1. 引言
中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)，俗称河蟹，经济附加值高，产值巨大，2024年产量约88.8万吨，是我国重要的甲壳类水产经济动物之一。近年来，随着养殖规模的不断扩大，养殖动物受到水环境、饲料及养殖管理等条件变化因素影响，导致疾病频发甚至大量死亡。然而，过量使用抗生素、化学药品和水体消毒剂，会带来养殖环境的恶化，致使养殖动物应激因素增多，对生态环境和产业发展造成一定危害。因此，探寻可以替代药物的免疫添加剂成为了亟待研究的方向，研制水产免疫添加剂，增强水产生物的抗应激能力，对水产养殖产业绿色可持续发展具有极其重要的意义。
免疫添加剂是指一类能引起机体出现短暂免疫功能增强的物质，主要包括维生素、微量元素、寡糖类、核苷酸、中草药等。其中，中草药添加剂具有安全性高、功效多样、不易产生耐药性等特点，有很大的发展潜力[1]。甘草酸(Glycyrrhizic acid, GA)是甘草的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗病毒作用和抑菌作用等药理作用，在临床治疗中广泛应用[2] [3]。研究发现，甘草酸可以有效的提高动物对疾病的抵抗力。例如，在猪饲料中添加适量甘草酸能够有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(全称，PRRSV) [4]、猪急性腹泻综合症冠状病毒(全称，SADS-CoV)等病毒感染[5]。摄食甘草酸能够增强鸡巨噬细胞吞噬和清除细胞内沙门氏菌的能力，减少鸡的疾病发生率[6] [7]。此外也有研究表明甘草酸有益于生物肠道健康。甘草多糖可有效增加哺乳仔猪小肠绒毛高度和绒隐比[8]；在小鼠中甘草通过修复肠黏膜屏障损伤，治疗溃疡性结肠炎[9]。现阶段，在水产动物中，甘草酸也具有类似的功能。据报道，甘草酸能显著提高五条鰤(Seriola quinqueradiata)对链状球菌(Enterococcus seriola)感染的抵抗能力[10]。饲料中添加甘草酸可显著提高大黄鱼和泥鳅幼鱼的存活和生长性能，并显著上调仔鱼的生长、发育、营养运输、免疫和抗氧化系统相关基因的表达[11] [12]。
目前已有研究证明，甘草酸对甲壳动物免疫性能有改善作用。在饲料中添加甘草酸可预防凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)白斑综合征，显著降低死亡率、减少病变[13]，显著提高小龙虾的生长性能、免疫应答、免疫相关基因表达和抗病力[14]。然而，甘草酸对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用，目前尚未有系统研究报道。为此，本研究通过在其养殖水体或饲料中设置不同浓度梯度的甘草酸，通过检测50天后血淋巴和肝胰腺中五种免疫相关酶活性、免疫相关基因表达水平以及肠道结构和功能组织变化，探究甘草酸对中华绒螯蟹抗应激能力的影响，以期为甘草酸在中华绒螯蟹养殖中的应用提供科学参考。
2. 材料与方法
2.1. 材料
实验用中华绒螯蟹购买于中国江苏省连云港市某水产养殖场。选取湿重为20.0 ± 5 g、甲壳完整无破损、步足无断肢和残缺、生理状态健康的个体在充分曝气的自来水中暂养5 d。暂养期间每天投喂专用饲料两次，控制养殖水体保持温度25.0 ± 1.0℃、pH 6.5~8.5、溶氧(DO) 5~8 mg/L，以保证试验用蟹充分适应实验环境。
2.2. 方法
2.2.1. 中华绒螯蟹养殖管理及实验饲料配置
将150只健康的中华绒螯蟹随机分为五组(对照组、浸泡组、GA0.1、GA0.5、GA1)，分别饲养于5个水箱内。向浸泡组的养殖水体中加入甘草酸(Catalysis，西班牙) (养殖水体积：GA = 1000:1)充分混匀。三组饲料添加组(GA0.1, GA0.5, GA1)分别投喂添加了0.1、0.5和1 mL/kg的甘草酸的饲料，对照组和浸泡组投喂无添加的基础饲料。每天分两次投喂蟹体重5%的饲料，上午9:00投喂每日总投喂量的30%，下午17:00投喂每日总投喂量的70%。每隔2天换一次水。实验周期为50 d。
Table 1. Experimental feed formula and nutrient composition (dry weight)
表1. 试验饲料配方及营养成分
组成配方formula/% |
营养水平nutrient composition/% |
鱼粉 |
35.00 |
粗蛋白 |
44.8172 |
豆粕 |
25.00 |
天然脂质 |
7.8121 |
花生粕 |
16.00 |
|
|
玉米淀粉 |
5.70 |
|
|
豆油 |
4.00 |
|
|
酵母 |
5.00 |
|
|
纤维素 |
4.69 |
|
|
胆固醇 |
0.3 |
|
|
氯化胆碱 |
0.2 |
|
|
乙硫巴酸盐 |
0.01 |
|
|
维生素混合物a |
2.00 |
|
|
矿物质混合物b |
2.00 |
|
|
丙酸钙 |
0.10 |
|
|
实验饲料的蛋白源主要为鱼粉、豆粕，脂肪源主要为豆油，粗蛋白含量约为45%，粗脂肪含量约为6%。试验饲料配方及营养成分见表1。
1) 维生素混合物(mg/100 g混合物)：维生素A 420000 IU，维生素C 6000 mg，α-生育酚醋酸酯2000 mg，维生素D3 120000 IU，维生素K 1000 mg，维生素B1 1000 mg，维生素B2 1000 mg，维生素B6 1600 mg，维生素B12 2 mg，烟酸5000 mg，叶酸400 mg，肌醇6000 mg，生物素10 mg，泛酸钙3500 mg。
2) 矿物混合物组成(g/kg日粮)：KCl 0.84 g、MgSO4·7H2O 3 g、NaH2PO4 6.45 g、KH2PO3 3 g、Ca(H2PO4)2·H2O 7.95 g、CaCO3 3.15 g、C6H10CaO6·5H2O 4.95 g、FeC6H5O7·5H2O 0.36 g、CuSO4·5H2O 0.1055 g、ZnSO4·7H2O 0.1428 g、MnSO4·H2O 0.0321 g、AlCl3·6H2O 0.0045 g、CoCl2·6H2O 0.042 g、KI 0.0069 g。
2.2.2. 存活率和增重率统计
饲养试验结束后，将实验中华绒螯蟹禁食24 h，在冰中压缩10 min诱导低温麻醉，用纱布拭去体表水分，测量5组中华绒螯蟹体重，统计每组中华绒螯蟹存活数量，计算存活率(SR)和增重率(WG)。增重率 = 100 × [(末重 − 初重)/初重]。存活率 = 100 × (最终蟹数/初始蟹数)。
2.2.3. 样品收集
为了评估血淋巴和肝胰腺的抗氧化能力和非特异性免疫指标，每组随机选取3只中华绒螯蟹采集血淋巴和肝胰腺。使用1 ml无菌注射器吸取少量抗凝剂润湿内壁，从中华绒螯蟹的头胸甲与第3步足交界处薄膜插入约1~2 mm，将血淋巴与预冷的抗凝血溶液(9 g葡萄糖，2.73 g柠檬酸，13.14 g NaCl，4.41 g柠檬酸三钠，1.681 g EDTA·2Na) 1:1混合，置于1.5 mL无菌离心管中。立即离心15 min (800 g 4℃)，收集上清液储存在−80℃冰箱中。分组采集适量肝胰腺保存于冻存管中，置液氮速冻后暂存于−80℃冰箱保存，做RNA提取和分析用。每只再取0.3 g肝胰腺，按组织重量：0.9%生理盐水 = 1:9的比例混合，在冰水浴条件下机械匀浆，并以2500 r/min离心10 min，取上清液置于1.5 mL离心管中，储存于−80℃，用于测定ACP、MDA、GPT、GOT等酶的活性。另外，用镊子取中肠，清除内容物后用4%多聚甲醛固定，常温保存，用于送检研究中华绒螯蟹肠道结构和功能。
2.2.4. 酶活性检测
使用相应的商品化检测试剂盒(中国南京建成)对各组中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺样品中的酸性磷酸酶(ACP)、丙二醛(MDA)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)进行酶活性测定。比色后，查标准曲线，求得酶的活力单位。
(1) 酸性磷酸酶试剂盒采用微量酶标法测定，将肝胰腺匀浆上清和血清分别与显色底物混合，在37℃下孵育20 min，加入终止液后，通过精密酶标仪在405 nm处记录吸光度；
(2) 丙二醛试剂盒采用TBA法测定，将肝胰腺匀浆上清和血清分别与显色底物混合，95℃孵育40 min，然后3500~4000 r/min，离心10 min，取上清液，用精密酶标仪在532 nm处记录吸光度；
(3) 谷丙转氨酶试剂盒采用微板法测定，将肝胰腺匀浆上清和血清分别与显色底物混合，在37℃下孵育30分钟，加入终止液37℃孵育20分钟后，通过精密酶标仪在505 nm处记录吸光度；
(4) 谷草转氨酶试剂盒采用微板法测定，将肝胰腺匀浆上清和血清分别与显色底物混合，在37℃下孵育30分钟，加入终止液37℃孵育20分钟后，通过精密酶标仪在510 nm处记录吸光度。
2.2.5. RNA提取和cDNA合成
使用TRIzol试剂从100 mg肝胰腺组织中提取总RNA，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。确认未降解后按照反转录试剂盒(TransGen Biotech公司，中国)说明书配制混合体系，使用PCR仪进行反转录，将7 μL cDNA模板与1 μL Random Primer在200 μL PCR联排管中混匀，65℃孵育5 min。孵育结束后加入10 μL 2 × TS Reaction Mix、1 μL Transcript RI/RTMix、1 μL gDNA Remover，依次设置程序25℃ 10 min，42℃ 15 min，85℃ 5 s，程序结束后保持4℃恒温。合成的cDNA产物在−20℃保存，用于qRT-PCR分析。
2.2.6. 实时荧光定量(qRT-PCR)分析
本研究所用引物序列见表2。以中华绒鳌蟹肝胰腺的cDNA为模板，按照荧光定量PCR试剂盒SYBR (全试金，中国)说明对各组中华绒鳌蟹肝胰腺组织中GPX、ALF、Crus2的mRNA表达量进行定量分析。荧光定量PCR实验在CFX96TM Real-Time System (Bio-Rad，美国)仪器上进行。实验采用10 μL体系包括：SYBR Green Premix Ex Taq 7μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，cDNA模板2 μL。配好体系充分混匀后，4℃，低速离心5分钟。反应条件为两步法扩增程序：95℃变性30秒，95℃变性5秒，60℃延伸30秒，设定上述循环40次，60℃采集荧光信号，循环结束后缓慢升温到95℃。使用稀释10×的cDNA模板进行qRT-PCR实验，每个样品进行三次平行实验。以使用无添加基础饲料喂养的中华绒螯蟹肝胰腺表达的EsGPX、EsALF、EsCrus2基因Ct值作为对照，采用的2−∆∆Ct方法来计算基因的相对表达量[15]。
Table 2. The sequences of primers used in this study
表2. 本研究使用的引物
引物Primer |
序列Sequence (5’-3’) |
GPX-F |
GACTACACCCCAGTGTGCACCA |
GPX-R |
TGATCCAGCCATTGTGATCCTC |
ALF-1 qF |
GACGCAGGAGGATGCTAAC |
ALF-1 qR |
TGATGGCAGATGAAGGACAC |
Crus-2 qF |
GCCCACCTCCCAAACCTAT |
Crus-2 qR |
GCAAGCGTCACAGCAGCACT |
2.2.7. 肠道组织化学分析
取饲喂实验后的中华绒螯蟹中肠组织，经4%多聚甲醛固定，固定状态良好。送武汉赛维尔生物科技有限公司进行分析处理。经脱水、包埋、切片、染色、封片最后镜检合格的样片。使用具有拍照功能的显微镜Eclipse Ci-L (Nikon, Japan)记录样片中典型画面，使用图片观察和分析软件Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybemetics, U.S.A)对采集到的图片进行详细分析。通过显微镜浏览切片或浏览数字切片，使用不同放大倍数的视野仔细观察组织切片情况，对切片中基本病理改变情况进行文字描述。对典型病变部位成像并在图中用箭头标识。
2.2.8. 统计分析方法
本研究的数据以均数 ± 标准差表示。采用Graphpad Prism 9进行图形绘制。所有数据采用SPSS (IBM SPSS Statistics 26)软件进行了方差齐性检验和方差分析，并进行了Duncan’s多重比较，其中P < 0.05代表具有显著差异。
3. 结果与分析
3.1. GA对中华绒螯蟹生长免疫的影响
GA对中华绒螯蟹的存活率与增重率的影响见表3。与对照组相比，3个GA饲料添加组(GA0.1, GA0.5, GA1)和浸泡组的增重率和存活率均显著增加(P < 0.05)，浸泡组的增重率显著高于其他组，达到对照组的2倍。但与浸泡组相比，GA0.5和GA1饲料添加组的存活率更高，且水质更清澈。
Table 3. Effects of GA on survival rate and weight gain rate of Eriocheir sinensis
表3. 甘草酸对中华绒螯蟹存活率的影响
组别Group |
增重weight gain rate/% |
存活率Survival rate/% |
对照组 |
5.60 ± 3.35b |
46.67 |
浸泡组 |
11.70 ± 3.32a |
53.33 |
GA0.1 |
8.38 ± 2.57b |
56.67 |
GA0.5 |
8.20 ± 3.21b |
73.33 |
GA1 |
7.46 ± 2.08b |
76.67 |
GA0.1：GA浓度为0.1 mL/kg，GA0.5：GA浓度为0.5 mL/kg，GA1：GA浓度为1 mL/kg。同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P < 0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P > 0.05)，
3.2. GA对中华绒螯蟹部分非特异性免疫指标的影响
3.2.1. 中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺中ACP活力水平变化
从图1可见，与对照组相比，饲料中加0.5 mL/kg GA喂养的中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺中ACP活力水平均显著升高(P < 0.05)，而其他浓度无显著变化甚至降低。
A——中华绒螯蟹血淋巴中ACP活力水平。B——中华绒螯蟹肝胰腺中ACP活力水平。
Figure 1. Variations in ACP activity in hemolymph and hepatopancreas of Eriocheir sinensis following 50-day dietary exposure to graded levels of GA
图1. 添加不同浓度GA饲养50 d后中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺ACP活力变化
3.2.2. 中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺中MDA含量变化
从图2可见，与对照组相比，在4组使用添加了不同浓度GA饲料喂养的中华绒螯蟹体内，血淋巴和肝胰腺中MDA的含量均显著降低(P < 0.05)，其中添加0.5 Ml/kg GA组的MDA含量最低(P < 0.05)。
A——中华绒螯蟹血淋巴中MDA含量。B——中华绒螯蟹肝胰腺中MDA含量。
Figure 2. Alterations in hemolymph and hepatopancreatic malondialdehyde (MDA) levels in Eriocheir sinensis after 50-day GA administration at graded concentrations
图2. 添加不同浓度GA饲养50 d后中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺中MDA含量变化
3.2.3. 中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺中GPT和GOT活力水平变化
A——中华绒螯蟹血淋巴中GOT活力水平。B——中华绒螯蟹肝胰腺中GOT活力水平。C——中华绒螯蟹血淋巴中GPT活力水平。D——中华绒螯蟹肝胰腺中GPT活力水平。
Figure 3. Changes of GOT and GPT activities in hemolymph and hepatopancreas of Eriocheir sinensis after feeding with different concentrations of GA for 50 days
图3. 添加不同浓度GA饲养50 d后中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺GOT和GPT活力变化
从图3可见，与对照组相比，在中华绒螯蟹血淋巴中0.5 mL/kg GA和1 mL/kg GA饲料添加组GOT活力水平显著降低(P < 0.05)，浸泡组与0.1 mL/kg GA添加组GOT活力水平无显著性差异；而在中华绒螯蟹肝胰腺中，4个GA添加组的GOT活性均显著低于对照组(P < 0.05)，其中在饲料中添加0.5 mL/kg GA和1 mL/kg GA对GOT活性影响效果比浸泡和添加0.1 mL/kg GA影响显著(P < 0.05)。
从图3可见，与对照组相比，在4组使用添加了不同浓度GA饲料喂养的中华绒螯蟹体内，血淋巴和肝胰腺中GPT的活力水平均显著降低(P < 0.05)，而GA的浓度对GPT活性影响无显著差异。
3.2.4. 中华绒螯蟹肝胰腺中SOD活力水平变化
从图4可见，与对照组相比，在饲料中添加0.5 mL/kg GA的中华绒螯蟹肝胰腺中SOD活力水平显著提高(P < 0.05)，而其他浓度实验组无显著差异甚至显著降低。
Figure 4. Alterations in hemolymph and hepatopancreatic superoxide dismutase (SOD) activity in Eriocheir sinensis after 50-day GA administration at graded concentrations
图4. 添加不同浓度GA饲养50 d后中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺SOD活力变化
3.3. GA对中华绒螯蟹肠道结构的影响
中华绒螯蟹皱壁厚度和黏膜层厚度由图5、表4和表5可知，与对照组相比，4个不同浓度GA添加组的皱壁厚度和黏膜层厚度均显著增厚。
Figure 5. Wrinkle wall thickness and mucosal thickness of Eriocheir sinensis
图5. 中华绒螯蟹皱壁厚度和黏膜层厚度
Table 4. Wrinkle wall thickness of Eriocheir sinensis
表4. 中华绒螯蟹皱壁厚度
Name |
皱壁厚度Wrinkle wall thickness/mm |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均值 |
对照组 |
0.130687 |
0.234978 |
0.187995 |
0.24129 |
0.276711 |
0.214332 |
实验组 |
0.244074 |
0.303755 |
0.213392 |
0.251968 |
0.225585 |
0.247755 |
Table 5. Mucosal thickness of Eriocheir sinensis
表5. 中华绒螯蟹黏膜层厚度
Name |
黏膜层厚度Mucosal thickness/mm |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均值 |
肠1 100-1 |
0.166938 |
0.292097 |
0.217162 |
0.27968 |
0.387695 |
0.268714 |
肠15 100 |
0.281524 |
0.267821 |
0.317373 |
0.423486 |
0.304192 |
0.318879 |
3.4. GA对中华绒螯蟹免疫相关基因表达的影响
A——EsGPX相对表达水平。B——EsCrus2相对表达水平。C——EsALF1相对表达水平。
Figure 6. Relative mRNA expression levels of immune-related genes in the hepatopancreas of Eriocheir sinensis following 50-day dietary supplementation with graded levels of GA
图6. 饲喂不同浓度GA 50天后中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因mRNA的相对表达水平
中华绒螯蟹肝胰腺中免疫相关基因在的表达情况如图6所示。与对照组相比，在饲料中分别添加0.1 mL/kg和0.5 mL/kg GA的中华绒螯蟹肝胰腺中EsGPX、EsALF1、EsCrus2的mRNA表达量显著升高(P < 0.05)。而在添加1 mL/kg GA时显著降低(P < 0.05)。
4. 讨论
4.1. GA对中华绒螯蟹生长免疫的影响
中草药添加剂可以间接或直接促进甲壳动物的生长，提高存活率和饲料利用效率[16]。本研究结果显示，草药提取物甘草酸GA作为饲料添加剂在饲料中混合投喂，浓度合适时(0.5 mL/kg)可以提高中华绒螯蟹的增重率和存活率，但这一现象背后的原理机制并不十分清晰。同样在其他水产动物中，有研究表明在饲料中添加甘草酸投喂刺参可以提高其生长速率并降低灿烂弧菌感染后导致的死亡率[17]，L. Ocampo等人研究发现投喂甘草酸制剂的对虾在WSSV攻毒后存活率显著提高[18]，饲料中添加1.1%海带–甘草酸复方剂能促进异育银鲫对营养物质的消化吸收，一定程度提高增重率[19]。由此推测甘草酸可能通过抑制病原微生物感染或降低氧化应激来间接提高甲壳动物存活率，并通过提高消化酶的活力，促进营养物质的消化吸收和合成代谢，提高增重率。
4.2. GA对中华绒螯蟹部分非特异性免疫指标的影响
酸性磷酸酶(ACP)是巨噬细胞溶酶体的标志酶，也是无脊椎动物吞噬溶酶体酶的重要组成部分，与物质代谢密切相关，可被外源物质诱导，在免疫反应中发挥重要作用。本研究结果显示，在饲料中添加0.5 mL/kg GA，中华绒鳌蟹血淋巴和肝胰腺中ACP活性显著增强。与本研究结果类似，Chen等人发现饲料中添加GA能增强刺参中ACP的活性[17]，Liu F.等人的研究结果中指出，投喂添加50、75、100和150 mg/kg GA的饲料的克氏原螯虾血细胞和肝胰腺中ACP活性均显著提高[14]。
丙二醛(MDA)是一种高活性代谢产物，可与蛋白质、DNA和脂质等生物分子形成共价加合物，导致细胞功能障碍和损伤。因此MDA含量可以反映机体脂质过氧化速率和强度，也能间接反映组织过氧化损伤程度。在本研究中，饲料中添加GA显著降低了中华绒鳌蟹血淋巴和肝胰腺中的MDA含量。这与在建鲤[20]和克氏原螯虾[14]的研究中的结果相似。
谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)是动物体内重要的氨基转移酶，主要分布于线粒体，在蛋白质代谢中发挥关键作用。当肝脏受到损伤时，GPT和GOT会释放到血液中，因此GOT和GPT活性可用于评估肝脏功能和疾病。本研究结果表明，饲料中添加GA可以显著降低中华绒鳌蟹血淋巴和肝胰腺GPT和GOT活性。同样，在五条鰤中甘草酸能够降低血清中GOT和GPT活性并对鱼体肝脏状况有改善作用[21]。然而GA对甲壳动物GOT和GPT活性的影响尚未见报道。
超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶，在细胞内广泛分布。它可以将超氧阴离子(O2−)转化为氧气(O2)和过氧化氢(H2O2)，从而保护细胞免受氧化损伤。本研究结果显示，饲料中添加GA可以显著提高中华绒鳌蟹血淋巴和肝胰腺SOD活性。在对虾研究中亦观察到类似规律：饲料中添加150~200 mg/kg甘草酸能显著提升凡纳滨对虾SOD活性，且呈现剂量依赖性增强效应[22]。这一发现与克氏原螯虾研究结果相印证——添加75~100 mg/kg GA能使克氏原螯虾体内SOD活性显著升高[14]，饲喂200 mg GA的鲢鱼SOD活性也显著升高[23]。而值得注意的是，当GA添加浓度过高时反而会对SOD活性产生抑制，在海带–甘草酸复方剂对异育银鲫的研究中也是如此[19]。这种添加低浓度GA有增强抗氧化作用，过高浓度产生抑制的现象有待进一步探究。
以上结果表明，在饲料中添加适量的GA可提高中华绒螯蟹机体的部分非特异性免疫酶活，从而增强机体的防御能力和免疫功能，减少养殖中病害的发生。
4.3. GA对中华绒螯蟹肠道结构的影响
肠道组织对于甲壳动物的免疫防御功能意义重大，其中皱襞高度和皱襞宽度是肠面积变化的特征，皱襞高度的增加即肠道面积的增加，意味着消化吸收能力增强[24]。而肠粘膜层厚度是一种免疫能力的指标，其具有选择性渗透吸收营养物质和防御肠道内微生物及致炎因子入侵等屏障功能。有研究表明，添加饲料添加剂(黄芪多糖、枸杞多糖、黄柏提取物等)能够增加仿刺参的肠粘膜层厚度[25]。并且在中华绒螯蟹中，甘露寡糖已被证明能够显著增加肠道褶皱的高度[26]。在本研究中发现，投喂GA后中华绒螯蟹肠道皱壁厚度和黏膜层厚度均出现显著增厚。同样有研究发现GA对肿瘤小鼠肠道黏膜具有修复作用[27]，能够减弱脱氧雪腐镰刀菌醇对仔猪肠道的伤害[28]，但甘草酸对甲壳动物肠道结构的作用研究尚少。分析其机制，GA可能促进中华绒螯蟹肠道上皮黏液细胞的增殖，同时改善肠道内PH为酶发挥活性提供了条件，进而增强消化吸收能力和抗肠道感染能力。
4.4. GA对中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因mRNA表达水平的影响
GPX基因编码的是谷胱甘肽过氧化物酶，能够清除细胞内的过氧化氢等有害物质，保护细胞免受氧化损伤。抗菌肽(AMPs)是一类广泛存在于生物体、具有广谱抗微生物活性的小分子多肽。抗脂多糖因子 (ALF-1)和Crustin-2是甲壳动物抗菌肽的关键成员，构成其免疫防御系统的重要组成部分。而中草药添加剂(如黄芪多糖)可以显著提高南美白对虾[29]和中华绒螯蟹[30]血淋巴和肝胰腺中ALF-1的表达水平。本研究发现添加了GA的中华绒螯蟹肝胰腺中GPX、ALF-1、Crustin-2的mRNA表达量显著升高，且随着浓度的增加在一定范围内呈上升趋势。已有研究证明GA能够恢复烧伤导致的抗菌肽减少，防止伤口感染[31]。然而GA添加量为1 mL/kg时三个基因mRAN表达量下降到和对照组没有差异的水平，暂未得到解释。GA适量添加能够通过提高GPX和过氧化氢酶的活性来调节细胞内抗氧化系统，增强机体免疫防御[32]。但具体的作用机制尚不明晰，有待进一步研究。
5. 结论
在饲料中添加或浸泡一定浓度的甘草酸能够显著提高中华绒螯蟹存活率和增重率，降低体内丙二醛(MDA)含量，抑制谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)酶活性水平，增强免疫相关基因GPX、ALF-1、Crustin-2表达水平。其中添加0.5 mL/kg GA饲料投喂中华绒螯蟹体内免疫指标变化最为显著，并且酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性水平较其他组显著升高。研究表明在饲料中添加适量浓度甘草酸能够可有效改善中华绒螯蟹的部分非特异性免疫指标并提高组织中免疫相关基因的相对表达量，增强中华绒螯蟹抗应激能力，且浓度为0.5 mL/kg时效果最佳。本研究为甘草酸作为一种饲料添加剂在甲壳动物中的应用提供了数据支撑和理论支持。
NOTES
*并列通讯作者。