摘要: 目的：探讨龙胆苦苷(Gentiopicroside, GPS)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Human keloid fibroblasts, HKF)增殖、迁移、细胞外基质(ECM)相关蛋白表达以及TGF-
β1/Smad通路的影响。方法：利用成品HKF进行培养。将HKF分为空白对照组、DMSO组、龙胆苦苷浓度组(分别为2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5 μg/mL)，每组培养24 h后，采用MTT实验检测HKF增殖情况。利用细胞划痕实验检测20 μg/mL龙胆苦苷在不同时间段下(0 h、24 h、48 h)对HKF迁移能力的影响。根据MTT的结果，将实验分为空白对照组，20 μg/mL龙胆苦苷组，通过Western blot实验分别检测Collagen I、Collagen III、纤连蛋白(FN)及相关蛋白
α-平滑肌肌动蛋白(
α-smooth muscle actin,
α-SMA)的表达情况。而后再将其分为对照组(HKF)、模型组(HKF + TGF-
β1)、实验组(HKF + TGF-
β1 + GPS)。对照组不加任何处理因素，用完全培养基培养细胞；模型组：向完全培养基内加10 ng/ml TGF-
β1培养细胞；实验组向GPS处理后的细胞加入10 ng/mlTGF-
β1培养细胞，培养24 h，通过Western blot实验探索龙胆苦苷对TGF-
β1/Smad信号通路蛋白的表达情况。结果：根据MTT实验法得出龙胆苦苷处理HKF 24 h后，随着浓度的增加，细胞存活率呈现下降趋势，在药物浓度为20 μg/mL作用24 h后，抑制HKF效果最为显著。细胞划痕实验显示，与空白对照组相比，20 μg/mL龙胆苦苷组HKF迁移能力受到显著抑制(P < 0.01)；Western blot显示龙胆苦苷可下调Collagen I、Collagen III、FN1、
α-SMA蛋白表达，并且可降低TGF-
β1/Smad通路中Smad2及Smad3磷酸化蛋白表达。结论：龙胆苦苷可能通过TGF-
β1/Smad信号通路，抑制HKF增殖、迁移及细胞外基质相关蛋白的表达。
Abstract: Objective: To investigate the effects of gentiopicroside (GPS) on the proliferation, migration, expression of extracellular matrix (ECM)-related proteins, and TGF-β1/Smad signaling pathway in human keloid fibroblasts (HKF). Methods: Commercially available HKF were cultured and divided into blank control group, DMSO group, and GPS concentration groups (2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5 μg/mL). After 24 h of culture, MTT assay was used to detect HKF proliferation. Cell scratch assay was performed to assess the effect of 20 μg/mL GPS on HKF migration ability at different time points (0 h, 24 h, 48 h). Based on the MTT results, the experiment was further divided into blank control group and 20 μg/mL GPS group; Western blot assay was used to detect the expression levels of Collagen I, Collagen III, fibronectin (FN), and α-smooth muscle actin (α-SMA). Subsequently, cells were divided into control group (HKF), model group (HKF + TGF-β1), and experimental group (HKF + TGF-β1 + GPS). The control group was cultured in complete medium without any treatment; the model group was cultured in complete medium with 10 ng/mL TGF-β1; the experimental group was pretreated with GPS followed by 10 ng/mL TGF-β1 for 24 h. Western blot assay was used to explore the effect of GPS on protein expression in the TGF-β1/Smad signaling pathway. Results: MTT assay showed that after 24 h of GPS treatment, HKF viability exhibited a decreasing trend with increasing GPS concentration, and the inhibitory effect on HKF was most significant at 20 μg/mL. Cell scratch assay revealed that compared with the blank control group, the migration ability of HKF in the 20 μg/mL GPS group was significantly inhibited (P < 0.01). Western blot demonstrated that GPS downregulated the protein expression of Collagen I, Collagen III, FN, and α-SMA, and reduced the phosphorylated protein expression of Smad2 and Smad3 in the TGF-β1/Smad pathway. Conclusion: GPS may inhibit HKF proliferation, migration, and the expression of ECM-related proteins through the TGF-β1/Smad signaling pathway.
1. 引言
疤痕疙瘩主要表现为真皮层纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积，且具有超出原始损伤区的浸润性生长特点，作为一种病理性纤维化疾病，近年来的研究表明，通过激活Smad2/3信号通路，促进成纤维细胞分化，形成I型胶原，在瘢痕疙瘩病变的发展过程中起着至关重要的调节作用，是TGF-β1的重要转化生长因子，也是TGF-Nβ1的主要作用之一，是TNF-β2的主要作用，也是TNF-β3的主要作用[1] [2]。此外，作为先天免疫反应的关键效应分子，NLRP3炎症小体通过caspase-1依赖的途径，促使IL-1β前体裂解为具有活性的形态，进而诱发局部慢性炎症微环境的产生，这种炎症–纤维化的级联反应被视作促进瘢痕疙瘩发展的重要病理机制，如龙胆草、Gentiana、GPS，是天然的环烯醚酰胺类化合物，从龙胆草等龙胆科植物中提取，是典型的代表苦苷类活性成分[3]。GPS是天然抗氧化剂，具有多种功能，对炎症、癌症、纤维化等具有有效的抵抗作用[4]。目前，GPS在人皮肤瘢痕疙瘩的治疗中，已经得到广泛的应用。因此，为了更好地了解GPS对人皮肤疤痕疙瘩的形态和作用的调控，我们将利用这一技术，进行一系列体外试验，从而发现更多有益的治疗手段。
2. 材料与方法
2.1. 主要试剂与仪器
我们的实验室使用了多种不同的仪器和药物，包括龙胆苦苷(GPS，MedChemExpress公司)、HKF，上海富衡有限公司、MTT和ECL超敏化学发光试剂盒，以及TRIzol RNA (美国赛默飞世尔科技公司)、α-平滑肌肌动蛋白、Collagen I、Collagen III、FN1、p-Smad2、NLRP3、Smad3、p-Smad3、TGF-β1和ASC。这些实验用品都是从新贝有限公司采集的，并使用了美国罗氏诊断公司的荧光定量PCR仪和美国赛默飞世尔科技公司的CO2进行实验。
2.2. 实验方法
2.2.1. MTT法研究龙胆苦苷对HKF的增殖作用
MTT法研究龙胆苦苷对HKF的增殖作用，为此，我们从96孔细胞培养板上收集了HKF，其中包括2.5、5、7.5、10、15、15、20、22.5 μg/mL的细胞悬液，以此来评估龙胆苦苷的效果。此外，我们还将其与空白对照组、DMSO组以及龙胆苦苷处理组进行比较，以确定其最佳效果。在37℃的温室环境下，先把培养皿放在5% CO2的环境下，经过24小时的孵化，再在每个孔隙内添加10μL MTT，并在室内保持黑暗状态1 h。最终，使用酶标仪在450 nm的波长范围内对所有孔隙的吸收率(OD值)进行监控。细胞活力(%) = [实验组OD值 − 空白组OD值]/[对照组OD值 − 空白组OD值] × 10%。
2.2.2. 细胞划痕实验检测龙胆苦苷对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响
细胞划痕实验检测龙胆苦苷对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响将HKF按2 × 105个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板，每组设2个复孔。待细胞生长至近融合状态(约90%~100%汇合)时进行划痕操作：吸去孔内旧培养基，用无菌200 μL枪头尖端，沿直尺垂直于孔板底部在每孔中央划一直线划痕(确保枪头垂直，防止倾斜)，随后以无菌PBS轻柔洗涤孔板2次，以清除划痕产生的脱落细胞及碎片。根据MTT实验的结果，我们添加了一种含有20 μg/mL龙胆苦苷的处理液。此外，我们还设立了一个空白对照组，其中没有药物，并且添加了同样量的无血清培养基。将培养板放回5% CO2、37℃培养箱中继续培养。使用倒置显微镜，在划痕发生后的0 h (即刻)、24 h和48 h，以×40或×100的放大倍数进行拍摄，以记录下不同时间段的细节。
2.2.3. Western blot法龙胆苦苷对HKF中Collagen I、Collagen III、FN及α-SMA表达的影响
Western blot法检测龙胆苦苷对HKF中Collagen I、Collagen III、FN及α-SMA表达的影响将HKF细胞接种于6孔板，每孔接种细胞数约2 × 105个。MTT实验的研究表明，龙胆苦苷的含量分别被分成两类：0 (空白对照)和20 μmol/L (龙胆苦苷)。24小时之后，我们从样本中抽样，分离出蛋白质，然后使用BCA方法检测，接着使用SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白质分离出来，最终将其置于4℃环境中，然后将其放置于一次性培养皿中，第二天使用ECL化学发射仪观察，最终使用Image J算子来计算出蛋白质的分布情况。
2.2.4. 通过Western blot技术检测龙胆苦苷对HKF细胞中TGF-β1/Smad信号通路关键蛋白表达的影响
实验时，HKF细胞接种于6孔板中，每孔细胞数量约2 × 105个，待细胞融合度达到60%~70%时，随机分为3个处理组：对照组(仅HKF细胞，完全培养基培养，无额外处理)、模型组(HKF细胞 + 10 ng/ml TGF-β1，完全培养基培养)及实验组(HKF细胞经GPS预处理后，加入10 ng/ml TGF-β1继续培养)。在24小时的实验期间，我们从每个细胞中抽样出一种总蛋白，并按照1.2.3节的步骤，通过SDS-PAGE电泳、转移、封装和特异性抗原受体培养来评估p-Smad2、p-Smad3、ASC和NLRP3的表达量。
2.3. 统计学方法
使用GraphPad Prism 9.5软件对三组统计学分析结果进行了深入的研究，其中计量资料的平方根和标准差(x ± s)被作为衡量指标，两组之间的差异则通过t检验来确定，而多组之间的差异则通过单因素方差分析来确定。通过GraPhpad Prism 9.0.0创建的数据可视化图表，其中的P < 0.05值小于等于P < 0.05，表明其存在显著的统计学变量。
3. 结果
3.1. 采用MTT法检测龙胆苦苷HKF增殖的影响结果
结果显示，与空白对照组相比，龙胆苦苷作用24 h后，2.5~20 μg/mL各浓度均能显著抑制KFs增殖(P < 0.05)。当龙胆苦苷浓度为2.5μg/mL时，细胞活力开始呈现浓度依赖性降低趋势，差异具有统计学意义(t = 3.572、5.099、6.017、8.621、6.403、18.97、19.40、16.63，均P < 0.05)。然而，当龙胆苦苷浓度22.5 μg/mL时，药物毒性增加，细胞活力明显降低(t = 0.049, P > 0.05)。因此，后续实验选用20 μg/mL龙胆苦苷进行观察(图1)。
Figure 1. The effect of different concentrations of GPS on HKF proliferation after 24-hour treatment
图1. 不同浓度GPS作用24 h后对HKF增殖的影响
3.2. 采用细胞划痕实验检测20 μg/mL龙胆苦苷对KFs迁移能力的影响结果。
结果显示：培养24 h后，与空白对照组相比，20 μg/mL龙胆苦苷组细胞划痕间距略宽；培养48 h后，空白对照组划痕间距明显变窄，而20 μg/mL龙胆苦苷划痕间距仍较明显，虽较24 h时有一定愈合倾向，但与同时间点空白对照组相比，愈合速度显著减慢。且差异有统计学意义(24 h: t = 15.13, P < 0.01; 48 h: t = 22.41, P < 0.05)。由结果可知上述结果表明，龙胆苦苷可显著抑制HKF的迁移能力(图2)。
Figure 2. The effect on HKF migration before and after GPS treatment
图2. GPS处理前后对HKF迁移的影响
3.3. 采用Western Blot法检测不同浓度龙胆苦苷对HKF中细胞外基质(ECM)相关蛋白
Collagen I、Collagen III及纤维连接蛋白(FN)表达的影响结果
结果显示：差异有统计学意义(tFN1 = 7.737, P < 0.01; tα-SMA = 11.81, P < 0.01; tCOL I =4.539, P < 0.05；tCOL III = 5.182, P < 0.01)。Western blot结果显示：与对照组相比，实验组FN1、α⁃SMA、COL I、COL III蛋白表达量显著降低(图3)。
Figure 3. The effect on HKF migration before and after GPS treatment
图3. GPS对HKF细胞外基质形成相关蛋白表达水平的影响
3.4. 通过Western Blot技术检测龙胆苦苷对HKF细胞中TGF-β1/Smad信号通路关键蛋白表达的影响结果
经Western blot检测，模型组HKF中的NLRP3、ASC、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3蛋白的表达量明显高于对照组；而TGF-β1 + GPS组的HKF蛋白的表达量则有所下降。差异有统计学意义(FASC = 11.66, P < 0.01; FNLRP3 = 7.950, P < 0.01; FSmsd2 = 7.982, P < 0.01; FSmad3 = 6.948, P < 0.01; Fp-smad2 = 6.001, P < 0.01; Fp-smad3 = 7.026, P < 0.01) (图4)。
Figure 4. The effect of GPS on the expression levels of extracellular matrix formation-related proteins in HKF
图4. GPS对HKF内TGF-β1诱导的相关蛋白表达水平的影响
4. 讨论
当前，瘢痕疙瘩的临床治疗手段涵盖手术、药物干预、放射治疗、激光疗法及压迫治疗等，临床实践中多采用联合治疗方案，然而其复发率居高不下，仍是临床治疗领域的一大难题[5]。瘢痕疙瘩的发生发展以HKF的异常激活为关键驱动因素，该细胞呈现肿瘤样生物学特性，具体表现为不受调控的增殖活性、侵袭性迁移能力及凋亡抵抗现象[6]。与普通瘢痕不同，瘢痕疙瘩被部分学者称为“良性真皮肿瘤”，TGF-β1/Smad作为参与瘢痕疙瘩发病机制中的经典信号通路，在瘢痕和纤维化中都发挥了关键作用[7] [8]。本实验结果显示，龙胆苦苷可呈浓度依赖性降低HKF的存活率，并抑制其划痕愈合能力；其通过阻断HKF的过度增殖与迁移过程，从而限制瘢痕疙瘩突破原始损伤边界的侵袭性生长。TGF-β和/Smad信号通路被认为是调节瘢痕疙瘩纤维化的重要机制，前者的作用更为显著，可以将Smad2/3蛋白的磷酸化反应引发，从而促使纤维化相关的基因被正确的调控[9]。经过这项研究，我们发现龙胆苦苷对于阻止疤痕形成的纤维细胞生长起到了重要作用，这很可能是由于它对TGF-β1/Smad信号传导的调节。细胞外基质(ECM)的过度沉积是瘢痕疙瘩的典型病理特征，主要与I型胶原(Collagen I)、III型胶原(Collagen III)、纤维连接蛋白1 (FN1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的异常合成与降解失衡相关。本实验中，龙胆苦苷被证实可降低瘢痕疙瘩成纤维细胞中Collagen I、III的表达水平，并抑制α-SMA阳性肌成纤维细胞的活化，进而减轻瘢痕疙瘩的纤维化程度。根据最新的研究结果，龙胆苦苷能够有效地降低TGF-β1的表达，从而有效地阻止Smad2/3的磷酸化和核转位[10]；此外，它还能够有效地阻止TβRI/II受体和Smad蛋白之间的交互，从而降低Collagen I的基因表达。
炎性反应可以被视为促使瘢痕形成的关键机理，而NLRP3炎性细胞的活跃可以促使促炎物质(如IL-1β和IL-18)的产生，从而增强HKF和ECM的沉积[11]。龙胆苦苷可以显著降低NLRP3炎性细胞的表达，从而缓解痛风性关节炎和溃疡性结肠炎的炎症状况[12]-[14]。本实验结果显示，龙胆苦苷可降低瘢痕疙瘩模型中NLRP3、ASC蛋白的表达水平，提示其可能通过抑制NLRP3炎症小体介导的“炎症–纤维化”正反馈环路，实现抗炎与抗纤维化的协同作用。这一效应可能与TGF-β/Smad通路的抑制存在交叉调控：NLRP3炎症小体的活化可上调TGF-β1的表达，而TGF-β1也能反式激活NLRP3 [15]，因此龙胆苦苷对二者的同步抑制可能更有效地阻断瘢痕疙瘩的病理进展。
本研究证实，龙胆苦苷可通过抑制KFs的增殖与迁移、减少ECM沉积、调控TGF-β/Smad通路及NLRP3炎症小体，发挥抗瘢痕疙瘩作用，为临床治疗提供了新的天然药物候选。与传统药物相比，龙胆苦苷来源广泛、毒性较低，且具有多靶点协同作用的优势，有望解决单一靶点治疗易产生耐药性的问题[16]。不过，本研究仍存在一定局限性：瘢痕疙瘩作为人类特有的病理性瘢痕，体外培养的成纤维细胞与体内微环境中的细胞在生物学行为上可能存在差异，这主要与其所处的复杂生物学微环境(如细胞外基质、局部代谢状态等)及细胞因子网络调控密切相关。因此，龙胆苦苷在瘢痕疙瘩发病机制中的具体调控作用及分子机制，仍需后续更深入、系统的实验研究来进一步阐明。下一步研究可通过动物模型(如兔耳瘢痕模型、裸鼠人瘢痕疙瘩移植模型)验证其体内疗效。
基金项目
安徽医科大学临床科学基金(编号：2021xkj170)《IGF1通过抑制Notch信号通路介导血管瘤干细胞成脂分化的研究》。
NOTES
*通讯作者。