1. 引言
辨证论治乃中医之精髓，主要以异病同治和同病异治的治疗原则。“异病同治”是指对于不同疾病可以采用同一种治疗方法救治[1]，其理论基础即“证同治亦同，证异治亦异”。儿童抽动障碍(Tic Disorder, TD)归属于中医“慢惊风”“瘛疭”等范畴，其病机肝气失调，气机不利有关，临床以身体一个或多个部位出现不自主、快速、重复的肌肉运动或发声动作等症状为主要表现[2]。儿童过敏性紫癜(Henoch-Schmleipurpura, HSP)归属于中医学“血证”的范畴，其病机阳明湿热蕴积，又外感风热毒邪，热迫血行，损伤脉络，血不归经所致有关，临床以非血小板减少性的皮肤紫癜、关节不适或关节炎等症状为主[3]。中医认为TD与HSP拥有的共同病机系阳明积热，故两病可以应用“异病同治”，均可以泻黄散治疗。泻黄散，载于钱乙所著《小儿药证直诀》，由防风、栀子、藿香、石膏、甘草组成，具有泻脾胃伏火的功效。根据现有文献，不少医家有过用泻黄散治疗TD与HSP的验案举隅，但其作用机制尚未有具体阐述。本文基于网络药理学与分子对接法探讨泻黄散“异病同治”TD和HSP的共性作用机制。
2. 资料与方法
2.1. 泻黄散主要活性成分及作用靶点的筛选
通过TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)对防风、栀子、藿香、甘草的活性成分进行检索，将筛选条件设置为：口服生物利用度(OB) ≥ 30%、类药性(DL) ≥ 0.18，再通过TCMSP、PubChem
(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)筛选出主要活性成分对应的靶点蛋白，并使用UniProt (https://www.uniprot.org/)将结果转化为统一基因名称。
2.2. 疾病靶点的筛选
以“Tic Disorder”和“Allergic Purpura”(由于未能通过Henoch-Schmlei purpura检索到靶点，故将过敏性紫癜的检索词换为Allergic Purpura)为检索词，通过Gene Cards (https://www.genecards.org/)、OMIM (https://www.omim.org/)、TTD-Therapeutic Target Database (https://db.idrblab.net/ttd/)数据库获取疾病的靶点，去重后再通过Uni Prot数据库将靶点名称标准化。
2.3. “药物–活性成分–共有靶点–疾病”网络构建
运用微生信在线作图网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)将泻黄散主要活性成分作用靶点、TD疾病靶点、HSP疾病靶点取交集。运用Cytoscape3.10.3软件进行“药物–活性成分–共有靶点–疾病”的网络构建，并使用Network Analyzer插件、CytoNCA插件进行网络拓扑分析，计算其度值(Degree)、介度中心性(Betweenness Centrality)、接近中心性(Closeness Centrality)，以度值排名前10位的活性成分作为核心活性成分。
2.4. 蛋白相互作用(PPI)网络构建
将共有靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络模型，生物种类选为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值medium confidence设定为>0.40，同时显示设置隐藏游离点，其他参数设置为默认值，得到PPI网络图；使用Cytoscape 3.10.3软件中的CytoNCA插件对PPI网络数据进行网络拓扑学分析，并筛选出度值排名前15的靶点作为核心靶点。
2.5. GO与KEGG通路富集分析
通过DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对共有靶点进行GO与KEGG通路富集分析。运用微生信在线作图网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)，将GO功能富集结果中生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)的前10位绘制成条形图，将KEGG富集结果中前20位绘制成气泡图。
2.6. 分子对接
对Cytoscape中各化合物按度值大小排序，选取前5位核心活性成分与前5位核心靶点进行分子对接。通过PubChem数据库获取核心活性成分3D结构的sdf格式文件，通过PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获取核心靶点2D结构的mol2格式文件；利用Pymol-2.1.0软件对核心靶点进行去水、去小分子配体等处理，利用AutoDock Tools-1.5.6软件进行加氢、电荷处理，并保存为pdbqt格式文件。以核心靶点为受体，以核心活性成分为配体，利用AutoDockVina2.0软件将两者进行分子对接，统计各组的结合能，并通过PyMOL软件(https://pymol.org/2/)将结果可视化处理。
3. 结果
3.1. 泻黄散主要活性成分及作用靶点
防风活性成分18种，栀子活性成分15种，藿香活性成分11种，甘草活性成分92种，对应靶点分别为984个、839个、575个、5210个。去重后获得泻黄散活性成分共129个，作用靶点579个。由于无法从TCMSP中检索到石膏，且查阅文献得知石膏含95%以上含水硫酸钙和多种无机元素，故未纳入分析[4] [5]。
3.2. 疾病靶点的筛选结果
从Gene Cards数据库获取TD靶点840个、HSP靶点1129个，OMIM数据库TD靶点617个、HSP靶点93个，TTD数据库TD靶点5个、HSP靶点0个。
3.3. “药物–活性成分–共有靶点–疾病”网络构建
将药物与两疾病靶点取交集，获取共有靶点48个，如图1。
Figure 1. “Drug-disease” Venn diagram
图1. “药物–疾病”韦恩图
将编号药物活性成分与48个共有靶点导入Cytoscape 3.10.3软件，构建“药物–活性成分–共有靶点–疾病”网络，见图2。图中菱形为药物–疾病交集靶点，且图中靶点的圆圈越大，表示度值越大；蓝色圆形为防风成分，紫色圆形为石膏成分，黄色圆形为藿香成分，橘色圆形为栀子成分，红色圆形为甘草成分，绿色三角形A为防风和栀子的共有成分，绿色方形B为防风和甘草的共有成分，绿色六边形C为栀子和甘草的共有成分，绿色八边形D为栀子、藿香、甘草的共有成分。通过插件进行网络拓扑分析，得出排名前10位的核心活性成分，为槲皮素等，见表1。
Figure 2. “Drug-active ingredient-common target-disease” network
图2. “药物–活性成分–共有靶点–疾病”网络
Table 1. The key active components of Xiehuang San in the treatment of Tourette’s Disorder (TD) and Henoch-Schönlein Purpura (HSP)
表1. 泻黄散治疗TD和HSP的关键活性成分
活性成分 |
Degree 度值 |
Betweenness Centrality 介度中心值 |
Closeness Centrality 接近中心值 |
槲皮素 |
21 |
0.007 294 054 |
0.440 860 215 |
山奈酚 |
18 |
0.006 887 569 |
0.443 243 243 |
甘草吡喃香豆素 |
13 |
0.010 892 604 |
0.453 038 674 |
欧前胡素 |
12 |
0.002 849 114 |
0.333 333 333 |
1-茚醇 |
12 |
0.002 308 31 |
0.343 096 234 |
谷甾醇 |
12 |
0.005 264 753 |
0.433 862 434 |
甘草异黄烷酮 |
12 |
0.009 309 895 |
0.438 502 674 |
3’-羟基-4’-O-甲基光甘草定 |
12 |
0.010 472 895 |
0.450 549 451 |
3’-甲氧基光甘草定 |
12 |
0.009 942 316 |
0.445 652 174 |
7-乙酰氧基-2-甲基异黄酮 |
11 |
0.010 619 571 |
0.445 652 174 |
3.4. PPI网络结果
通过STRING数据库构建的PPI网络结果见图3，共有48个节点，400条边，平均节点度为16.7。通过Cytoscape 3.10.3软件进行拓扑分析并将PPI网络进一步可视化，见图4，图中靶点圆圈越大、颜色越深，则度值越大；线条越粗，则靶点作用越强。结果显示蛋白激酶B等靶点可能是酸枣仁汤治疗AD和SD的重要靶点，见表2。
Figure 3. PPI (protein-protein interaction) network
图3. PPI网络
Figure 4. Visualization of PPI network using Cytoscape
图4. PPI网络Cytoscape可视化
Table 2. Topological analysis of the top 15 targets in the PPI network of common targets for Xiehuang San in the treatment of TD and HSP
表2. 泻黄散治疗TD和HSP的共有靶点PPI网络前15位靶点拓扑分析
靶点名称 |
度值 |
介度中心性 |
接近中心性 |
特征向量中心性 |
局部边连通性 |
蛋白激酶B |
37 |
0.096 138 477 |
0.836 363 636 |
0.243 143 07 |
16.810 81 |
信号转导因子和转录激活因子3 |
35 |
0.059 227 733 |
0.807 017 544 |
0.242 580 43 |
17.657 143 |
表皮生长因子受体 |
35 |
0.077 938 521 |
0.807 017 544 |
0.236 715 5 |
16.971 428 |
肿瘤坏死因子 |
35 |
0.075 430 482 |
0.807 017 544 |
0.232 164 22 |
16.228 57 |
雌激素受体1 |
34 |
0.048 027 36 |
0.793 103 448 |
0.238 508 92 |
17.647 058 |
雷帕霉素靶蛋白 |
29 |
0.020 617 707 |
0.730 158 73 |
0.216 863 77 |
17.103 449 |
B细胞κ轻肽基因增强子核因子1 |
28 |
0.018 966 911 |
0.718 75 |
0.211 540 6 |
16.928 572 |
过氧化物酶体增殖激活受体γ |
28 |
0.024 814 285 |
0.718 75 |
0.209 512 23 |
16.5 |
转化生长因子β1 |
27 |
0.015 354 736 |
0.707 692 308 |
0.208 758 28 |
17.185 184 |
B型RAF激酶 |
24 |
0.008 107 93 |
0.676 470 588 |
0.194 491 95 |
17 |
干细胞因子受体 |
22 |
0.010 079 56 |
0.647 887 324 |
0.173 230 17 |
14.363 636 |
端粒酶逆转录酶 |
22 |
0.009 140 058 |
0.647 887 324 |
0.178 920 79 |
15.636 364 |
蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11 |
22 |
0.010 286 385 |
0.647 887 324 |
0.173 361 15 |
14.545 455 |
共济失调毛细血管扩张症突变基因 |
21 |
0.006 479 734 |
0.630 136 986 |
0.174 795 37 |
15.809 524 |
趋化因子C-X-C基元受体4 |
21 |
0.016 318 958 |
0.630 136 986 |
0.160 400 73 |
12.761 905 |
3.5. GO与KEGG通路富集分析
将使用48个共有靶点输入到DAVID数据库中进行GO和KEGG富集分析，获取GO富集条目共546个，包括生物过程(BP) 437个，主要为ERK1和ERK2级联反应的正调控等；细胞组分(CC) 49个，主要为质膜等；分子功能(MF) 61个，主要为相同蛋白结合等。选择排在前10位的GO功能结果以气泡图的形式进行展示，见图5。获取KEGG富集通路共127条通路结果，主要为丝裂原活化蛋白激酶信号通路等。选择排在前10位的KEGG富集通路结果以条形图的形式进行展示，见图6。
Figure 5. GO (gene ontology) enrichment analysis
图5. GO富集分析
Figure 6. KEGG enrichment analysis
图6. KEGG富集分析
3.6. 分子对接
将Degree值最高的5个化合物作为分子对接的小分子。将PPI网络中度值较高的5个核心靶点选为分子对接的靶蛋白，利用pyrx软件内部的vina-2.0进行分子对接，统计各组结合能如下，见表3。Affinity (kcal/mol)值即受体与配体的结合能，代表两者的结合能力，结合能力越低，表明核心活性成分与核心靶点的构象越稳定，对接效果越好。使用Pymol对其进行可视化分析。结合能 < −5 kcal·mol−1表示配体与受体之间的结合活性较好[6]。选取综合效果较好的5组进行可视化，见图7。
Table 3. Binding energies (kcal·mol−1) of molecular docking between core active components and core targets of Xiehuang San in the “same treatment for different diseases” of TD and HSP
表3. 泻黄散“异病同治”TD和HSP的核心活性成分与核心靶点分子对接的结合能(kcal·mol−1)
化合物 |
靶蛋白 |
AKT1 |
STAT3 |
EGFR |
TNF |
ESR1 |
槲皮素 |
−6.3 |
−8.1 |
−8.4 |
−7.0 |
−8.4 |
山奈酚 |
−6.0 |
−7.9 |
−8.5 |
−6.9 |
−8.6 |
甘草吡喃香豆素 |
−7.1 |
−7.2 |
−9.5 |
−6.4 |
−7.1 |
欧前胡素 |
−5.8 |
−6.4 |
−8.9 |
−6.9 |
−8.9 |
1-茚醇 |
−3.9 |
−4.0 |
−5.9 |
−4.7 |
−4.9 |
(a) kaempferol_EGFR_complex
(b) licopyranocoumarin_EGFR_complex
(c) Ammidin_EGFR_complex
(d) kaempferol_ESR1_complex
(e) Ammidin_ESR1_complex
Figure 7. Molecular docking patterns of core active components and core targets of Xiehuang San in the “same treatment for different diseases” of TD and HSP
图7. 泻黄散“异病同治”TD和HSP的核心活性成分与核心靶点分子对接模式
4. 讨论
“异病同治”首见于《黄帝内经》，是在中医辨证论治的基础上延伸出来的一种法则，现多体现为以经方或名方加减治疗不同的疾病[7]。泻黄散中石膏是清阳明胃经热邪之要药，清胃中伏火而不伤津，为君药。配伍藿香、防风燥湿化痰，为臣药，君臣相佐则脾胃兼顾；其中防风还有“风能胜湿”之意。栀子通利三焦，以助君药发散伏火，为佐药。甘草调和诸药，兼能清热，为使药。全方主以清热，辅以升散，既清脾胃之火又顾护脾胃之气，共奏“泻脾胃伏火”之功效，主治脾胃伏火证。TD是学龄期儿童常见的疾病，我国的患病率可达6.1% [8]。HSP是儿童时期最常见的血管炎之一，在我国的患病率可达10~20/10万[9]，该病易反复，有30%~80%患儿会发展为紫癜性肾炎[10]。
儿童过敏性紫癜又称为IgA血管炎，该病的免疫异常可能通过“肠–脑轴”影响神经系统功能，而抽动症亦存在神经炎症假说，提示两者在免疫机制上可能存在共同通路。从中医学角度分析，这两种疾病均可因长期嗜食肥甘厚味，导致湿热内蕴，进而引发疾病。泻黄散又名泻脾散，属于钱乙所创“五脏补泻方”之一，对于TD、HSP等疾病均有较好的临床疗效[11] [12]。本文基于“异病同治”理论，借助网络药理学的系统性和多靶点整合、分子对接法的精准性和高效筛选等优势，研究了泻黄散治疗TD和HSP的分子机制。
通过“药物–活性成分–共有靶点–疾病”网络，本研究筛选出泻黄散的主要活性成分有槲皮素、山奈酚、甘草吡喃香豆素、欧前胡素和谷甾醇等。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫调节等作用，对DA神经具有保护作用，可减轻多巴胺神经损伤，从而改善TD的症状[13]。山奈酚可以通过抑制核因子κB (NF-κB)信号通路降低炎症因子表达，从而缓解神经炎症及血管内皮损伤[14]。有研究表明，甘草吡喃香豆素具有类似皮质激素的抗过敏作用，可抑制组胺释放和肥大细胞活化，减轻HSP的过敏反应，同时可能缓解TD患儿的共患病(如ADHD)的症状[15]。欧前胡素可通过降低5-羟色胺转运体(5-HTT)表达，改善焦虑和抑郁样行为，间接缓解抽动障碍的神经精神症状[16]。1-茚醇及其衍生物对肿瘤细胞株具有较好的抑制效果[17]。
通过构建PPI网络，本研究筛选出AKT1、STAT3、ESR1、EGFR和TNF等15个核心靶点。AKT1可参与纹状体多巴胺信号反应和细胞内运输，影响额叶纹状体功能，与多巴胺传导相关。AKT1激活可增强血管内皮细胞存活，减少IgA介导的血管炎损伤[18]。STAT3介导细胞因子信号传导，通过瘦素影响中脑DA神经元，从而调节运动兴奋性[19]。ESR1作为雌激素的关键受体，可减轻炎症反应。此外，雌激素可影响大脑中的单胺类和神经肽递质，也会对情绪和记忆产生持久的影响[20]。EGFR可调控细胞增殖、存活、分化和代谢，可能对炎症和免疫反应产生深远影响[21]。TNF可抑制HUVECs的凋亡和炎症因子分泌，下调细胞黏附分子表达，以炎症反应[22]。
GO和KEGG富集结果显示，成分与靶点主要通过MAPK、Rap1和FoxO等信号通路发挥作用。p38MAPK是MAPK信号通路的关键分支，有研究发现抑制p38MAPK信号可改善6-OHDA诱导的DA能神经细胞氧化应激，减少细胞凋亡[23]。MAPK/ERK信号通路的激活缺陷，可引发多聚ADP核糖聚合酶1和DNA (胞嘧啶-5)-甲基转移酶1失调，是过敏性紫癜病理机制中常见的一环[24]。Rap1可抑制TNF-α诱导的脉络膜内皮细胞中ROS的生成，进而降低脉络膜新生血管的发展。此外，Rap1可增强抗氧化酶(如SOD)的活性，从而保护血管内皮和神经元。FoxO3可通过激活SOD等抗氧化酶，可能减轻基底神经节神经元氧化损伤[25]。IgA介导的血管炎伴随自由基过量，FoxO1/3通过抑制NF-κB通路减少IL-6和TNF-α释放，缓解血管内皮炎症[26]。
综上所述，本研究通过网络药理学与分子对接技术，初步探究了泻黄散“异病同治”TD和HSP的可能活性成分及其作用机制，展现出多靶点、多途径的显著特性。可能是槲皮素、山奈酚和甘草吡喃香豆素等成分作用于AKT1、STAT3和ESR1等靶点，通过调控MAPK、Rap1和FoxO等信号通路而发挥作用。
NOTES
*通讯作者。