摘要: 目的：采用MCD饲料喂养诱导小鼠非酒精性脂肪肝炎(NASH)模型，通过检测NASH相关指标来评价该模型的可行性。方法：将健康的C57BL/6小鼠采用随机分层方法将其分为对照组(饲养普通饲料，n = 6)和模型组(以MCD饲料干预，n = 6)，于第6周末将其处死。取肝脏组织称重，观察其形态变化，比较体质量及肝脏质量；肝组织分别进行苏木精–伊红(HE)染色以评估组织病理变化；油红O染色以观察脂质情况；Masson染色以观察纤维化程度；联酶免疫吸附实验(ELISA)检测肝脏炎性因子(TNF-
α、IL-6)表达，检测炎症水平。结果：与对照组相比，模型组小鼠肝组织表面暗淡无光，呈黄褐色，质地粗糙易碎且弹性差，体重显著降低(
P < 0.0001)，表明MCD诱导对小鼠的代谢状态产生了影响；通过HE染色观察，模型组小鼠肝细胞脂肪变性及炎性细胞浸润，表明MCD诱导能成功导致脂肪变性及肝细胞损伤；油红O染色显示，模型组小鼠肝组织出现大量红色脂滴，细胞内TG含量有所增加，表明MCD诱导能成功模拟肝细胞内脂质积聚；Masson染色显示模型组肝组织出现大范围蓝染胶原纤维，表明MCD诱导能成功导致轻度纤维化；模型组小鼠肝组织中TNF-
α (
P < 0.001)、IL-6 (
P < 0.01)的含量均有所升高，表明MCD饲料成功诱导了炎症反应。结论：MCD饮食诱导下成功建立小鼠NASH模型。
Abstract: Objective: This study aimed to evaluate the feasibility of establishing a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) induced by a methionine-choline-deficient (MCD) diet through the detection of NASH-related indicators. Methods: Healthy C57BL/6 mice were randomly assigned to either a control group (fed a standard diet, n = 6) or a model group (fed an MCD diet, n = 6) using a stratified randomization method. At the end of the 6-week period, the mice were euthanized. Liver tissues were collected, weighed, and examined for morphological changes. Body weight and liver weight were compared between the two groups. Liver tissues were processed for hematoxylin-eosin (HE) staining to evaluate histopathological alterations, Oil Red O staining to visualize lipid accumulation, and Masson staining to assess the extent of fibrosis. Additionally, the expression levels of inflammatory cytokines (TNF-α and IL-6) in liver tissues were quantified using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the degree of inflammation. Results: Compared to the control group, the liver tissues of the model group mice appeared dull and yellowish-brown in color, with a rough, fragile texture and reduced elasticity. The body weight of the model group mice was significantly lower (P < 0.0001), indicating that the MCD diet affected the metabolic state of the mice. Histopathological examination using HE staining revealed hepatic steatosis and inflammatory cell infiltration in the liver tissues of the model group, demonstrating that the MCD diet successfully induced steatosis and hepatocyte injury. Oil Red O staining showed the presence of numerous red lipid droplets in the liver tissues of the model group, along with increased intracellular triglyceride (TG) content, indicating that the MCD diet effectively simulated lipid accumulation in hepatocytes. Masson staining revealed extensive blue-stained collagen fibers in the liver tissues of the model group, suggesting that the MCD diet successfully induced mild fibrosis. Furthermore, the levels of TNF-α (P < 0.001) and IL-6 (P < 0.01) in the liver tissues of the model group were significantly elevated, confirming that the MCD diet successfully triggered an inflammatory response. Conclusion: The NASH mouse model was successfully established through MCD diet induction.
1. 引言
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种由非酒精性因素(如代谢异常)引发的肝脏脂质蓄积综合征，主要与遗传易感性和胰岛素抵抗相关[1]。全球患病率达25% (中国约15%) [2]。NAFLD是一种广谱疾病，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是NAFLD的一种严重形式。与单纯性肝脂肪变性相比，NASH的核心特征在于肝细胞的气球样变和炎症反应，这使其具有较高的肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)进展风险。其特征为脂肪变性、肝细胞损伤、氧化应激及纤维化[3]，累及全球3%~5%人口，常伴代谢共病，约40%患者进展为肝硬化或肝癌，且发病率持续上升加剧疾病负担[4]-[6]。由于病因复杂、代谢紊乱–炎症–纤维化级联反应类机制交织，现代医学尚未发现直接靶向治疗药物，NASH已成为全球最常见慢性肝病[7]。
实验动物模型的建立是评价新药药效的重要手段。研究NASH发病机制高度依赖动物模型，以克服人体研究的伦理和复杂性限制，通过饲喂小鼠蛋氨酸–胆碱缺乏(Methionine-Choline-Deficient, MCD)饲料建立NASH动物模型能高效复现人类NASH核心病变[8]。胆碱和蛋氨酸是肝脏脂质转运和甲基供体的关键物质，其缺乏直接导致脂质输出障碍和线粒体功能损伤[9] [10]。本研究以MCD饮食诱导构建及评价小鼠模型，为NASH病理机制的研究和临床治疗提供动物模型参考。
2. 材料与方法
2.1. 主要试剂与仪器
肿瘤坏死因子-α (TNF-α) ELISA试剂盒(SYP-M0036)和白细胞介素-6 (IL-6) ELISA试剂盒(SYP-M0031)购自杭州臻优品生物科技有限公司，苏木精-伊红染试剂盒、油红O染液和MASSON三色染色液(G1006)由赛维尔生物科技有限公司提供。
分体式组织包埋机(EG1150H，中国)，冷冻切片机(CRYOSTAR NX50，中国)，全自动染色机(Leica AUTO STAINER XL4，中国)，封闭式全自动组织脱水机(APS200S，中国)。
2.2. 动物
使用12只6~8周龄、体重18~20 g的雄性C57BL/6小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[SCXK (京) 2024-0001]；实验期间所有小鼠均饲养于包头医学院实验动物房[SYXK (蒙) 2024-0001]，饲养条件为24℃ ± 2℃、50%~70%湿度和12 h光/暗循环；实验前小鼠均进行为期1周的适应性喂养；采用SPF级小鼠MCD模型饲料，由北京小黍有泰生物科技有限公司提供[SCXK (京) 2023-0010]。本实验所有动物研究均经包头医学院动物伦理审查委员会批准(审批号：[2023] 40)。
2.3. 动物分组及模型建立
将小鼠随机分为以下两组：对照组(n = 6)，整个实验周期允许自由进食普通饲料和饮水；模型组(n = 6)，适应性喂养期间第1~2、3~4、5~7天分别采用MCD与普通饲料1:2、1:1、2:1的比例进行喂养，随后6周实验期间内模型组允许自由进食MCD饲料和饮水。
2.4. 组织样本采集
在实验期结束时，将小鼠禁食12 h，腹腔注射苯巴比妥钠(33 mg/kg)麻醉并处死。剪开胸腔及腹腔，游离肝脏后在生理盐水中洗涤并称重，拍摄相关形态学照片，部分肝脏用4%多聚甲醛缓冲液固定进行相关染色，剩余组织放入液氮速冻后转移至−80℃保存。
2.5. 小鼠肝脏炎症因子水平检测
通过ELISA试剂盒对肝脏组织中TNF-α和IL-6的表达水平进行定量检测。检测方法按照厂家说明书进行，使用标准仪器根据产品质量标准通过标准曲线计算吸光度(OD)。
2.6. HE染色观察肝组织病理形态
将固定的肝组织清洗、包埋、冷冻成块、冷冻切片，获得约4 μm厚的冷冻肝组织薄片，将其浸入甲醇中固定10 min，依次使用苏木素染液和伊红染液(H&E)染色，分别标记细胞核和细胞质，洗片后使用光学显微镜观察组织病理学改变，并进行图像采集与分析。
2.7. 油红O染色检测肝组织脂质沉积
将肝组织用OCT包埋速冻固定后制成冰冻切片，将切片用油红O肝素溶液染色15 min，用明矾苏木精5次浸渍对细胞核进行染色。然后用蒸馏水冲洗切片后用苏木精复染1 min，水洗后滴入甘油明胶封片剂封固，在显微镜下获取图像用于分析。
2.8. Masson染色观察肝组织纤维化
将固定中的肝组织放入Weigert’s铁苏木精染色剂中10 min，冲洗后在Biebrich Scarlet-acid品红溶液中染色，流水稍洗后放入磷钨酸–磷钼酸溶液处理5 min，取出参照Masson染色试剂盒制造商指导行Masson染色，洗片，封固，于生物显微镜下观察各组肝组织胶原纤维生成沉积情况，拍摄保存。
2.9. 统计分析
使用双尾Student t检验对两组进行平均值比较，以P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.01被认为是高度统计学显著差异。所有数据均以平均值 ± 标准差(SD)表示，n表示每组的样本量。通过GraphPad Prism 9.0产生相应的图。
3. 结果
3.1. MCD诱导对肝脏形态学的影响
整个实验周期中对照组和模型组小鼠均正常存活，无死亡现象。对照组小鼠生活状态良好且毛发柔顺有光泽，MCD模型组小鼠毛发油腻且杂乱，精神萎靡。肝脏外观形态结果显示，对照组小鼠的肝组织色泽红润，质地软而光滑且富有弹性；MCD模型组小鼠肝组织表面暗淡无光，呈黄褐色，体积明显缩小，质地粗糙易碎且弹性差，偶见淤血及米粒大小的结节(见图1)，表明MCD诱导导致肝组织功能受损。
Figure 1. Effect of MCD induction on liver morphology
图1. MCD诱导对肝组织形态学的影响
3.2. MCD诱导对体重和肝脏指数的影响
蛋氨酸胆碱缺乏饲料喂养6周后小鼠体重变化由图2可以看出，体重较对照组显著减轻，差异具有统计学意义(P < 0.0001)。肝脏指数是以肝湿重/体重 × 100%计算的，是NAFLD研究中的一个重要指标。如图所示，MCD模型组较对照组显著升高(P < 0.0001)，表明MCD诱导对小鼠的代谢状态产生了影响。
3.3. MCD诱导对肝脏炎症因子的影响
ELISA试剂盒结果见图3，模型组小鼠肝组织内促炎细胞因子TNF-α与IL-6的表达水平较对照组呈现统计学差异(TNF-α: (P < 0.001); IL-6: (P < 0.01))，该定量分析结果符合炎症模型建立的关键生物标志物变化特征，证实疾病模型构建成功。
Figure 2. Effects of MCD induction on body weight and liver index
图2. MCD诱导对体重和肝脏指数的影响
(注：**表示P < 0.01，***表示P < 0.001)
Figure 3. Effects of MCD induction on liver inflammatory factors
图3. MCD诱导对肝脏炎症因子的影响
3.4. MCD诱导对肝组织改变的影响
HE染色结果显示(见图4上)，对照组中，在光学显微镜下通过HE染色使肝组织均匀着色。肝细胞的结构清晰可见，肝小叶结构完整，中央静脉周围肝细胞呈规律性放射状排列，核质透亮、大而圆，由完整的核膜界定，核仁清晰可见。模型组呈现肝索结构排列失序、肝小叶空间构象解离等组织架构异常。显微观察可见肝细胞体积异常增大伴气球样变性，胞浆内可见多发性脂质空泡，符合脂肪变性病理特征。炎性浸润局部区域核密度显著增高(核/质比异常细胞聚集)，大量聚集的炎性细胞浸润，并表现为斑点状坏死。
油红O染色显示(见图4中)，对照组小鼠肝脏组织细胞核清晰，大部分呈现蓝紫色，少见脂滴。而模型组小鼠肝细胞结构变形，出现脂肪变性，呈现大量脂肪滴，色泽鲜红，形状不一，脂滴数量及面积明显多于对照组。
如图4下所示，对照组小鼠的肝脏组织Masson三色染色特征显示，胶原纤维沉积局限于汇管区，呈局灶性分布且未形成连续性纤维束。而模型组小鼠肝组织中汇管区分布有大量蓝染胶原纤维成放射状纤维间隔向肝小叶延伸，明显的纤维化病变，结缔组织增生，形成纤维间隔，肝小叶纤维化、中央静脉周围纤维化和瘀痕形成。以上结果均提示造模成功。
(注：黑色圆圈：炎性浸润；红色箭头：脂肪空泡；蓝色箭头：球囊变化。)
Figure 4. Effect of MCD induction on liver tissue changes
图4. MCD诱导对肝组织改变的影响
4. 讨论
合适的动物疾病模型对药物研发具有关键作用。由于不同诱导方法所建立的疾病模型，其各项生理病理指标可能存在显著差异，因此筛选出成熟稳定、能精准反映疾病特征的模型体系，不仅是科学评估药物疗效的基础前提，更能为深入解析药物作用机制提供可靠的数据支撑。
NASH是NAFLD的一种炎症亚型，NASH的发病机制从“二次打击”理论[11]发展为“多重打击”学说[12]：“第一击”为肝脏脂质沉积与胰岛素抵抗，引发脂肪变性；“第二击”涉及氧化应激、脂质过氧化应激及TNF-α、IL-6等促炎因子过量产生，进而导致炎症，并最终引发纤维化，肝纤维化的严重程度也是评估NASH病情进展和预后的关键指标[13]。NASH涉及的病因和病理机制复杂，虽然已有大量的研究，但目前除了运动和保持健康的生活习惯外，还没有国家药品监督管理局批准的针对性预防及治疗的药物和方法[14]。NASH是以脂肪变性、肝细胞损伤(气球样变)、炎症和纤维化为特征。本研究通过MCD饲料成功在C57BL/6小鼠中诱导出典型的NASH表型，包括肝脂肪变性、炎症细胞浸润、促炎因子升高及早期纤维化形成，证实该模型在重现NASH核心组织学特征方面具有较高的可行性。
慢性低度炎症是NASH等代谢性疾病的重要特征。促炎细胞因子水平升高在NASH进展中诱导胰岛素抵抗(IR)。核因子κ-B (NF-κB)是炎症通路中的关键因子，能刺激各种促炎细胞因子的表达[15]。炎性囊泡活化加重IR，从而促进NASH和纤维化的进展[16]。同时肝脏中巨噬细胞积聚并过量产生促炎细胞因子，不仅诱导肝脏炎症，其产生的TNF-α、IL-6等还会加重胰岛素抵抗和代谢失调，进一步推动NASH进展。本实验使用ELISA试剂盒测定肝组织的炎症情况，结果显示肝组织中TNF-α和IL-6的表达量明显升高提示NF-κB等促炎通路被激活，这与熊静平[17]等人的研究结果一致。此外，模型组中观察到的肝索结构紊乱、炎症细胞浸润及胶原纤维沉积，进一步说明MCD饲料能在较短时间内引发从单纯脂肪变向脂肪性肝炎及早期纤维化的病理演进，为研究NASH的“多重打击”机制提供了可控且高效的实验平台。
蛋氨酸作为合成载脂蛋白的必需氨基酸，饮食MCD可减少低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的合成及降低线粒体β氧化酶的活性，造成三酰甘油在肝内蓄积[18]，形成脂肪肝从而引起“第一次打击”；胆碱缺乏可致机体卵磷脂合成不足，并引起肝脏线粒体内部活性氧增加[19]，导致氧化应激增加及脂质过氧化反应，最后造成对肝脏的“第二次打击”。尽管MCD模型在诱导NASH组织学特征方面表现出色，但其与人类NASH在代谢表型上存在本质差异。本研究中，模型组小鼠出现体重显著下降、肝体比上升，这与人类NASH患者多伴有肥胖、胰岛素抵抗等代谢综合征特征形成鲜明对比。MCD模型主要通过直接抑制肝脏脂质输出和诱发氧化应激发挥作用，而非基于能量过剩和胰岛素抵抗，因此该模型在模拟NASH代谢病因方面存在明显不足。此外，MCD诱导的纤维化程度通常较轻且较少进展至桥接纤维化或肝硬化，限制了其在研究晚期肝纤维化或抗纤维化药物评价中的应用。因此，MCD模型更适用于研究NASH在肝脏局部的核心病理环节——如脂毒性、氧化应激、炎症应答及早期纤维化启动机制，以及在短期内筛选具有抗炎、抗脂变或轻度抗纤维化潜能的化合物。然而，在探讨NASH与全身代谢紊乱相互作用、或评估针对胰岛素抵抗及肥胖相关通路的治疗策略时，高脂饮食或胆碱缺乏氨基酸诱导的肥胖相关模型可能更具临床相关性。
基于MCD模型的特点，未来可在以下三个方面进一步拓展其科学价值：首先，利用该模型研究肝脏内质网应激、线粒体功能紊乱和细胞死亡途径在NASH进展中的具体作用机制；其次，结合转录组或蛋白质组学技术，筛选在MCD诱导早期即发生动态变化的关键分子，作为潜在的治疗靶点或生物标志物；最后，将MCD模型与其他代谢模型(如结合高脂饲料)进行阶段性或复合式干预，以期构建更接近人类NASH代谢背景的动物模型，系统解析营养、脂代谢与炎症—纤维化网络的交互作用。
总体而言，MCD饲料诱导的NASH小鼠模型虽不能完全模拟人类NASH的代谢背景，但其在重现肝脏核心病理改变方面具有显著优势，仍是NASH机制研究与早期药物筛选中有价值的实验工具。明确其适用范围与局限性，将有助于更科学、合理地利用该模型，推动NASH研究向更深层次发展。因此成功建立一个稳定可靠的动物模型，对研究NASH的发病机制具有重要意义。
基金项目
内蒙古自治区自然科学基金(2023LHMS08044)；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划资助(NJYT24080)。
NOTES
*通讯作者。