摘要: 本研究通过网络药理学与分子对接技术系统研究了大黄治疗糖尿病肾病(DKD)的多靶点作用机制。采用TCMSP数据库筛选大黄16种活性成分及56个药物靶点，整合GeneCards、OMIM和Disgenet数据库获得4301个DKD相关靶基因，通过Venny分析和R语言处理确定41个大黄治疗DKD的潜在基因靶点。利用Cytoscape 3.10.3构建“药物–成分–靶点–疾病”网络，STRING数据库建立蛋白互作网络，经CytoNCA插件分析筛选出包括TNF、TP53、HSP90AA1、CASP3、BCL2、PTGS2、ESR1和MYC在内的核心靶点。分子对接验证显示大黄活性成分与HSP90AA1、BCL2、TNF等靶点具有显著结合亲和力，GO与KEGG富集分析表明其治疗机制涉及炎症反应、细胞凋亡、氧化应激和组织纤维化等多条信号通路的调控，证实了大黄通过“多成分–多靶点–多通路”协同作用治疗DKD的科学机制。这项研究为深入理解中药治疗复杂疾病的网络调控机制提供了重要的理论依据。
Abstract: This study systematically investigated the multi-target mechanism of Rheum palmatum (rhubarb) in treating diabetic kidney disease (DKD) using network pharmacology and molecular docking techniques. Sixteen active components and 56 potential drug targets of rhubarb were identified through the TCMSP database. By integrating data from GeneCards, OMIM, and DisGeNET, 4301 DKD-related target genes were collected. Venny analysis and R software processing revealed 41 key therapeutic targets. Cytoscape 3.10.3 was employed to construct a “drug-component-target-disease” interaction network, while the STRING database was used to establish a protein-protein interaction (PPI) network. Using the CytoNCA plugin, core targets, including TNF, TP53, HSP90AA1, CASP3, BCL2, PTGS2, ESR1, and MYC, were identified. Molecular docking demonstrated strong binding affinity between rhubarb’s active components and key targets (HSP90AA1, BCL2, TNF, etc.). GO and KEGG enrichment analyses indicated that the therapeutic mechanism involves the regulation of multiple pathways, such as inflammatory response, apoptosis, oxidative stress, and tissue fibrosis, confirming rhubarb’s “multi-component, multi-target, multi-pathway” synergistic effect on DKD. This research provides critical theoretical insights into the network regulation mechanisms of traditional Chinese medicine (TCM) in treating complex diseases, supporting the scientific rationale for using rhubarb in DKD therapy.
1. 引言
近年来随着生活方式改变和人口老龄化加剧，糖尿病发病率呈现显著上升趋势，已成为重大公共卫生问题。糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一，其特征性病理改变包括肾小球硬化及基底膜增厚，最终可导致终末期肾病[1]。面对这一严峻挑战，传统中药大黄(Rhei Radix et Rhizoma)因其多组分、多靶点的优势特性，为DN的防治提供了新的治疗策略。现代药理学研究表明，大黄主要含蒽醌类、二蒽酮类、苯丁酮类、鞣质类及有机酸等多种活性成分。其药理作用丰富，包括抗炎、抗氧化、抗纤维化、调节代谢等功能，可作用于多个靶器官系统[2]。
在临床应用方面，大黄在DN治疗中展现出显著疗效。本研究拟采用网络药理学结合分子对接技术，系统研究大黄活性成分与DN靶点的相互作用，为阐释其治疗DN的多靶点作用机制提供科学依据。这一研究不仅有助于深入理解中药治疗复杂疾病的作用机理，也为基于传统中药的现代药物研发提供理论支持。
2. 研究方法
2.1. 大黄的活性成分及靶点的筛选
以“大黄”为检索词，在中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)，以类药性(Drug Likeness, DL) ≥ 0.18，口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%为筛选条件，收集大黄的主要活性成分，并根据活性成分在TCMSP检索其对应靶点。将获得的靶点名全称导入Uniprot (https://www.uniprot.org/)进行查询，得到各个靶点对应简写。
2.2. DKD相关靶点收集及筛选
把“Diabetic Nephropathies”作为检索词，通过三大生物信息数据库人类基因GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)和DisGeNet数据库(https://disgenet.com/)收集DKD相关靶点。运用GeneCards数据库时，以Relevance score ≥ 1为筛选条件。然后对3个数据库的靶基因整合，去除重复值。
2.3. 药物-DKD靶基因取交集
将大黄活性成分相关靶点和DKD靶基因采用R语言和VennDiadram包取交集，获得交集靶点，作为大黄治疗DKD的潜在靶点。并在Venny网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘制Venn图。
2.4. 中药调控网络构建
将大黄、大黄活性成分、DKD、DKD靶点导进软件Cytoscape 3.10.3，构建出“药物–活性成分–疾病–靶点”的中药调控网络图，更精确地分析大黄的活性成分和确定治疗DKD的潜在靶点。
2.5. 蛋白互作网络的构建
将上述得到的大黄治疗DKD的交集基因导入STRING网站(https://cn.string-db.org/)，物种选择为“人类”，设置蛋白互作评分 ≥ 0.4，游离网络设置为隐藏，构建出蛋白互作网络图。
2.6. 核心基因的筛选
在Cytoscape 3.10.3软件中导入蛋白互作网络图，运用CytoNCA插件对靶基因结果进行打分分析。结合两次打分的结果，筛选出“BC”“CC”“DC”“EC”“LAC”分数大于中位数的基因，完成对核心基因的筛选。
2.7. GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
运用R语言clusterProfiler包对大黄活性相关靶点和DKD靶基因的交集进行GO富集分析和KEGG富集分析。设置P值(FDR) < 0.05，q值 < 0.05作为显著性阈值，选择DKD结果并且将结果进行可视化。
2.8. 分子对接对大黄活性成分与DKD靶基因结合能力的预测
通过PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载核心基因对应的小分子配体文件，并将文件格式转换为“mol2”。借助UniProt (https://www.uniprot.org/)和PDB (https://www2.rcsb.org/)获取受体蛋白的“PDB”格式，然后运用Chem3D 22.0.0和Pymol 4.60分别对两个文件分别进行优化处理。运用AutoDockTools 1.5.7和AutoDock vina 1.2.7将文件转换为“pdpqt”格式文件后，确定配体和受体的结合位点grid box的坐标和大小的确定。最后通过Pymol 4.60和网站PLIP (http://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/)对受体和小分子配体作用力的确定，并将结果进行可视化。
3. 结果
3.1. 大黄活性成分和治疗DKD潜在靶点的筛选
在TCMSP根据条件筛查选择出大黄活性成分16种，并得到大黄活性成分靶点56个。在人类基因GeneCards数据库、OMIM数据库、DisGeNet数据库查找DKD相关靶点基因，三者取并集，同时去除重复值，总共筛选出靶基因4301个。将大黄活性成分靶点与DKD相关靶点基因取交集后得到大黄治疗DKD的潜在靶点共41个，并绘制出韦恩图，如图1。
Figure 1. Venn diagram
图1. 韦恩图
3.2. 中药调控网络
最后构建出“药物–活性成分–疾病–靶点”网络图，该网络图一共有1个大黄药物节点，7个活性成分节点，41个靶点节点和节点之间有77条边。其中黄色表示中药大黄，橙色表示大黄活性成分，红色代表靶点。如图2。
Figure 2. Herbal medicine-regulated network map
图2. 中药调控网络图
3.3. 蛋白互作网络图和PPI的筛选
运用STRING网站和依据大黄活性成分与DKD靶基因交集得到蛋白互作网络图如图3。并根据蛋白互作的打分，经过3次筛选分数大于中位数的基因，得到核心基因PPI，并绘制出PPI图，如图4。其中，节点越大，颜色越深表示对应的基因degree值越大，核心靶点分别为肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤蛋白p53 (TP53)、热休克蛋白90α (HSP90AA1)、胱天蛋白酶3 (CASP3)、B细胞淋巴瘤-2 (BCL2)、环加氧酶2 (PTGS2)、雌激素受体1 (ESR1)、MYC原癌基因(MYC)。
Figure 3. Protein-protein interaction network map
图3. 蛋白互作网络图
Figure 4. PPI map
图4. PPI图
3.4. GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
对41个潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析主要包括三个部分，分别是BP (生物学过程)、CC (细胞组分)、MF (分子功能)。分析后分别得到BP一共有1527条，CC18条，MF130条，再对富集程度前10的功能进行可视化处理，最终得到柱状图图5。根据图5显示，交集基因主要是外源性物质的反应，对环境刺激、非生物刺激的反应等生物学过程有关；与细胞器外膜，外膜，膜阀，膜微结构域等细胞组分有关；与DNA结合转录因子结合，泛素蛋白连接酶结合，RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合等分子功能有关。
Figure 5. GO enrichment analysis
图5. GO功能富集分析
KEGG通路分析共得到118条通路，选取P值分数前20的通路绘制气泡图，最终得到气泡图图6。其中，气泡颜色越深，q值越大；则气泡越大，该通路包含的基因数量也就越多。根据图6，可以得到交集基因涉及p53信号通路，乙型肝炎病毒感染，小细胞肺癌感染，脂质与动脉粥样硬化，人巨细胞病毒感染，人类免疫缺陷病毒1感染，铂类药物耐药，结直肠癌，EB病毒感染，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，化学致癌作用–受体激活，凋亡–多物种，丙型肝炎，甲型流感，甲状腺癌，结核病，单纯疱疹病毒1型感染，卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染，凋亡，雌激素信号通路，麻疹病毒，癌症中的蛋白聚糖，乳腺癌，IL-17信号通路，内分泌治疗耐药，细胞周期，军团菌病，子宫内膜癌，前列腺癌，弓形虫病等通路。
Figure 6. KEGG enrichment analysis
图6. KEGG通路富集分析
3.5. 大黄核心成分与DKD靶基因的分子对接
根据筛选出的核心基因的蛋白受体与大黄的小分子配体完成分子对接，出现多个小分子配体时选取结合能最高的小分子，并对结果进行可视化，结果如图7。由图所示，分子间存在很强的作用力，包括静电相互作用，范德华力，氢键，疏水作用力等。一般认为亲和力值 < −6 kcal/mol即认为分子间具有较强的亲和力，核心基因除了PTGS2与其小分子配体的亲和力值 > −6 kca/mol外，其他核心基因的亲和力值均<−6 kca/mol，且CASP3为最大值−7.07 kca/mol，分子间结合能力皆较强。
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
Figure 7. Molecular docking results. (a) HSP90A-Rhein interaction, (b) BCL-2-β-Sitosterol interaction, (c) TNF-Aloe-emodin Interaction, (d) ESR1-Catechin interaction, (e) TP53-Aloe-emodin Interaction, (f) MYC-Aloe-emodin interaction, (g) CASP3-β-Sitosterol interaction
图7. 分子对接分析结果。(a) HSP900A-大黄酸，(b) BCL-2-β-谷甾醇，(c) TNF-芦荟大黄素，(d) ESR1-儿茶素，(e) TP53-芦荟大黄素，(f) MYC-芦荟大黄素，(g) CASP3-β-谷甾醇
4. 讨论
根据研究结果显示，大黄共有4个治疗DKD的活性成分，分别为大黄酸、β-谷甾醇、芦荟大黄素、儿茶素。已有实验提示[3]，大黄酸可以明显抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞肥大；还可以通过抑制GLUT转染系膜细胞对糖类物质的摄入，从而降低细胞对ECM合成。大黄酸通过上述作用减轻高糖带来的毒性，实现对肾功能的保护。植物甾醇类当中的一种主要成分β-谷甾醇，已被较多的运用在医药行业中。有研究预测，β-谷甾醇可以逆转高糖损伤细胞活力，减缓细胞死亡[4]。除此之外，β-谷甾醇还具有以下作用，如降低ROS和丙二醛(MDA)水平，增加抗氧化酶的活性，来抑制葡萄糖诱发的氧化应激：同时β-谷甾醇还能提高脂多糖诱导的J774A1巨噬细胞的IL-10活性，从而降低趋化因子和促炎因子的活性，通过以上所叙述的过程调节体内的免疫过程从而发挥抗炎作用。β-谷甾醇除具有抗炎作用外，还抑制了葡萄糖诱导的TLR4/NF-кB信号传导的激活，通过使用TAK-242灭活TLR4增强β-谷甾醇对HG介导的氧化应激和炎症的保护作用[5]。
芦荟大黄素作为蒽醌类化合物，已被广泛地运用在肾脏的保护中。在糖尿病肾病发展演变过程当中，肾小管间质纤维化是发展至终末期肾功能衰竭的主要病理基础表现，根据体内外实验提示[6]，芦荟大黄素不仅可以降低小鼠纤维化基因TGF-β1和纤连蛋白的mRNA的表达和抑制体内PI3K/Akt/mTOR通路，还可以抑制TGF-β诱导的HK-2细胞纤维化。通过以上作用抑制了肾纤维化，进而来保护肾脏。儿茶素是酚类活性物质，儿茶素可能通过抑制TGF-β来发挥抗肾脏纤维化作用[7]。同时，儿茶素还可以改善血脂状况和肾脏毛细血管网，调节Bcl-2蛋白表达，降低caspase-3和Bax的水平，从而预防肾小球硬化，抑制肾脏细胞凋亡[8]。
根据研究结果，大黄对DKD治疗，所涉及的靶点包括HSP900A、BCL-2、TNF、ESR1、TP53、MYC、CASP3。在这些靶点当中HSP900A在肾内皮功能当中发挥着重要的作用，HSP900A与eNOS解离，随后使Caveolin-1与eNOS结合，以此来抑制eNOS酶的活性，最终导致内皮细胞出现了功能障碍[9]。已有研究预测，BCL-2可能通过丝裂原活化蛋白激酶的信号传导发生积累，下调刺激NF-κB通路，引起细胞凋亡，从而介导炎症刺激肾病的进展[10]。根据现有研究提示，TNF是一个治疗糖尿病肾病的重要靶点，在糖尿病患者尿内含量明显变高，它能与跨膜TNF-α结合，该进程有助于通过细胞间接触方式以及细胞类型特异性方式发挥功能，调节局部炎症，从而调节糖尿病肾病[11]。ESR1作为Slc24/GLUT4表达的增强子，能直接或间接诱导Slc2a4/GLUT4的表达调节，使其表达提高，提高胰岛素敏感性，从而降低血糖，治疗DKD [12]，这一发现为理解大黄“多靶点，多通路”治疗DKD提供新的思路，表明其具有之前被忽视的潜在价值。在受损伤的肾上皮细胞中，TP53被激活，而TP53是一种肿瘤抑制因子，介导受损肾脏中的TGF-β1信号传导，其水平显著增加，同时提升磷酸化，进而引起肾小管间质纤维化的发生于发展[13]，MYC是一种原癌基因，其过度表达会诱导肾成纤维细胞活化，导致肾纤维化和肾脏损伤[14]，这揭示了大黄治疗DKD以往被忽视的重要维度，与传统上关注大黄抗炎，抗氧化的作用完全不同，这更显示了大黄治疗DKD多靶点的独特优势。CASP3是调控细胞凋亡的重要靶点，研究提示[15]，其活性、蛋白和mRNA随时间的变化与肾脏细胞凋亡、炎症、纤维化的变化一致，进而引起肾小管细胞凋亡和肾小管萎缩。
根据GO功能显示，大黄的治疗作用实现是通过精确调控，如调控DNA结合转录因子结合，泛素蛋白连接酶结合等分子功能，调节细胞对外源性物质、非生物刺激和环境刺激的反应等生物学过程。观察KEGG通路富集结果得到，大黄中的活性成分有可能借助一些信号通路对DKD进行治疗，例如乙型肝炎感染、脂质和动脉粥样硬化，人巨细胞病毒感染等。乙型肝炎病毒感染通路中，涉及的NF-κB [16]、JAK-STAT [17]等炎症信号通路会与DKD发病机制重叠，IL-6、TNF-α等炎症细胞因子的增加和JAK2、STAT3等炎症信号分子的传导，会诱导肾小球出现硬化和肾小管间质纤维化的病理特征[18]。我们据此推测大黄活性成分在乙型肝炎病毒感染通路中起到抑制炎症信号传导的抗炎作用。脂质与动脉粥样硬化与DKD关联紧密，后者血脂、血糖等指标异常会导致低密度脂蛋白(LDL)含量升高、晚期糖基化终产物(AGE)形成，并激活血管壁各种促炎信号，诱导动脉粥样硬化的同时激活肾脏炎症反应和氧化应激[19]，另外大量氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的异常沉积会损伤足细胞[20]，加剧肾小球硬化和间质纤维化。大黄可能通过调节该通路的脂代谢来抑制肾脏的纤维化。
根据分子对接结果，大黄的核心活性成分与DKD靶点结合良好，可由氢键，分子间作用力结合发挥作用，说明他们在治疗DKD的过程中起到关键，很重要的效力。
综上所述，我们借助本次研究，可以初步推测出大黄治疗DKD可能通过大黄酸、β-谷甾醇、芦荟大黄素、儿茶素等活性成分，作用于HSP900A、BCL-2、TNF、ESR1、TP53、MYC、CASP3等靶点和多条信号通路来发挥作用，揭示大黄治疗DKD是多成分，多靶点，多通路的生理过程，在DKD的治疗中有巨大的潜力。
本研究为大黄治疗DKD提供一定的理论依据和猜测，但研究存在若干局限性，网络药理学只依据公共数据库的数据，可能存在数据偏倚影响实验结果。分子对接结果仅是计算机软件模拟的结果，缺乏具体实验验证，可能与实际情况并不相同。未来还需要通过进一步实验验证关键靶点和通路的作用。
基金项目
本项目受江苏大学大学生创新训练计划项目(S202510299182)资助。
NOTES
*通讯作者。