Optimal reaction system

表4. 最佳反应体系

组分	体积(μL)
Mix	10
J-F/R/P (10 μM)	0.4/0.4/0.4
K-F/R/P (10 μM)	0.2/0.2/0.4
模板	1
ddH2O	7
总体积	20

Table 5. Optimal reaction procedure

表5. 最佳反应程序

温度	时间	循环
95℃	20 s	—
95℃	1 s	40
60℃	30 s
收集荧光信号

4.2. 标准曲线的构建

以pUC57-ALV-J、pUC57-ALV-K两种质粒作为标准品，进行10倍稀释，采用优化后的反应条件及反应程序进行实时定量PCR检测。以DNA拷贝数的对数作为横坐标，以循环反应中的Ct值作为纵坐标，建立标准曲线。ALV-J标准曲线为y = −3.4802x + 45.096，R² = 0.9996，扩增效率E = 93.8%；ALV-K标准曲线为y = −3.4323x + 45.054，R² = 0.9942，E = 95.6%。R²均大于0.98，E均大于90%，该方法线性关系良好(图1)。

Figure 1. Standard curve for ALV-J and ALV-K

图1. ALV-J和ALV-K标准曲线

4.3. 敏感性试验结果

以10⁰~10¹⁰倍稀释的pUC57-ALV-J、pUC57-ALV-K阳性质粒为模板进行双重实时荧光PCR试验，ALV-J和ALV-K检测下限均为10⁸倍稀释的标准质粒。按照2.3对质粒浓度测定和拷贝数换算，pUC57-ALV-J、pUC57-ALV-K阳性质粒原液的浓度均为1 μg/mL，拷贝数分别为3.27 × 10⁸ copies/μL和3.28 × 10⁸ copies/μL，因此可以确定建立的双重荧光PCR方法的检测下限分别为3.27 copies/μL和3.28 copies/μL (图2)。

Figure 2. Sensitivity of the TaqMan-based duplex fluorescent PCR assay

图2. TaqMan双重荧光PCR灵敏性试验结果

4.4. 特异性试验结果

采用优化后的双重荧光PCR方法对ALV-J、ALV-K、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)，新城疫病毒(NDV)进行特异性试验。结果显示，ALV-J、ALV-K均可扩增出典型S曲线，而其它病毒未见扩增曲线，表明所建立的多重PCR方法特异性良好(图3)。

Figure 3. Specificity of the TaqMan duplex real-time PCR assay

图3. TaqMan双重荧光PCR特异性检测结果

4.5. 稳定性试验

以10⁵~10⁷倍稀释的阳性质粒标准品分别进行批内和批间稳定性评估，结果显示：批内变异系数在0.220%~0.499%范围内，均小于0.5%，批间变异系数在0.669%~1.2%范围内，均小于2%，表明该方法具有较好的稳定性，保证了结果的可重复性(表6)。

Table 6. Repeatability of TaqMan dual fluorescence PCR method

表6. TaqMan双重荧光PCR方法的重复性

模板	稀释倍数	批内			批间
		平均值	标准差	变异系数(%)	平均值	标准差	变异系数(%)
ALV-J	10^5	24.02	0.052	0.220	24.15	0.161	0.669
	10^6	28.22	0.125	0.443	28.23	0.271	0.96
	10^7	31.13	0.155	0.499	31.49	0.300	0.953
ALV-K	10^5	24.29	0.106	0.436	24.55	0.221	0.898
	10^6	27.50	0.121	0.438	27.84	0.264	0.950
	10^7	30.72	0.127	0.412	31.06	0.373	1.200

4.6. 临床样品检测结果

对24份临床抗凝血样品接种DF1-1细胞进行病毒分离培养后收集的细胞培养液通过建立的双重荧光PCR方法，P27抗原ELISA进行检测。结果显示，与ELISA方法相比，符合率为50%，说明荧光PCR方法可有效去除内源性干扰，更适合检测外源性ALV感染(表7)。

Table 7. Application of the TaqMan duplex real-time PCR method

表7. TaqMan双重荧光PCR方法的应用

样品编号	双重荧光PCR法		ELISA	样品编号	双重荧光PCR法		ELISA
	ALV-J(Ct值)	ALV-K(Ct值)			ALV-J(Ct值)	ALV-K(Ct值)
1	34.5	33.0	+	14	-	-	+
2	28.3	31.4	+	15	-	-	+
3	25.6	28.8	+	16	-	-	+
4	28.3	29.0	+	17	-	-	+
5	34.2	33.1	+	18	-	-	+
6	34.3	32.3	+	19	-	-	+
7	31.7	33.4	+	20	-	-	+
8	28.5	30.1	+	21	-	-	+
9	33.5	35.2	+	22	-	-	+
10	30.2	33.1	+	23	-	-	+
11	33.9	34.0	+	24	-	-	+
12	28.8	33.7	+	阳性对照	26.2	25.8	+
13	-	-	+	水	-	-	-

5. 结论

本研究成功建立了一种可同时检测禽白血病病毒J亚群和K亚群(ALV-J和ALV-K)的TaqMan双重实时荧光PCR方法。该方法针对ALV-J和ALV-K的gp85基因保守区域设计特异性引物和探针，并优化了反应体系与程序。验证结果表明，该方法特异性强，与禽流感、新城疫等其他常见禽类病原体无交叉反应；灵敏度高，对ALV-J和ALV-K的检测限分别达到3.27 copies/μL和3.28 copies/μL；重复性好，批内与批间变异系数均低于可接受范围，稳定性良好。在临床样品检测中，本方法与传统的p27抗原ELISA试剂盒相比，符合率为50%。这凸显了本方法的显著优势：能够有效规避内源性ALV的干扰，特异性检出致病性的外源性ALV-J和ALV-K感染。因此，本研究建立的双重荧光PCR方法是一种快速、灵敏、可靠的检测工具，适用于进境口岸的禽白血病监测和养殖场的疫病净化工作。

6. 讨论

在禽类疫病中，免疫抑制性病毒感染在我国鸡群中普遍存在，对养禽生产带来极大威胁，由此造成的经济损失无法计算。禽免疫抑制性病原体有很多种，在这些病原体中，禽白血病病毒(Avian leucosis virus, ALV)是危害的主要病原体。ALV有多个亚群，不同亚群的宿主范围和致病力并非一致，鸡只在感染了经典的ALV的A/B亚群后，由于该亚群主要侵害B淋巴细胞，因此感染鸡只会出现典型的淋巴细胞性肿瘤[4] [5]。ALV-J亚群，对鸡群的致病性较A/B亚群高，在一般情况下会诱使2~5月龄的肉鸡出现肿瘤性疾病，并且会导致肉鸡死亡，甚至还可以感染2月龄以下的鸡并诱发死亡[6]。目前，禽白血病还没有有效的药物可以治疗，也没有研制出可用的疫苗来防制ALV的感染，大部分国家和地区主要是靠净化的方式来实现AL的防制。因此在净化的过程中，对ALV的检测是必不可少的环节。

分离病毒进行鉴定在大多数病毒性疾病诊断的过程中是一个较为传统的手段。在进行细胞培养，收取培养物提取病毒基因组后，需要借助血清学技术或分子生物学实验技术进行鉴定。国内外已经建立了多种ALV检测方法，每种方法均有其优缺点和适用性。目前，ELISA检测在临床应用中极为广泛，对于ALV的ELISA检测主要针对的是p27抗原，但由于p27在ALV的各个亚群同源性很高，因此在检测过程中存在不能区分内源性和外源性ALV的缺点[7]。具有灵敏性高、特异性好等优点，可针对待检测样品的DNA进行特异性扩增。2004年，徐镔蕊等首次采用PCR方法检测了蛋鸡感染ALV-J亚群的情况[8]；胡晓苗使用PCR方法通过检测ALV的pol基因和env基因判断是否存在疫苗污染[9]。2010年，张太翔等人建立了一种qPCR方法，利用Taq Man探针来检测ALV，对待检样品的最低检出限可低至30个拷贝，具有很高的灵敏性[10]。Sathish Gopal等在印度南部的养殖场运用多重PCR方法鉴别ALV的不同亚群点[3]。本研究建立的ALV-J/K亚群的qPCR方法，能够快速检测ALV-J/K亚群，为鸡场和口岸进行AL的监测工作提供帮助，并为AL的检测提供技术支持。

基金项目

海关总署科研项目(项目编号：2022HK001)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。